이 방법론은 클리어링 프로토콜의 개선과 Mesos PIM 기술의 광학 절편의 눈 기능을 결합하여 마이크로미터 해상도에서 메조 스코픽 재구성을 수행할 수 있습니다. 원래의 3차원 조직 조직을 잃지 않고 한 번의 스캔으로 대규모 심장 조직 또는 전체 마우스 심장 전체 용액을 이미지화할 수 있는 가능성을 제공합니다. 심장이 근위 대동맥에 의해 캐뉼레이션되어 티로 용액으로 세척되고 0.01 몰 PBS의 4 % 파라 폼 알데히드로 고정 된 후 클리어링 프로토콜을 시작할 준비가되었습니다.
섭씨 4도에서 0.01 몰 PBS로 15 분 동안 심장을 3 번 씻으십시오. 이 단계 후에 심장은 PBS와 0.01 % 나트륨 아 지드화물에 섭씨 4도에서 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 섭씨 4도에서 3 일 동안 15RPM의 흔들림 상태에서 20ml의 하이드로 겔 용액에서 심장을 배양하십시오.
건조기를 사용하여 실온에서 샘플을 탈가스화하고, 진공 펌프, 및 건조기를 펌프 밴드 및 질소 파이프라인 모두에 연결하는 튜브 시스템을 포함한다. 샘플을 건조기에 넣고 캡을 유지하면서 바이알을 엽니 다. 건조기를 닫고 질소 파이프 라인을 열어 튜브에서 산소를 제거하십시오.
진공 펌프를 켜서 건조기에서 산소를 10분 동안 제거합니다. 펌프를 끄고 건조기의 손잡이를 질소 파이프 라인으로여십시오. 그런 다음 질소 탭을여십시오.
압력이 대기압과 같으면 건조기를 조심스럽게 열고 바이알을 빠르게 닫으십시오. 탈기 된 하이드로 겔 용액에 심장을 섭씨 37도에서 약 3 시간 동안 그대로 두십시오. 하이드로 겔이 적절하게 중합되어 완전히 젤라틴처럼 보이면 조심스럽게 심장을 제거하고 투명 용액이있는 바이알의 클리어링 용액에 넣으십시오.
정화 절차를 가속화하기 위해 3 일에 한 번 바이알의 투명액을 교체하십시오. 심장이 완전히 정화 된 것처럼 보이면 바이알에서 꺼내어 흔들리는 상태에서 24 시간 동안 예열 된 PBS 50ml로 씻으십시오. 진탕 상태에서 24 시간 동안 하나의 X PBS T 50 밀리리터로 다시 세척하십시오.
샘플을 7일 동안 실온에서 50 RPM에서 진탕 조건에서 1 X PBS T의 3 밀리리터 중 밀 배아 아글루티닌 알렉사 플로어 633 밀리리터당 0.01 밀리그램으로 인큐베이션한다. 7일간의 인큐베이션 후, 샘플을 실온에서 50 밀리리터의 X PBS T로 24시간 동안 진탕하면서 세척하였다. 샘플을 4% PFA에서 15분 동안 배양한 다음 0.01몰 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
심장을 각각 8시간 동안 0.01몰 PBS에서 20 및 47% TDE에서 연속적으로 배양합니다. 그런 다음 마지막으로 0.01몰 PBS에서 68%TDE에서 1.46의 필요한 굴절률을 제공합니다. 외부 석영 큐벳의 약 80%를 굴절률 매체로 부드럽게 채웁니다.
내부 석영 큐벳을 동일한 굴절률 매체로 채웁니다. 샘플을 내부 큐벳 안에 담그십시오. 얇은 핀셋을 사용하여 샘플을 큐벳의 바닥으로 부드럽게 이동하고 세로 축이 큐벳의 주축과 평행하도록 심장을 배열하여 스캔하는 동안 조직을 가로지르는 여기광 경로를 최소화합니다.
두 개의 나사로 내부 큐벳 위의 맞춤형 플러그를 조심스럽게 고정합니다. 자석을 사용하여 샘플을 현미경 스테이지에 장착합니다. 수직 샘플 스테이지를 수동으로 변환하여 내부 큐벳을 외부 큐벳에 담그십시오.
파장이 638 나노 미터 인 여기 광원을 켜고 3 밀리 와트 정도의 저전력으로 설정하십시오. 전동 번역기를 사용하여 샘플을 이동하여 조직의 내부 플레이트를 비춥니다. HC 이미지 라이브 카메라 소프트웨어를 켜고 외부 에지 트리거 라이트 시트 모드에서 카메라 트리거를 설정하여 전체 설정을 제어하는 맞춤형 소프트웨어로 카메라의 획득 트리거를 구동합니다.
카메라 소프트웨어에서 자동 저장을 활성화하고 이미지를 저장해야 하는 출력 폴더를 설정합니다. 선형 변환기로 XY 평면의 샘플 위치를 수동으로 조정하여 샘플을 카메라 센서의 시야 중심으로 이동합니다. 선형 전동 변환기를 사용하여 Z 축을 따라 샘플을 이동하여 단층 촬영 재구성을위한 심장 경계를 식별합니다.
이미징 세션을 시작하기 전에 레이저 출력을 약 20밀리와트로 높입니다. 이미징 소프트웨어의 캡처 패널에서 시작 버튼을 클릭하여 단층 촬영 수집을 시작하고 동시에 전동 변환기를 사용하여 초당 6마이크로미터의 일정한 속도로 Z축을 따라 샘플을 이동하기 시작합니다. 투명도 방법론과 TDE를 굴절률 매질로 조합해도 샘플의 최종 부피가 크게 변경되지 않으며 시편의 등방성 변형이 발생하지 않습니다.
여기 광학은 시야의 가장자리에서 최대 175 마이크로 미터까지 분기되는 약 6 마이크로 미터의 최소 폐기물을 가진 라이트 시트를 생성했습니다. 카메라 롤링 셔터와 라이트 시트 폐기물의 축 방향 스캔의 동기화는 전체 시야를 따라 약 6.7 마이크로미터의 평균 FW HM을 초래하는 라이트 시트의 폐기물과 여기된 샘플 부분에서만 방출 신호를 수집하는 것을 보장한다. 현미경의 Z 점 확산 기능은 또한 형광 나노스피어의 단층 촬영 재구성에 의해 추정되었고, 6.4 마이크로미터의 FW H M은 적합에 의해 추정되었다.
전체 장기에서 충분한 신호 대 잡음비로 단일 세포막을 3 차원으로 분해하는 시스템의 잠재력도 확인되었습니다. 탈기 절차는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 제대로 수행되지 않으면 조직은 세척 용액에서 배양하는 동안 나타내는 손상에 직면할 수 있습니다.
제시된 프로토콜은 다중 염색 프로토콜과 결합하여 다양한 생물학적 구조를 통합하는 전체 장기 재건을 달성하고 병리학 모델을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.
