이 작업은 NIH의 OD R24 보조금 OD031956 및 NICHD R01 보조금 HD073104의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜에 대한 유용한 토론과 초기 의견을 주신 Darcy Kelly에게 감사드립니다. 또한 도움과 지원을 해주신 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Wil Ratzan과 피드백을 주신 익명의 피어 리뷰어 3명에게도 감사드립니다.

모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.
참고: 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)는 안락사의 일차적인 방법이 안락사에 대해 받아들일 수 있는 것으로 간주되지만12, 심장 박동을 멈추게 하는 것으로 밝혀지지는 않았다13. 자주 사용되는 이중 pithing의 2 차 방법조차도 이것을 막지 못하며 동물에게서 심장을 제거하지도 않습니다. 마취된 동물의 방혈은 성공적인 안락사를 위한 인도적이고 효과적인 방법으로 간주된다12. 안락사를 통해 신선한 조직을 유지하는 것이 이 프로토콜의 목표이기 때문에 MS-222를 사용한 1차 안락사를 통해 심장이 계속 뛰는 것이 유익하며, 관류 자체가 방혈을 통한 2차 안락사 방법입니다.
1. 준비
<ol><li>연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 및 관류 기술을 승인했는지 확인합니다.</li>
	<li>5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다. 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. pH가 ≥7인지 확인하십시오.</li>
	<li>X. laevis당 인산염 완충 식염수(PBS)에 180U/mL 헤파린 500μL 또는 X. tropicalis당 200μL를 준비합니다.</li>
	<li>이 용액에 Xenopus 를 넣어 1차 안락사를 수행합니다(1.2단계부터). 동물은 총 1시간 동안 물에 잠긴 상태를 유지합니다.</li>
	<li>Xenopus가 안락사에 15분 동안 발을 집어 통증 반응을 잃었는지 확인합니다. 동물이 반응하는 경우 이 반응이 사라질 때까지 안락사 용액으로 되돌립니다.</li>
	<li>Xenopus의 무게를 측정하고 샘플링 전에 필요한 추가 측정을 수행합니다.</li>
	<li>31G 바늘을 사용하여 PBS(1.3단계부터)에 X. laevis 에 250μL, X. tropicalis 에 180U/mL 헤파린 100μL를 각 앞다리의 근육에 주입합니다.</li>
	<li>PBS 관류액에 54U/mL 헤파린의 동물 무게 1mL/g 용액을 준비합니다. 이 프로토콜에 대해 더 많은 경험을 가진 개인은 관류를 완료하는 데 더 적은 매체가 필요하다는 것을 알 수 있습니다.</li>
	<li>X. laevis를 관류하려면 22G 피하 주사 바늘을 사용하고 X. tropicalis에는 25G 피하 주사 바늘을 사용하십시오. 와이어 커터로 팁을 잘라내어 관류 바늘을 무디게 합니다(그림 1)14. 알림: 이렇게 하면 바늘이 이동할 경우 심실을 통해 구멍이 뚫릴 가능성이 줄어듭니다. 무뎌지는 것 외에도 바늘은 날카로운 돌이나 줄로 약간 갈아질 수 있지만 여전히 심실을 뚫을 수 있을 만큼 날카롭습니다.</li>
	<li>손질된 바늘을 부착하고 54U/mL 헤파린화된 PBS 관류액을 순환시켜 펌프를 준비합니다(1.8단계부터). 관류 효율 감소 또는 실패로 이어지는 공기 색전증의 가능성을 제거하기 위해 튜브에서 모든 기포를 제거해야 합니다( 표 1 참조). 시술 기간 동안 관류 매체를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>펌프를 프로그래밍할 수 없는 경우 바늘을 제자리에 놓고 다른 설정에서 펌핑된 배지 부피를 측정하여 5mL/분 및 10mL/분에 가장 가까운 설정을 결정합니다. 이러한 유속은 종에 관계없이 사용됩니다. 관류 펌프를 프로그래밍할 수 있는 경우 제조업체의 지침에 따라 바늘을 제자리에 놓고 보정하십시오.</li>
