우리의 프로토콜은 연구원이 유기체 의 외부 관상 동맥 혈관 신생의 분자 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 관상 동맥 혈관 신생 의 메커니즘의 연구를 용이하게, 유기체 내부 관상 동맥 혈관 신생의 과정을 정확하게 모델링한다는 것입니다. 먼저 배아의 날 11.5배의 배아를 70%로 운반하는 임신한 마우스를 살포하여 시작합니다.
집게로 배 위로 피부를 들어 올리고, 가위를 사용하여 복부 피부와 복막 절개를 횡격막까지 앞쪽으로 만들어 자궁 경적을 노출시합니다. 자궁을 잡고, 조직을 자유롭게 자르고 자궁 경적을 꺼냅니다. 배아의 끈을 스테레오 현미경으로 얼음 차가운 멸균 PBS에 넣고 각 배아에서 자궁 근육, 노른자 낭 및 양막 덮개를 벗깁니다.
각 배아가 고립되면 천공 숟가락을 사용하여 조직을 얼음에 멸균 PBS가 함유된 새로운 페트리 접시로 옮기습니다. 배아 심장 조직을 수확하기 위해, 현미경의 밑에 새로운 Petri 접시로 해부되는 첫번째 태아를 전송하고, 복부 측에 태아를 놓습니다. 미세 한 집게를 사용하여 가슴에 작은 절개를 하고 다이어프램 위에 약간 부착하고 닫힌 포셉을 절개에 삽입하여 절개를 확대합니다.
집게를 사용하여 가슴 벽을 열어 심장과 폐를 노출시키고, 두 번째 한 쌍의 집게를 사용하여 심장을 앞쪽으로 90도 움직여 등쪽 대오르타와 정맥을 노출시합니다. 그런 다음, 심장의 기지에서이 혈관을 잡고, 조심스럽게 심장과 폐를 앞쪽으로 끌어 내어 차가운 PBS로 조직을 헹구는다. 모든 심장 조직이 수확되면 심장 샘플을 현미경 아래에 놓고 각 심장에서 폐 엽을 제거하십시오.
등쪽 의 첫 번째 심장을 방향을 지정하고, 심장을 바닥에 잡고, 심장에서 SV를 둘러싼 인접한 조직에서 왼쪽과 오른쪽 아리아를 긁어 미세 한 집게를 사용합니다. SV를 분리하려면 심장 등쪽을 위로 향하게 합니다. 조심스럽게 심혼에서 SV를 제거하고 멸균 전달 파이펫을 사용하여 격리 된 조직을 얼음에 차가운 멸균 PBS가 함유 된 새로운 6 센티미터 페트리 접시에 넣습니다.
전체 심실을 분리하려면 유출관을 제거하고 새로운 멸균 이송 파이펫을 사용하여 얼음 에 얼음 냉멸 균 PBS가 들어있는 별도의 6센티미터 페트리 접시에 심실을 배치합니다. SV와 전체 심실 배양을 설정하려면 먼저 24개의 웰 배양 판당 8마이크로미터 모공 PET 배양 삽입물의 멤브레인을 코팅하고, 문화당 100마이크로리터가 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양당 100마이크로리터를 넣습니다. 매트릭스가 고화되면, 전송 파이펫을 사용하여 각 삽입에 각 각 파기를 전송하고 현미경으로 플레이트를 이동합니다.
깨끗한 집게를 사용하여 각 삽입의 중앙에 이클을 배치하여 측면 벽에 부착되지 않았는지 확인하고 추가 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 라미나르 유동 조직 배양 후드 하에서 뚜껑을 닫은 채 플레이트를 옮기고, 각 삽입에 미리 따뜻워진 완전 배지 100마이크로리터와 각 삽입물 아래에 200마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 사용되지 않는 우물에 PBS 300 마이크로리터를 추가하고 5 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.
문화의 둘째 날에 VEGF-A 치료의 경우, 각 배양의 양 챔버에서 배지를 제거하고 각 삽입에 PBS의 100 마이크로 리터를 추가하고, 각 우물에 PBS의 마이크로 리터 200 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 몇 번 소용돌이치고, PBS를 1%의 태아 소 세럼으로 보충한 기저 배지 300마이크로리터로 교체하여 배양을 시작하고 접시를 인큐베이터로 되돌리십시오. 기아 후 3일째에는 VEGF-A밀리리터당 50나노그램을 대조유우물및 기초배지에 신선한 기저형 배지 플러스 세럼 300마이크로리터를 첨가하고, 플레이트를 세포 배양 배양기로 반납한다.
문화의 여섯 번째 날에는 PBS로 챔버를 세척하고 각 우물에 4 %의 파라 포름 알데히드의 200 마이크로 리터와 각 삽입에 고정 100 마이크로 리터로 문화를 수정합니다. 섭씨 4도에서 20분 후, 실온에서 흔들리며 세척당 10분 동안 PBS 300 마이크로리터로 배양을 씻으실 수 있습니다. 마지막 세척 후, 우물에 1 차 적인 항체 용액의 300 마이크로 리터를 추가하고 흔들로 섭씨 4도에서 하룻밤 문화를 삽입합니다.
다음날 아침, PBS의 비이온 계면활성제에서 10회 세척하여 10분마다 세척용액을 변경한 후 적절한 플루오로퍼리 공주 2차 항체300마이크로리터로 10분마다 흔들고 있다. 다음 날, 시연된 바와 같이 비이온 계면활성제로 신선한 PBS로 문화를 10회 세척합니다. 마지막 세척 후, 미세 한 집게를 사용하여 각 삽입에서 멤브레인을 조심스럽게 껍질을 벗기고 멤브레인을 개별 유리 현미경 슬라이드에 놓고 옆으로 식히십시오.
뚜껑 슬립에 DAPI 보충 장착 매체로 샘플을 덮고 뚜껑 전표의 가장자리를 명확한 매니큐어로 밀봉합니다. 매니큐어가 건조되면 공초점 현미경 검사법에 의해 슬라이드를 이미지합니다. 초기 SV 세포가 심장 심실로 성장함에 따라 Coup-TF2와 같은 정맥 마커 생성을 중단합니다.
배양 5일 후, SV 내피 세포가 싹트고 막으로 이동합니다. 배아 심혼에서와 같이, 혈관이 SV에서 멀리 이동함에 따라 Coup-TF2 발현이 감소된다. VEGF-A로 자극 하는 배양 밀도 와 길이 모두에서 혈관 형성 콩나물의 증가 성장을 전시. VEGF-A에 의해 자극된 추가 SV 배양은 대조군에 비해 새싹 길이가 거의 3배 증가하는 것을 보여주며, 이는 SV와 내피칸티움의 내피 새싹이 VEGF-A에 반응한다는 것을 시사한다.
심장과 폐를 꺼내고, 아리아를 제거하고, SV를 둘러싼 인접 조직을 청소하면서 SV 조직을 잃지 않는 것이 중요합니다. 살아있는 화상 진찰 실험은 관상 동맥 혈관 신생을 시각화하고 프로세스 도중 세포 및 분자 역학의 세부 사항을 포착하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 관상 동맥 혈관 신생의 잠재적인 분자 메커니즘을 평가하고 일반적으로 혈관 신생을 연구하기위한 모델 시스템으로 매우 유용합니다.
