스키드 모어 강사 개발 그랜트는이 원고의 준비 및 게시를 투자했습니다.

1. 태아를 설치 (예 : 면역 세포로 선정 시각화 기술, 완료되면, 현장 하이브리드 화에서, 등) <ol><li> 선택의 버퍼 (그림 1A)로 가득 35mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 버퍼의 선택은 라벨 절차를 기반으로합니다. 일반적으로 PBS 기반의 버퍼가 적합하다. </li><li> 해부 현미경 및 집게를 사용에서 다른 쌍 (그림 1B) 멀리 노른자를 당기는 동안 집게 일쌍으로 머리를 고정합니다. 또한, 부드럽게 노른자를 멀리 끌어 곤충 핀 홀더에 곤충 핀을 사용합니다. </li><li> 배아 포커 사용 노른자 파편 (그림 1C-D)의 여지가없는 페트리 접시의 부분에 배아를 이동 (낚시 줄 (0.41 mm 직경은) 모세관 또는 파스퇴르 피펫 하나에 붙어). </li><li> 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능하고 g만큼 작은 액체 배아 대기음이라 고한다면, 슬라이드 (그림 1E)에 그들을 피펫. </li><li> 조심스럽게 실험실을 닦아 사용하여 물기를 멀리 심지. 배아과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 배아에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. 형광 라벨, 선택의 antifade 시약을 사용합니다. 비색 신호의 경우, 70 % 글리세롤 마운팅 매질로서 사용될 수있다. </li><li> 배아 포커를 사용하여 행 (그림 1 층)에있는 그들의 양쪽에 배아의 방향. </li><li> 커버 슬립 (그림 1G)의 각 모서리에 석유 젤리 또는 높은 진공 그리스의 하나 &quot;덩어리&quot;를 추가합니다. 이것은 과도한 압축에서 배아의 손상을 방지한다. </li><li> 배아 (그림 1H)의 상단에 커버 슬립 (아래 석유 젤리 쪽)을 놓습니다. </li><li> 부드럽게 (70 % 글리세롤 또는 반대로 페이드 장착 시약) 커버 슬립 (그림 1H)을 만지고 설치 미디어까지 각 모서리에 커버 슬립을 누릅니다. </li><li> 필요한 경우, 바로 옆에 COV에 피펫 팅 더 설치 미디어를 추가erslip, 20-200 ML의 범위에서 피펫을 사용. 그것은 아래에 심지됩니다. </li><li> 실험실을 사용하면 커버 슬립 주위에 완전히 깨끗하고 닦아냅니다. 이 배아를 손상시킬 수로, 커버 슬립에 압력을 적용 할 것이 확실합니다. 이 지역은 건조하고 그것에 더 석유 젤리 또는 설치 미디어가 없어야합니다. </li><li> 커버 슬립 (그림 1I)의 가장자리 주위에 밀봉 매니큐어를 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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더 경쟁하는 금융 이익은 저자 중 하나에 존재하지 않습니다.