	<li>해부면(트레이 또는 폼 시트)을 2차 용기 내의 경사면에 놓거나 혈액 배출을 용이하게 하도록 배열합니다.</li>
	<li>개구리가 1시간 동안 용액에 들어가면 1차 안락사가 완료됩니다. 개구리를 제거하고 발을 꼬집어 통증 반응의 상실을 다시 확인하십시오.</li>
	<li>개구리를 등에 대고 각 팔다리를 고정합니다(그림 2). 팔다리의 조직을 보존해야 하는 경우 팔다리 주위의 숫자 또는 U자형 스테이플을 통해 가는 핀을 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 피부를 자르고 정중선을 위로 올린 다음 옆으로 두 개의 플랩을 만듭니다. (그림 2)</li>
	<li>집게를 사용하여 linea alba를 잡고 체강에서 당겨 빼냅니다(그림 3). 조심스럽게 가위를 사용하여 근육 조직을 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만들고 모든 플랩을 자르거나 고정합니다.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 절단하고 과도한 조직을 잘라내어 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다(그림 3).</li>
	<li>심장은 여전히 뛰고 있어야합니다. 관류 전에 심장 박동이 멈춘 경우 샘플의 신선도가 손상되었음을 확인하십시오.</li>
</ol>2. 관류
<ol><li>위를 확인하고 간장의 왼쪽 엽 (시청자의 오른쪽) 위에 오도록 부드럽게 이동시켜 수술 기간 동안 혈관 구조를 볼 수 있도록합니다. 폐를 식별하고 조직 집게를 사용하여 끝으로 잡습니다. 폐를 체강 밖으로 당기고 팁을 통해 고정합니다(그림 4). 부러진 혈관이 잘 관류되지 않으므로 부드럽게하십시오. 엽 내에서 혈액이 보이면 절차 완료를 결정하는 능력에 영향을 미칩니다.</li>
	<li>체강 공동의 이미지를 촬영하여 관류 효율을 더 잘 평가하고 나중에 비정상 조직을 식별할 수 있습니다.</li>
	<li>얇은 심낭을 확인하고 조직 집게로 당깁니다 (그림 5). 홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 심낭을 부드럽게 천공하고 밑에있는 조직을 자르지 않도록주의하십시오. 심장의 세 방에서 심낭을 떼어냅니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 심실의 정점을 부드럽게 잡습니다. 관류 바늘이 통과할 수 있도록 집게의 견인면 사이에 충분한 공간이 있도록 제한된 압력을 가합니다(그림 6).</li>
	<li>집게의 폐쇄를 통해 바늘을 심실의 챔버에 삽입하고 심실을 통해 천공되지 않도록주의하십시오 (그림 7). 지혈제를 사용하여 바늘 홀더를 사용하여 조직 집게를 제자리에 고정합니다. 알림: 이 기술은 여전히 날카로운 바늘의 위치를 안정화합니다. 바늘을 심실에 직접 클램핑하면 불필요한 손상이 발생하여 필요한 경우 재클램핑이 더 어려워집니다( 표 1 참조).</li>
	<li>약 5mL/min의 속도로 펌프의 흐름을 시작합니다. 심장과 동맥 줄기의 세 방이 충혈됩니다(그림 8, 표 1 참조).</li>
	<li>가위로 오른쪽 귓바퀴 (시청자의 왼쪽)를 조심스럽게 랜스합니다. 피가 쏟아질 것입니다. 유속을 5mL/분으로 설정하거나 10mL/분으로 늘립니다.</li>
	<li>위의 혈관 구조가 희미 해질 때까지 계속 ( 표 1 참조) 심장의 왼쪽 귓바퀴 (시청자의 오른쪽)를 랜스합니다. 유속이 여전히 5mL/분이면 약 10mL/분으로 늘립니다.</li>
	<li>이송 피펫을 사용하여 관류 매체에서 체강 공동을 헹구면 가시성을 유지하고 귀에서 흐르는 관류액의 색상을 더 잘 평가할 수 있습니다.</li>
	<li>귓바퀴에서 흐르는 관류액이 깨끗해지고(표 1 참조) 폐가 붉은 색조를 잃을 때까지 바늘을 제자리에 두십시오(표 1 참조; 그림 9).</li>
</ol>

