세포막의 전기생리학적 특성을 측정함으로써, 세포의 전기적 활성을 조절한다는 것을 증명하는 주요 문제가 해결될 수 있다. 전체 세포 패치 클램프 기록은 개별 세포의 이온 전류를 연구하고 다양한 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 주변 기술입니다. 전체 셀 패치 클램프 사전 녹음에서 최고의 성능은 많은 연습과 공부를 통해 얻을 수 있습니다.
뇌 해부를 시작하려면 목이 잘린 동물의 두개골 상단에있는 피부에 수술 용 가위를 사용하여 코에서 주둥이까지 절개하고 두피를 제거하십시오. 다음으로, 홍채 가위로 시상 봉합사를 따라 정수리 간 판을 자르고 후두골을 제거하십시오. 절골술을 정수리 뼈 아래로 밀어 넣고 뇌가 노출 될 때까지 부드럽게 잡아 당깁니다.
뇌를 노출 한 후 머리를 거꾸로 뒤집습니다. 뇌를 부드럽게 낮추어 양쪽의 삼차 신경을 시각화합니다. 그런 다음 Castroviejo 곡선 가위를 사용하여 삼차 신경을 자릅니다.
시상 하부를 시각화 한 후 시신경을 확인하고 부드럽게 자릅니다. 다음으로, 전두엽의 먼 앞쪽 부분을 자릅니다. 뇌를 제거하고 슬라이스를 얻을 때까지 슬라이싱 용액에 즉시 담그십시오.
뇌 샘플을 자르려면 뇌를 여과지에 올려 놓고 초과 용액을 건조시킵니다. 그런 다음 날카로운 절단 면도날로 뇌간을 소뇌와 나머지 조직에서 분리하는 관상 절단을 수행합니다. 다음으로, 뇌의 코들 부분을 진동 자형의 바닥에 붙이고 슬라이싱 장치 챔버를 섭씨 0도에서 2도까지 냉각 된 슬라이싱 용액 또는 aCSF 용액으로 채 웁니다.
비브라톰 챔버 주변에 드라이아이스를 포장하여 시술 중에 슬라이싱 용액을 차갑게 유지합니다. 면도날을 진동자에 삽입하고 장치의 절단 매개변수(예: 속도를 3, 주파수를 9, 피드를 250마이크로미터)로 설정합니다. 조직 슬라이싱 절차 동안 아크릴 전사 피펫을 사용하여 슬라이스를 회수 챔버로 옮기고 슬라이스 획득 후 조직 회복을 위해 60분 동안 기다립니다.
셀 밀봉 및 기록을 시작하기 전에 현미경, 증폭기, 디지타이저 및 마이크로 매니퓰레이터를 켭니다. aCSF 용액으로 현미경에 부착된 기록 챔버를 구축합니다. 관류 펌프를 사용하여 분당 2밀리리터의 속도로 aCSF를 지속적으로 관류합니다.
소프트웨어 설정을 확인하고 실험 유형에 따라 녹음에 대한 특정 프로토콜을 만듭니다. 관심 있는 뇌 조각을 아크릴 이송 피펫을 사용하여 한 번에 하나씩 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 앵커로 슬라이스를 잡고 aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 합니다.
침지 현미경의 저전력 대물 렌즈(10X 또는 20X)를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버 중앙에 배치합니다. 슬라이스 위치는 현미경으로 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 관심 영역을 찾은 후 대물 렌즈를 고출력 렌즈로 전환하고, 63X 조직 수준에 초점을 맞추고 표적 영역에서 내인성 형광 단백질과 세포의 모양을 관찰하여 뇌 절편 표면에서 키스펩틴 세포를 찾습니다.
가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서로 컴퓨터 화면에 표시하거나 관심 영역 위에 사각형과 같은 형식을 그려 표시합니다. 컴퓨터 화면 표시는 기록 피펫 위치를 셀로 안내하는 데 도움이 됩니다. 표적 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 전극 홀더에 도입하여 내부 용액이 은 전극과 접촉하도록 합니다.