척수 개발의 고정 된 제브라 피쉬 배아 보조 시각화 측면 장착. 난황 공의 제거를 통해, 뛰어난 현미경 이미징에 필요한 작동 거리가 감소된다. 초기 배아 인한 태아의 크기 및 조직의 취약성에 해부하기가 더 어렵 비록 우리의 대표적인 결과는, 그러나,이 기술은 이미 HPF (18)로 사용할 수있는, HPF (24) 단계로 제한되었다. 이 기술은도 24 HPF보다 오래된 배아에 적용 가능하다. 배아 지브라 피쉬의 광학적 선명도, 유전학 역방향 순방향 유전 화면을 수행 할 수있는 능력, 및 형질 전환 방법에 의해 원조, 몇개의 발생 과정을 조사 할 수있다. 이 BrdU의 안티 - 포스 포 히스톤 3월 4일부터 6일까지 및 인원, nkx, DBX, 그리고 olig의 FAMILIE에있는 신경 세포와 아교 전구 마커의 발현을 통해 패턴과 같은 마커를 신경 전구 세포의 유사 분열 지수를 포함의 1,4-6. 1,4,5,10 사용할 수 있습니다 (예 : 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)와 HUC / D)를 아교 세포 및 신경 세포의 결정을보고 시약. 신경 세포의 하위 차별화 섬, VSX, engrailed 및 GATA 유전자 1,4-6의 발현을 분석 할 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 축삭지도의 분석은 안티-아세틸 튜 불린, 3A10 및 ZNP-1 2,11,12 등의 항체를 통해 가능하다. 다른 척추 동물 모델 시스템 (마우스와 병아리)는 그대로 태아의 모든 개발 축 만 제브라 피쉬의 허가 동시보기, 척수 개발을 연구하는 데 사용하고 있지만. 이 방법의 명백한 제한은 라이브 영상을 배제하는, 배아가 고정되어 있다는 것입니다. 실제로, 신속한 배아 죽음 노른자 결과 (또는 손상)의 제거는, 따라서,이 기술을 이용하여 살아있는 배아의 작동 거리를 감소시키는 것이 가능하지 않다. 그러나, 높은 배율 척수 공동라이브 배아 RD 이미징이 가능합니다. 라이브 영상 중에 노른자를 보존하기 위하여, 태아는 시료 및 커버 슬립 사이에 더 큰 공간을 제공하는 오목 슬라이드에 배치 될 수있다. 또한, 여러 개의 22mm X 22mm 커버 슬립은 현미경 슬라이드에 x 1의 3 중 하나를 슬라이드에 접착 할 수있다. 커버 슬립 위에 놓인 coverslip에 대해 &quot;다리&quot;역할을합니다. 배아는 HPF (18)보다 오래된 경우 tricaine은 이동을 방지하기 위해 배아를 마취하기 위해 사용된다. 그대로 노른자와, 아가로 오스에 포함 된 라이브 배아로 작업 할 때 0.288 mm의 작동 거리가 24 HPF에서 deyolked 배아 필요하지만, 3.3 mm의 작동 거리와 현미경 렌즈는 충분하다. 또한, deyolked 배아에서 파생 된 이식편 문화 플라즈마 응고 고정화 기술 (13)를 사용하여 시각화 할 수있다. 다양한 세포 집단은 GFP, mCherry 또는 photocon 같은 유전자에 의해 코딩 형광 단백질을 이용하여 관찰 할 수있다vertible 염료 카에데 (몇 가지 이름을). 또한, 키메라 배아 내에서 형광 표지 된 세포는 또한이 방법 (14)에 볼 수 있습니다. 달 동안 안정 일관된 설치 기술 개발 및 세포 생물학을위한 중요한 도구입니다. 이 간단한 기술은 다른 실험적인 시도 사이의 비교를 용이있게 재현. 또한, 행 배아의 정렬은 쉽게 나중에 분석을 위해 특정 배아의 식별을 허용합니다.

제브라 피쉬의 척수의 시각화는 여러 가지 요인에 의해 억제된다. 인해 피개 somites의 두께 및 척수의 내부 위치에, 꽤 긴 작동 거리를 높은 해상도 셀룰러 요구된다. (신경의 초기 단계 여전히 존재) 노른자 볼이 더 필요한 작동 거리를 증가하고, 쉽게 커버 슬립의 압력에 의해 손상된다. 또한, 손상 노른자에서 파편은 조직의 명확한 시각화를 금지합니다. dorso - 복부 (DV) 축 단면이 가능하지만, 그들은 쉽게 전후방 (AP) 축 1에 동시 시각화를 허용하지 않습니다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 배아는 슬라이드에 해부 및 장착되어있다. 이 절차는 여러 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 제브라 피쉬 배아는 쉽게 측면이 AP 축 시각화를 용이하게 위쪽으로 향 거짓말. 노른자 균형의 두 번째 제거내가 필요한 작동 거리를 감소하고, 파편을 제한합니다. 셋째,이 설치 절차는 형광 및 명 시야 현미경을 모두 할 수 있습니다. 넷째, 장착 된 배아는 장기 표본 시각화 수 있도록, 4 ° C에서 달 동안 안정. 마지막으로, 개발의 진행은 그 전방 세그먼트에서 발생이 후방 세그먼트보다 더 성숙. 무대 일치 척추 hemisegments이 배아를 비교하고 있는지 확인하기 위해, 위에있는 체절 조직은 가이드로 사용됩니다. 예를 들어, 열 번째 가장 후방 체절 무대 일치 배아의 발달에 상응하는 10 번째 척추 hemisegment을 덮는다. 그대로 배아이 설치 절차는 somites을 쉽게 식별 할 수 있습니다. 우리는 개발 척수 축삭지도의 메커니즘을 연구하는 유전학과 유전자 노크 다운 기술을 사용합니다. 특히, 우리는 robo2, robo3 및 DCC가 Commissural 차 ASCE에 필요한 것으로 확인nding (COPA) 축삭 길 찾기. 여기에 설명 된 설치 절차를 사용하여, 우리는 복부 성장, 중간 선 교차점, 접합면의 폭, 지느러미와 전방 성장 2,3를 검사 할 수 있었다. 이 절차는 또한 마운팅 DV 또는 척수의 AP 패터닝에 적용될 수있다. 우리는 척수의 DV의 패턴에서 하류로 Wnt 이펙터의 서로 다른 역할을 확인하려면이 절차를 사용했습니다. 이 실장을 사용하여, 우리는 단일 세포 수준에서 DV 마커의 해상도를 획득하고, 변화된로 Wnt 신호 수신 4,5의 결과로서 분 패터닝 변화를 확인할 수 있었다. 이 설치 절차는 또한 안티 - 포스 포 3 BrdU의 라벨 (전구 확산) 차별화 (5)를 통해 유사 분열 지수 계산을 할 수 있습니다.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petri dishes 35mm X 10mm
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			25373-041
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Dumont Forceps #3
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			NC9839169
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Cover glass
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-541-B22X22-1.5
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Slides
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			12-550-343
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			SlowFade Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:116px;">
			S36936
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			ProLong Gold
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Life Technologies
			</td>
			<td style="width:116px;">
			P36934
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Petroleum Jelly
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Any grocery store
			</td>
			<td style="width:116px;">
			 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Loop Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			VWR
			</td>
			<td style="width:116px;">
			80094-482
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Insect Pins
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26002-10
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:132px;">
			Nickel Plated Pin Holders
			</td>
			<td style="width:115px;">
			Fine Science Tools
			</td>
			<td style="width:116px;">
			26016-12
			 
