이 수정 된 ELISA 프로토콜은 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정확한 정량화를 가능하게합니다. 필요한 검증 실험을 거쳤으며 향후 정량화 방법론을 표준화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 상당한 프로테아제 분해 전에 샘플 처리, 고체상 추출을 통한 정제 및 마이크로타이터 플레이트에 차단 완충액을 적용하여 비특이적 결합을 제한하는 이점을 제공합니다.
CGRP는 편두통의 병태생리학에서 징벌적 역할을 하며 아마도 바이오마커 상태의 후보일 수 있습니다. 또한 심장학적, 피부과적, 바이러스, 심지어 COVID-19 관련 질병 과정에도 연루되어 있습니다. 시작하려면 표준 정맥 천자 방법을 통해 전주복 정맥에서 5 밀리리터의 전혈을 6 밀리리터 진공 청소기 EDTA 튜브로 수집합니다.
표적 펩티드의 용해를 차단하기 위해, 0.5 밀리리터의 아프로티닌 경쟁적 세린 프로테아제 억제제를 첨가한다. 튜브를 10번 뒤집고 다음 단계까지 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 4분 동안 600 4g에서 원심분리합니다.
혈장 분획을 2 밀리리터 둥근 바닥 멸균 저온 바이알에 옮긴다. 극저온 바이알을 섭씨 영하 80도에서 최대 2주 동안 즉시 보관하십시오. 혈장 샘플을 추출하려면 추출 카트리지를 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브 안에 넣습니다.
5 밀리리터의 100 % 메탄올을 통과시킨 다음 10 밀리리터의 초순수를 카트리지에 통과시켜 활성화합니다. 유체는 중력 구동 흐름에 의해 카트리지를 통과할 때 튜브에 수집됩니다. 축적된 초과 유체가 카트리지를 삼키는 것을 방지하고 실험 중에 건조되지 않도록 폐기하십시오.
250 마이크로 리터의 플라즈마를 750 마이크로 리터의 4 % 아세트산에 희석하고 천천히 카트리지를 통과시킵니다. 그런 다음 카트리지를 10 밀리리터의 아세트산으로 세척하십시오. 여분의 액체가 제거되면 카트리지를 새 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
3 밀리리터의 메탄올 아세트산 용액을 준비하여 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 또는 CGRP를 용출시킵니다. 카트리지에 1 밀리리터를 통과시키고 각 용출 사이에 25 분 동안 기다리십시오. 마지막 용출 후, 튜브는 3 밀리리터의 총 용리액을 함유한다.
용리액 1ml를 1.7 milliliter 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 미니 원심분리기에서 1초 동안 회전시켜 용리액을 침전시킵니다. 그런 다음 진공 원심 분리기에서 1, 400 RPM 및 섭씨 4도에서 샘플을 건조시킵니다. 분석 직전에 건조된 샘플을 해동된 효소 면역분석법 또는 EIA 완충액으로 재구성합니다.
플레이트 차단을 위해, 250 마이크로리터의 TBS 피쉬 젤라틴 블로킹 버퍼를 각 웰에 첨가한다. 플레이트 위에 커버 시트를 놓고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 커버 시트를 제거하고 뒤집어서 플레이트를 비우십시오.
그런 다음 종이 타월로 판을 닦아 미량의 액체를 버리고 층류 후드에서 10분 동안 건조시킵니다. 플레이트가 눈에 띄게 건조되면 실리카겔 건조제 봉지와 함께 그립 밀봉 호일 파우치에 넣습니다. 섭씨 영하 20도에서 24시간 동안 보관하세요.
분석을 수행하기 전에 모든 샘플과 준비된 시약을 실온에서 해동합니다. 블록 플레이트의 웰을 헹구려면 300마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 30초 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 세척 버퍼를 버리고 헹굼을 5회 반복합니다.
마지막 헹굼 후 이전에 설명한대로 플레이트를 닦아냅니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 EIA 버퍼를 전용 2개의 비특이적 결합 또는 NSB 웰에 분배한다. 100 마이크로 리터의 CGRP 표준을 추가 한 다음 재구성 된 샘플과 품질 관리를 적절한 웰에 복제합니다.
빈 웰을 제외한 각 웰에 100 마이크로 리터의 CGRP 추적자를 추가하십시오. 마지막으로 투명 커버 시트를 사용하여 플레이트를 밀봉하여 샘플과 시약이 증발하지 않도록 하고 섭씨 4도에서 16-20시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 제조업체의 지침에 따라 Ellman의 시약을 준비하십시오.
접시가 기울어지면 앞에서 설명한 대로 각 우물을 세 번 씻습니다. 마지막 헹굼 후 플레이트를 120RPM에서 2분 동안 흔듭니다. 다시 접시를 세 번 헹구고 물기를 닦아냅니다.
액체가 웰에서 눈에 띄게 제거될 때까지 거꾸로 된 판을 두드립니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 Ellman 시약을 빈 웰을 제외한 각 웰에 추가합니다. 플레이트가 덮이면 알루미늄 호일로 싸서 빛 노출을 방지하고 실온의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양한 후 흡광도를 기록합니다.
본 연구는 블로킹 단계를 추가하면, 각 CGRP 스파이크 샘플에서의 회수율이 허용 범위 내에 있음을 입증하였다. 그러나, 차단 단계가 배제되었을 때, 비특이적 결합은 125 %의 상한을 초과하는 회수율을 초래했다CGRP 분해를 제한하기 위해 수집 직후 혈액 샘플을 보유하기 위해 아프로 티닌을 첨가하는 것이 중요하다. 추가적으로, 블로킹 완충액은 비특이적 결합을 더욱 감소시키기 위해 ELISA 전에 마이크로타이터 플레이트에 첨가되어야 한다.
따라서 이 프로토콜은 편두통 및 전정 편두통이 있는 혈장 환자와 대조군의 CGRP 수준을 정량화하여 전정 편두통의 바이오마커로서 CGRP의 후보를 탐색하는 데 활용될 수 있습니다.