폴리에틸렌 튜브를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1 내지 3밀리리터의 공기로 채워진 주사기를 사용하여 마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 양압을 가하여 파편이 마이크로피펫으로 들어가는 것을 방지한다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로 매니퓰레이터 버튼을 움직여 마이크로피펫의 XYZ 축을 관심 있는 셀로 안내합니다.
마이크로피펫의 끝이 보이도록 초점을 조정하고 초점을 슬라이스에 너무 가까이 두지 말고 더 가까이 가져옵니다. 마이크로 매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로피펫을 초점이 맞춰진 곳으로 천천히 내려가 마이크로피펫 팁이 슬라이스를 갑자기 관통하지 않고 세포 표면이나 대상 영역에 닿을 때까지 천천히 하강하도록 합니다. 1-3 밀리리터의 공기로 채워진 주사기로 가벼운 양압을 가하여 접근 경로에서 파편을 제거합니다.
XYZ 축에서 마이크로 매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫 팁을 더 가깝게 가져오고 적용된 압력에 의해 딤플을 유발하는 대상 셀에 닿습니다. 소프트웨어의 전압 클램프 모드를 사용하여 딤플을 설정 한 후 마이크로 피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 1-2 초 동안 입으로 약한 짧은 흡입을 적용하여 마이크로 피펫과 셀 사이의 밀봉을 생성합니다. 씰이 약 1분 동안 노이즈 간섭 없이 기계적으로 안정된 상태를 유지하면 유지 전압을 관심 있는 셀의 가장 가까운 생리학적 휴식 전위로 설정합니다.
kisspeptin 시상 하부 뉴런의 경우 마이너스 50 밀리 볼트가 권장됩니다. 다음에, 파열된 막이 마이크로피펫을 막히게 하거나 상당한 양의 막 부분 또는 세포를 끌어당기지 않도록 세포에 놓아두고, 밀봉된 마이크로피펫 팁에서 원형질막을 파괴하기 위해 입으로 짧은 흡입을 가한다. 적절한 전체 셀 구성은 충분한 힘으로 흡입을 수행하여 달성 할 수 있습니다.
사용 된 시스템 설정 설명서를 확인하십시오. 세포막을 파괴한 후 전압 클램프 모드에서 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다. 셀의 직렬 저항과 전체 셀 커패시턴스가 자동으로 계산되어 소프트웨어에 의해 즉시 표시됩니다.
다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 소프트웨어에서 세포 생존율 매개변수를 확인합니다. 실험 중 직렬 저항과 셀 정상 상태 커패시턴스를 모니터링합니다. 전체 셀 구성이 제대로 달성되면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다.
현재 클램프 모드에서 휴지 막 전위의 변화와 유도된 정지 막 전위 변화를 기록합니다. 시상 하부 키스 펩틴 뉴런의 활성에 대한 인간 재조합 성장 호르몬의 가능한 효과는 전체 세포 패치 클램프 기록의 도움으로 연구되었습니다. 인간 재조합 성장 호르몬인 HGH를 그램당 20마이크로그램으로 투여하면 AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런 12개 중 5개와 기록된 ARH 키스펩틴 뉴런 14개 중 9개에서 휴지막 전위의 상당한 과분극이 유도되었습니다.
AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH 키스펩틴 과분극 뉴런은 반응하지 않는 세포에 비해 휴지막 전위를 유의하게 변화시켰습니다. HGH 적용 중 휴식 막 전위에 대한 영향은 AVPV / PeN 키스 펩틴 뉴런에서 약 0.9-0.7 기가 옴, ARH 키스 펩틴 뉴런에서 1.7-1.0 기가 옴의 전체 세포 입력 저항의 현저한 감소를 따랐습니다. 신중한 기가실을 통해 수행되는 완벽한 뇌 라인과 해변 매개변수를 통해 세포의 영역 동안 최상의 전체 세포 기록을 달성하는 데 필요합니다.
기록된 세포의 마이크로피펫 용액을 수집하여 단일 세포 RTPCR에 사용하여 분리된 세포의 분자 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 유전자 변형 동물의 사용과 결합된 전체 세포 패치 클램프 기술은 키스펩틴 뉴런의 정의를 허용하는 생식에 대한 이해의 돌파구를 나타내며 특성을 증가시켰으며 주요 조절자입니다.