Blood Perfusion in African Clawed Frogs for transcriptomics and proteomics(전사체학 및 단백질체학을 위한 아프리카 발톱 개구리의 혈액 관류)

<ol>
	<li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum.">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog,+Xenopus+laevis+(Daudin):+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li><li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li><li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad,+Xenopus+laevis+Daudin:+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts.">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li><li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis:+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts.">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li><li>Miodo&#324;ski, A. J., B&#228;r, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+(Rana+temporaria,+Rana+esculenta).+Scanning+electron-microscopic+(SEM)+study+of+microcorrosion+casts.">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li><li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease.">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis.">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution.">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li><li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution.">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).</li><li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals,+2020+edition.">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , 37 (2020).</li><li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+(Xenopus+laevis).">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America.">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li><li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vertebrate+heart:+an+evolutionary+perspective.">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li><li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+protocol+for+lizards,+including+a+method+for+brain+removal.">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li></ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 체강에 접근하기 위한 전통적인 해부 기술을 설명합니다. 조직에 최소한의 손상을 입히고 심장에 접근 할 수 있으며 폐와 위가 보이는 경우 다른 기술도 허용됩니다. 마찬가지로, 나열된 대부분의 해부 도구는 유사한 항목으로 쉽게 대체할 수 있습니다.
이 절차의 효능을 최적화하기 위한 시도가 있었지만 결과는 개인의 경험과 개별 개구리 간의 가변성에 따라...

양서류의 전신 관류는 보존과 고정을 위해 일상적으로 이루어진다 1,2,3,4,5,6. 그러나 이러한 절차는 동물당 채취할 수 있는 신선한 샘플의 수를 제한하는 속도로 발생합니다. 이 연구의 목표는 Xenopus에서 효과적인 혈액 관류 프로토콜을 개발하여 기술의 속도를 우선시하는 것입니다. 이 프로토콜은 X. tropicalis의 경우 동물당 10분 미만, X. laevis 동물당 15분 미만이 소요됩니다. 두 번째 우선 순위는 복제의 용이성과 쉽게 획득할 수 있는 장비의 사용으로, 고품질 샘플을 Xenopus 실험실 간에 널리 공유할 수 있습니다.
Xenopus 개구리는 종에 걸쳐 보존된 기본적인 생물학적 및 병리학적 과정을 연구하기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 이 네발 동물은 다른 수생 모델보다 포유류와 더 밀접한 진화 관계를 가지고 있으며, 폐, 3 개의 방이있는 심장 및 손가락이있는 팔다리를 가지고 있습니다. 국제 사회는 Xenopus 를 효과적으로 사용하여 심층적인 질병 모델링 및 질병 관련 유전자 기능의 분자 분석을 통해 인간 질병에 대한 더 깊은 이해를 얻습니다. 동물 모델로서 Xenopus 의 수많은 장점은 인간 발달 및 질병의 분자 기초를 연구하는 데 매우 귀중한 도구입니다. 이러한 장점에는 큰 난모세포 및 배아 크기, 높은 생식력, 주거 용이성, 신속한 외부 발달 및 게놈 조작 용이성이 포함됩니다. 제노푸스는 확인된 인간 질병 유전자의 ~80%를 공유하는 것으로 추정된다7.
널리 사용되는 포유류 모델과 비교할 때, Xenopus는 모르폴리노 녹다운이 용이하고 CRISPR8을 사용하여 효율적인 형질전환 및 표적 유전자 돌연변이를 사용할 수 있는 빠르고 비용 효율적인 모델입니다. 정량적 질량분석법과 단일세포 전사체학(single-cell transcriptomics)이 제노푸스 배아(Xenopus embryos)9,10에 성공적으로 적용되었지만, 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 최근 세포 지도는 대부분의 조직의 구성이 혈구 유형에 의해 지배된다는 것을 보여준다 11. 빠른 속도로 조직을 피폐화하는 기술을 개발하고 냉각 매체를 사용함으로써 시료의 신선도는 관류에 의해 최소화됩니다. 이는 생리학적으로 교란되지 않은 mRNA 또는 단백질 발현을 프로파일링하는 것이 목표인 응용 분야에서 특히 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying glass with LED light and stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipets</td><td>VWR</td><td>&lt;em&gt;414004-036&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting fine-pointed forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Fine dissection pins</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>General use hypodermic needles, 22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>for &lt;em&gt;X. laevis&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>General use hypodermic needles, 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>for &lt;em&gt;X. tropicalis&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Heparin, porcine intestinal mucosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring</td><td>amazon.com</td><td>B09PTX6M2Z</td><td>size will be dependant on the hosing of the pump used</td></tr><tr><td>Mayo-Hegar needle holder</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td><td>mosquito forceps are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic liquid pump dosing pump 5&amp;ndash;100 mL/min</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable</td></tr><tr><td>Sharpening stone</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>optional; for dulling needles</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen forceps, serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine short insulin syringes, 31 G</td><td>VWR</td><td>BD328438</td><td></td></tr><tr><td>Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp &amp;amp; powerful side cutter clippers</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