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
 
 
 
 
 
 
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Name of Equipment
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Catalog number
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:118px;">
			Olympus Stereo microscope
			</td>
			<td style="width:118px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:118px;">
			SZ61
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

제브라 피쉬의 척수는 여러 가지 이유로 신경계 연구에 대한 효과적인 조사 모델입니다. 우선, 유전 형질 전환 유전자 녹다운 방식은 신경계 발달 근본적인 분자 메커니즘을 조사하는 데에 이용 될 수있다. 둘째, 발달 동기 배아의 큰 클러치는 큰 실험 샘플 크기를 제공합니다. 셋째, 제브라 피쉬 배아의 광학 선명도는 전구, 아교 세포 및 신경 세포의 인구를 시각화하는 연구를 허용합니다. 제브라 피쉬 배아 투명하지만, 시험편 두께는 효과적인 미세 시각화를 방해 할 수있다. 그 이유 중 하나는 척수와 상부의 체절 조직의 탠덤 개발이다. 또 다른 이유는 아직 초기 신경의 기간 동안 존재하는 큰 노른자 공입니다. 이 문서에서는, 우리는 미세 절제 및 체절 조직을 둘러싼 유지하면서 미세한 시각화 할 수 있습니다 수정 배아의 노른자의 제거를 보여줍니다. 우리 ALS오 제브라 피쉬 배아의 반영구적 설치를 보여줍니다. 이 조직의 3 차원 성을 유지로서 이것은 dorso - 복부 및 전후방 축에 신경 발달의 관찰을 허용한다.

