노치 신호전달은 후생동물에서 발달하는 동안 황산염 결정 및 패터닝을 제어합니다. 우리는 노치 리간드 델타-D를 표지하고 발달 중인 얼룩말 물고기 전뇌의 방사형 신경교 전구체에서 세포내 이동을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 제브라피쉬 숨겨진 뇌실 주입은 높은 효율성과 오래 지속되는 효과로 발달 중인 뇌실을 감싸는 근토성 방사형 신경교 전구체에 의한 선택적 Anti-DLD-Atto-647N 흡수를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 다양한 발달 단계에서 활용되는 다른 약리학적 또는 유전적 섭동과 쉽게 결합할 수 있으며 성인 뇌뿐만 아니라 인간 만능 줄기 세포 유래 2D 또는 3D 뇌 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 수정 된 배아를 생성하고 18-20 시간 동안 배양 한 후 인큐베이터에서 제거합니다. 먼저 백색광을 사용하여 20배 배율로 에피형광 현미경으로 관찰합니다.
유리 피펫을 사용하여 현미경으로 흐리거나 파열된 것처럼 보이는 죽은 배아는 폐기합니다. 그런 다음 형광등을 켭니다.amp 현미경의 RFP 필터 설정을 선택합니다. 강한 적색 형광을 가진 배아를 선택하고 달걀 물로 새 접시에 옮깁니다.
이제 백색광 아래에서 두 개의 미세한 집게로 배아를 수동으로 dechorionate하십시오. 한 쌍의 집게로 chorion을 잡고 다른 집게로 chorion을 찢습니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 눈물을 열고 다른 집게의 끝으로 배아를 부드럽게 밀어 배아가 통과할 수 있을 만큼 충분히 크게 만듭니다.
미세 주입 전에 빠른 헹굼을 위해 신선한 배아 배지가 있는 새로운 페트리 접시에 박초를 제거합니다. 풀러에서 미세한 주사 바늘을 당긴 후 입체 해부 현미경으로 집게로 바늘 끝을 엽니다. 팁의 직경을 약 10마이크로미터로 만들고 테이퍼 각도를 약 30도로 만듭니다.
이제 0.5 마이크로리터의 항-Dld 항체와 2 마이크로리터의 항 마우스 L G Atto-647N 항체를 5-10회 피펫팅하여 접합하고 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 2.5 마이크로리터의 블로킹 완충액과 0.5 마이크로리터의 0.5%페놀 레드를 항체 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 혼합하여 혼합물에 남아 있는 비접합 항체를 차단합니다. 다음으로, 배아 배지에서 1%의 저융점 아가로스를 준비합니다.
혼합물이 투명해질 때까지 아가로오스 함유 혼합물을 섭씨 70도에서 가열합니다. 아가로스 용액을 분취한 후 섭씨 40도의 열 블록에 보관하십시오. 1%의 낮은 융점 아가로스가 들어 있는 튜브에서 배아를 3초 동안 헹굽니다.
개별 아가로스 방울이 있는 거꾸로 된 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 배아를 놓고 각 배아를 개별적으로 장착합니다. 배아를 아가로스에 옆으로 평평하게 놓고 아가로스가 실온에서 굳을 때까지 이 위치를 유지합니다. agarose에 장착 된 모든 배아를 계란 배지로 덮으십시오.
매립된 배아를 실체 현미경 아래에 놓고 아가로스를 계란수로 덮습니다. 마이크로 매니퓰레이터로 공기압 인젝터를 설정하고 현미경 가까이에 배치합니다. 고압의 기체 질소를 함유한 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.
배아가 아가로스에 장착되면 가스 밸브를 엽니다. 마이크로 인젝터의 전면 충전 모듈을 사용하는 동안 준비된 유리 바늘에 2마이크로리터의 항체 혼합물을 마이크로 매니퓰레이터에 프런트로드합니다. 이제 입력 압력을 제곱인치당 80-90파운드로 조정하고 사출 압력을 제곱인치당 20파운드로 조정합니다.