effective rapid blood perfusion in xenopus

제노푸스는 100년 넘게 척추동물의 발달과 질병을 이해하는 강력한 모델 유기체였습니다. 여기에서는 모든 조직 내에서 일관되고 과감한 혈액 감소를 목표로 하는 Xenopus의 신속한 혈액 관류 프로토콜이 정의됩니다. 관류는 바늘을 심장의 심실에 직접 삽입하고 혈관계를 통해 헤파린 화 인산염 완충 식염수 (PBS)를 펌핑하여 수행됩니다. 절차는 동물 당 약 10 분 안에 완료 할 수 있습니다. 혈액은 몇 가지 매우 풍부한 단백질과 세포 유형에 의해 지배되며, 이러한 단백질이 대부분의 다른 분자와 관심 세포 유형을 가리기 때문에 수많은 문제를 야기합니다. 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학을 사용한 성인 Xenopus 조직의 재현 가능한 특성화는 장기 샘플링 전에 이 프로토콜을 적용함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 조직 샘플링을 위한 프로토콜은 동반 논문에 정의되어 있습니다. 이 절차는 성별, 연령 및 건강 상태가 다른 Xenopus, 특히 X. laevis 및 X. tropicalis의 관행을 표준화하는 것을 목표로합니다.

성공적인 관류 후, 모든 조직 (색소 Xenopus의 간 제외)은 뚜렷하게 가볍고 혈액으로 덜 포화 될 것입니다. 주요 혈관은 눈에 띄지 않게 되고(그림 10), 조직(간 제외)은 샘플링 후 완충액에서 깨끗하게 헹구어집니다. 프로토콜의 성공적인 실행은 궁극적으로 피혈된 조직 샘플의 데이터 품질에 의해서만 확인될 수 있지만 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개?...

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저자 스포트라이트: Xenopus의 효과적인 빠른 혈액 관류  

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

이 절차는 효율성을 극대화하는 방식으로 양서류 모델을 인도적으로 활용하는 데 중점을 둡니다. 표준화 관행은 원래 식민지에서 채취 및 보존된 샘플에 적용되어 생물 보안 위험을 완화하고 동물 수송 스트레스를 제거할 수 있습니다. 풍부함은 빠르게 완료될 수 있어 조직이 아직 신선할 때 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있는 시간을 최대화할 수 있습니다.이러한 신선도는 단백질체학 및 전사체 프로파일링에 특히 중요합니다. 이 프로토콜은 상세하고 명시적이어서 다양한 배경을 가진 개인이 사용할 수 있습니다. 이를 통해 Xenopus 실험실 간에 고품질 샘플을 쉽게 공유할 수 있습니다.이 풍부한 기술과 함께 모든 주요 장기의 표준화된 샘플링을 위해 유사하게 포괄적인 프로토콜이 연구되고 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

4.3K 조회수.  Harvard Medical School. 이 절차는 효율성을 극대화하는 방식으로 양서류 모델을 인도적으로 활용하는 데 중점을 둡니다. 표준화 관행은 원래 식민지에서 채취 및 보존된 샘플에 적용되어 생물 보안 위험을 완화하고 동물 수송 스트레스를 제거할 수 있습니다. 풍부함은 빠르게 완료될 수 있어 조직이 아직 신선할 때 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있는 시간을 최대화할 수 있습니다.이러한 신?...