셀룰러 패터닝, 분화 및 축삭지도 등의 각종 이벤트가 발달 기초 메커니즘을 해명 할 때, 그 조직의 컨텍스트 내에서 세포를 시각화 할 수있는 것이 중요하다. PAX, nkx, 또는 DBX 가족 4 전사 인자의 발현 도메인의 복부 나 등의 변화와 같이 일반적으로 현재 Dorsoventral 패턴 결함. 때때로, 변경 사항은 몇 가지 세포 직경 4를 포함, 미묘한있을 수 있습니다. 단면 분석은 이러한 유형의 분석을 허용한다. 그러나, 약한 신호 또는 AP의 축에 수직하지 않은 단면을 가진 시약은 해석을 제한 할 수 있습니다. 또한, 단면 분석을 쉽게 변경이 AP 축에서 지속 여부를 고려하고, 저온 유지 장치의 가용성에 의존하지 않습니다. 이 제한은 척수의 측면보기로 우회한다. 도 2b에 도시 된 바와 같이, mRNA의 nkx6.1은 D이다전구 도메인 내, 24 시간 후 수정 (HPF)에서 척수의 약 복부 반 istributed. 전구 세포는 척수의 중간 부분에서 발견되는 바닥 플레이트의 존재로 인해 포스트 유사 분열 세포로부터 구별 가능하다. DIC 광학과 횟수, 각각의 세포는 명확히 구별하고, 발현 세포와 nonexpressing 간의 정의 된 경계가 분명하다. 전구 세포주기 출구는 유전자 발현의 변화에​​ 의해 수반된다. 예를 들어, 모든 사후 유사 분열 신경 세포는 면역 세포 화학 1,5와 감지 할 HUC / D를 표현한다. 섬, GATA, 및 VSX의 가족을위한 mRNA의 프로브는 각 척수 hemisegment 6 내에서 일관된 위치와 번호를 특정 후 유사 분열 신경을 레이블. 또, 로보 제품군에서와 축삭지도 수용체 postmitotic 뉴런의 제한된 인구 (그림 2C)를 표현 <suP&gt; 2,7,8. 배아의 측면 마운팅 후 유사 분열 뉴런의 정확한 계산을 할 수 있습니다. 유사 분열을 계속 조상은 항 - 포스 히스톤 3 면역 세포뿐만 아니라 B​​rdU의 라벨로 정량화 할 수있다. 또한, 세포 죽음은 TUNEL 라벨 4-6으로 평가 될 수있다. 24 HPF에서 다음 postmitotic 뉴런의 축색 돌기는 다양한 방법으로 시각화하고, 단일 세포 수준에서 구별 할 수있다 : 지느러미 측면 오름차순 (도라), Commissural 차 오름차순 (COPA), Commissural 보조 오름차순 (코사), 복부 세로 내림차순 (초원), Kolmer-Agdur (KA), Commissural 두 갈래 / 세로 (COB / L), 원주 오름차순 (CIA), 원주 내림차순 (CID), 유니 폴라 Commissural 내림차순 (UCoD), Rohon - 수염 (RB), 운동 신경원 ( M) 9. 축삭은 지느러미, 복부, 전방 및 후방 방향으로 뉴런에서 확장. 그들은 지점, 지느러미 모두에게 중간 선을 통과하고, 종료및 복부 척수. 공 초점 레이저 주사 현미경을 결합 할 때, 이러한 다양한 세포 행동은 면역 세포와 같은 GFP 2 등의 유전자 인코딩 형광 단백질을 이용하여 가로 방향으로 장착 된 배아에 분명하다. 도 2D에서, ZNP-1 면역 세포가 개발 운동 신경원을 레이블로 사용되었다. 운동 신경원은 주변 개발 근육을 신경을 분포시키다 배쪽으로 척수를 종료합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. 해부 및 제브라 피쉬 배아의 마운트 측방. (A)를 면역에 대한 처리 한 후, 현장 하이브리드 화 등으로, 배아는 35mm 페트리 (0.5 % 트리톤 X-100과 PBS) PBT 가득 접시 또는 PTW (PBS로 배치됩니다 0.1 % 트윈 -20). 노른자구슬 (YB)가 명백하다. (B) 난황을 조심 해부이어서 배아의 머리를 고정에 의해 제거된다. (C) 배아 포커 (낚시 줄이 파스퇴르 피펫에 붙어) 별도의 배아와 노른자 파편 (D)에 사용된다. 청소 배아는 현미경 슬라이드 (E)에 피펫 팅 (F) 정렬됩니다. (G) 석유 젤리가 커버 슬립의 모서리에 적용됩니다. (H) 커버 슬립이 장착 매체의 배아 위에 부드럽게 배치됩니다. (I) 매니큐어는 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> 강한&gt; 그림 2. 길 찾기 유전자 발현 패턴과 축삭의 분석은 옆으로 제브라 피쉬 배아를 장착. 24 HPF에서 zebrafish의 배아 (A) 그리기. BD에서, 난황 확장 위의 약 네 hemisegments은 (박스 영역) 시각입니다. (B) nkx6.1은 바닥 플레이트 (FP)를 포함 복부 척수로 표현된다. (C) robo3은 postmitotic 뉴런 (PMN)로 표현된다. 바닥 판 및 전구 영역이 더 많은 측면 초점면에서 분명하지 않습니다. B에서 C는, 척수는 화상의 왼쪽에 브래킷에 의해 경계된다. (D) 공 초점 현미경은 배쪽으로 척수를 종료 모터 축삭 레이블 이미지 ZNP-1 면역에 사용되었다. 모든 이미지에서 앞쪽은 왼쪽에 있으며 등쪽이 다. 40X 긴 작동 거리, 침수 (NA 0.8) 렌즈 (3.3 mm)를 사용 하였다.oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

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Neuroscience

13.7K 조회수.  Skidmore College.  이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다. 

비디오: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...