현미경으로 마이크로미터를 사용하여 주입량을 보정합니다. 바늘 구멍의 크기에 따라 튜닝 시간을 10밀리초에서 120밀리초로 설정합니다. 패들을 두드려 각 주입 펄스를 전달하고 각 주입의 주입량을 4-5 나노 리터로 조정합니다.
그런 다음 마이크로 주사 바늘의 끝을 뒷뇌의 등쪽 지붕판을 통해 론디미어 제로원 힌지 포인트 뒤쪽에 찔러 뇌 조직에 부딪히지 않고 약 10나노리터의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 액체의 흐름을 관찰했습니다. 주사 후 미세 매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 신속하게 제거합니다.
성공적인 주사를 위해, 주입 된 혼합물의 적색 염료는 포위 된 용설로로 누출되지 않고 안정적으로 뇌실에 남아 있습니다. 마운팅 플레이트를 현미경 아래로 이동하여 반복에 적합한 위치에 장착된 다른 배아를 찾습니다. 6 내지 8개의 배아를 주입한 후, 미세수술용 칼로 아가로스를 벗겨 내포된 아가로스로부터 배아를 방출한다.
미세 주입된 배아를 30밀리리터의 배아 배지가 있는 신선한 접시에 옮기고 다음 단계를 위해 실온에 두십시오. 30 분 후, 선택된 배아를 10 밀리리터의 배아 배지로 옮긴다. 배아를 장착하려면 튜브에 동일한 농도의 트리칸을 함유한 0.8% 저융점 아가로스를 준비합니다.
유리 피펫을 사용하여 주입 된 배아를 따뜻한 아가로스에 3 초 동안 담그십시오. 그런 다음 즉시 동일한 유리 피펫으로 아가로스에서 배아를 제거하고 튜브에서 아가로스 한 방울과 함께 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배아를 놓습니다. 배아 뇌의 등쪽을 가능한 한 유리 바닥에 가깝게 유지하기 위해 섬유 프로브 또는 로딩 팁으로 배아의 방향을 부드럽게 지정합니다.
배아 위치를 부드럽게 돌려 아가로스가 서서히 굳어짐에 따라 말리지 않고 배아를 확장합니다. 그런 다음 유리 바닥 접시를 뒤집어 배아 위치를 확인합니다. 올바르게 장착된 배아가 있는 전체 등쪽 전뇌를 현미경으로 볼 수 있는지 확인하십시오.
배아를 덮기 위해 트리칸을 함유 한 섭씨 28.5 도의 예열 된 배아 배지 2-3 밀리리터를 첨가하십시오. 컨포칼 현미경의 온도 제어 단계에 접시를 적절하게 놓고 이미징 챔버의 온도를 섭씨 28.5도로 조정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다.
Atto-647N 주입된 배아는 뇌실에서 배경 형광을 보였다. 항-Dld-Atto-647N 주사된 제브라피쉬 배아는 발달 중인 전뇌의 대부분의 세포에서 다량의 내재화된 형광 입자를 보여주었습니다. 시간 경과 이미징은 세포 분열 동안 세포 내 Anti-Dld-Atto-647N 엔도솜의 움직임을 보여주었습니다.
대부분의 유사분열 방사상 아교세포 전구체는 항-Dld-Atto-647N 엔도솜이 두 개의 딸 세포로 전방 또는 후방 비대칭 분리를 보였습니다. 비대칭은 아나페이즈가 끝날 무렵 안정화되었고, 그 결과 나중에 딸 세포에 의한 노치 신호 엔도솜의 비대칭 유전이 발생했습니다. 바늘이 올바른 위치에 숨겨진 브랜드 심실에 삽입되었는지 확인하고 미세 주입 후 누출이 있는지 확인하십시오.
노치 델타 신호 전달을 라벨링하는 것 외에도, 이 프로토콜은 세포외 도메인에 대한 우수한 항체를 사용할 수 있는 경우 유사한 전략을 사용하여 다른 막 단백질 또는 세포외 단백질을 라벨링하는 데 적용할 수 있습니다.