비디오: 저자 스포트라이트: Xenopus의 효과적인 빠른 혈액 관류  

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

비교적 생체내에</em개구리의 gp96 Adjuvanticity의> 학습 Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

발생학

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

설치류 태 반의 전 생체 관류

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

생물학

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

신경과학

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

생활 Xenopus Tadpoles에 후 각 통로의 기능 평가

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved drug to prevent or reduce myocardial I/R injury. The study and understanding of the pathophysiological mechanisms of myocardial I/R injury is essential to develop successful treatments. Large animal experiments are an important step in translational methods. The porcine model of acute myocardial infarction has been established and described by ourselves and others. We aimed to further improve the value of the model by focusing in detail on the sampling techniques for use in future experiments. Furthermore, we emphasize small but important steps that can affect the quality of the final results. To mimic the clinical situation of myocardial I/R injury, a percutaneous coronary intervention (PCI) catheter was inserted into the left anterior descending coronary artery (LAD) of an anesthetized pig. &#176;&#176;&#176;This model mimics acute myocardial infarction and PCI treatment in humans with the possibility of accurately determining the area at risk as well as the necrotic- and viable ischemic tissue. Here the model was used to investigate the effect of a bicyclic peptide inhibitor of FXIIa. The model can also be modified to allow longer reperfusion times to study later effects of myocardial infarction.

Here we demonstrate a protocol to standardize sampling procedures of an established porcine model of acute myocardial infarction in order to increase its translational value in the understanding of the pathophysiology of myocardial ischemia/reperfusion injury and to test novel drug candidates.

조직 및 혈액 샘플링 절차의 표준화에 의해 닫힌된 가슴 돼지 심근 경색 모델의 개선

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

의학

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small size of mouse organs, ex vivo perfusion of bone, bladder, skin, prostate, and reproductive organs is challenging or not feasible. Here, we report for the first time an in situ lower body perfusion circuit in mice that includes the above tissues, but bypasses the main clearance organs (kidney, liver, and spleen). The circuit is established by cannulating the abdominal aorta and inferior vena cava above the iliac artery and vein and cauterizing peripheral blood vessels. Perfusion is performed via a peristaltic pump with perfusate flow maintained for up to 2 h. In situ staining with fluorescent lectin and Hoechst solution confirmed that the microvasculature was successfully perfused. This mouse model can be a very useful tool for studying pathological processes as well as mechanisms of drug delivery, migration/metastasis of circulating tumor cells into/from the tumor, and interactions of immune system with perfused organs and tissues.

A protocol is described for in situ perfusion of the mouse lower body, including the bladder, the prostate, sex organs, bone, muscle and foot skin.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

Ex vivo perfusion is an important physiological tool to study the function of isolated organs (e.g. liver, kidneys). At the same time, due to the small ...

Development of a Selective Aortic Arch Perfusion System in a Porcine Model of Exsanguination Cardiac Arrest

Hemorrhage constitutes the majority of potentially preventable deaths from trauma. There is growing interest in endovascular resuscitation techniques such as selective aortic arch perfusion (SAAP) for patients in cardiac arrest. This involves active perfusion of the coronary circulation via a thoracic aortic balloon catheter and is approaching clinical application. However, the technique is complex and requires refinement in animal models before human use can be considered. This paper describes a large animal model of exsanguination cardiac arrest treated with a bespoke SAAP system.
Swine were anesthetized, instrumented and a splenectomy was performed before a controlled, logarithmic exsanguination was initiated. Animals were heparinized and the shed blood collected in a reservoir. Once cardiac arrest was observed, the blood was pumped through an extra-corporeal circuit into an oxygenator and then delivered through a 10 Fr balloon catheter placed in the thoracic aorta.
This resulted in the return of a spontaneous circulation (ROSC) as demonstrated by ECG and aortic root pressure waveform. This model and accompanying SAAP system allow for standardized and reproducible recovery from exsanguination cardiac arrest.

The goal of this protocol is to demonstrate a porcine exsanguination cardiac arrest model and a specifically built selective aortic arch perfusion circuit for translational research.

Hemorrhage constitutes the majority of potentially preventable deaths from trauma. There is growing interest in endovascular resuscitation techniques such ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Xenopus의 효과적인 급속 관류

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비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석