티나 마틴과 데이비드 올브 라이트에서 제공하는 전문가 동물 축산은 기꺼이 감사합니다. 이 연구는 NIH에서 교부금 T32 - AI - 07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03 - HD061671 - 01, R24 - AI - 059830-06에 의해 지원되었다.

1. 동물 X. laevis X X. gilli 하이브리드 LG - 6와 LG - 15 isogenetic 클론 1 로체스터 (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm)의 대학의 번식 식민지에서입니다. LG - 6와 LG - 15 공유 같은 heterozygous MHC haplotype (A / C)하지만 사소한 histocompatibility (H) loci에서 다릅니다. 이 클론의 자손은 여성에 의해 만들어진 diploid 달걀은 UV - 조사 정자 (자손없이 DNA 기여)에 의해 활성화하는, gynogenesis에 의해 생산됩니다. 장갑의 사용은 통성 있습니다. 어떤 사람은 개구리를 처리하기 어렵습니다 (미끄러)와 사실 그것은 개구리 불편하게 만드는 나타나기 때문에 그들을 착용하지 선호합니다. 2. 15 / 0 종양 (종양 및 H - AGS 마이너를 모두 표현)의 gp96의 정화 Gp96 정화는 이전에 다음 ID로 2, 3을 설명하고 있습니다. 간단히, gp96는 코나 - 세파 로스와 DEAE 크로마 토그래피 다음 50~70%의 암모늄 황산 분별 (분리)로 정화됩니다. 단백질의 약 20-50 μg는 종양 조직의 1 ML 당 얻을 수 있습니다. 준비 순도는 SDS - PAGE와 은색 염색법에 의해 결정됩니다. 3. 마이너 H - AG - 이질 LG - 6 프로그에서 복막 Leukocytes (PLS)의 이끌어 냄과 추수 <ol><li> 25 ML 하루 E. 그로 37 50 ML 원뿔 관에서 대장균 문화 ° 잡고 C. </li><li> 다음날 열은 1 시간 동안 그것을 끓는하여 박테리아를 죽일. </li><li> E.을 죽인 열을 원심 분리기 4 2,000 RPM (1,500 G) ° C. 15 분 대장균 </li><li> 뜨는을 제거 1 / 10 일 APBS에서 원래 문화 볼륨 (2.5 ML)의 박테리아 펠렛을 resuspend. 이 시점에서 세균성 문화 사용할 수 있습니다 24 시간 이내에 사용하셔야합니다. </li><li> intraperitoneally (IP) 200 (2 인치 개구리의 경우) 또는 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 개구리 당 열 죽이고 박테리아 준비 300 μL를 (3 인치 개구리)을 주입. </li><li> 사출 PLS 후 3 일이 intraperitoneal 세척하여 수확하고 있습니다. </li><li> 모든 운동 (기간은 크기와 연령에 따라) 중단까지 PL의 수확하기 전에, 성인 개구리는 최대 5 분하는 나트륨 중탄산염와 버퍼 tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222)의 0.1 % 수용액에 침지하여 anesthetized 있습니다. 동물 치료 후 10-20 분 이내에 일어나. </li><li> 70 % 에탄올을 소량으로 개구리의 복부를 소독. </li><li> 5 ML (2 인치 개구리의 경우) 또는 멸균 APBS 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용하여 복막 캐비티에 실온에서 사전 예열 10 ML을 (3 인치 개구리)을 주입. 바늘을 제거하고 부드럽게 주입 버퍼가 뱃속에있는 액체와 equilibrates 것을 막기 위해 잠시 동안 개구리를 마사지. </li><li> 깨끗한 50 ML 원뿔 관에 바늘 뒤쪽에서 똑됩니다 복막 유체를 수집하는 주사기없이 새 18 게이지 1 ½ 바늘을 사용합니다. 가능한 한 초기 주입 볼륨의 많은를 검색할 수 있는지 확인하십시오. 복부 지역의 중심 지역에 혈관을 피하기 위해주의하십시오. </li><li> 그것은 그 새장에 다시 삽입할 수있는 지점에 깨어 때까지 일단 PLS는 얕은 물로 용기에 개구리를 넣어 수확하고 있습니다. </li></ol> 4. 나이브 LG - 6 수신자으로 LG - 6 PLS의 Pulsing 및 입양 전송 <ol><li> 감기 APBS로 번 PLS를 씻어 4 10 분 ° C. 1,000 RPM (750g)에 그들을 원심 분리기 </li><li> 뜨는를 제거하고 APBS의 PLS를 resuspend. </li><li> 5 X 10 5 PLS 당 1 μg gp96의 농도에 gp96와 PLS를 펄스. </li><li> gp96의 적절한 금액은 PLS에 추가되면, 1 시간 동안 얼음에 pipeting와 부화하여 그들을 섞는다. </li><li> 어떤 언바운드 gp96를 제거하는 4 10 분 1,000 RPM ° C에서 또는 1 분 14,000 RPM에서 두 세포를 원심 분리기. </li><li> 여운 gp96 남아가 없습니다 않도록 추위 APBS와 배 PLS 씻으십시오. </li><li> 300 μL 당 5 X 10 5 PLS의 농도에서 펄스 PLS를 Resuspend. </li><li> Adoptively 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 IP 주입하여 PLS를 전송. 동물마다 펄스 PLS (5 X 10 5 세포) 300 μL를 주입. </li><li> 개구리 피부 이식이나 종양 과제 실험을 계속하기 전에 최소 3 일 끝났다해야합니다. </li></ol> 5. 피부 이식 분석 피부 이식의 거부는 Xenopus 4, 5, 6에서 잘 확립 분석이다. Xenopus에서,받는 사람은 21-22에서 18~22일 이내에 1 또는 2 MHC haplotype의 불일치를 표시 기증자 피부 ° C. 거부 반면, LG - 6와 가벼운 H - AGS에 의해서만 차이가 LG - 15 클론 사이의 피부 이식은 (30 일 해당) 더 느리게 거부됩니다. 그러나이 거부는 수신자 THA에 가속입니다t은 이전의 피부 이식 또는 기증자로부터 정화 gp96과 예방 접종을 통해 기증자 사소한 H - AGS에 대해 제일 먼저 처리 해달라고했습니다. 전혀 거부는 기증자와받는 사람이 유전자 (복제, 예 또는 전적으로 타고난 동물) 동일 경우 발생하지 않습니다. 따라서,이 간단한 기술은 gp96로 elicited 생체내 면역 반응의 특성화를위한 매우 강력합니다. <ol><li> 로 3.7에 설명되어있는 기증자의 개구리를 마취. 참고 : Xenopus 총 무균 절차에 대한 필요성을 obviates 피부에 강력한 안티 - 미생물 펩티드 (예 : magainin) 생산 이후에만 최소한의 예방 조치가 이동해야합니다. 사실, 모든 살균제와 개구리의 치료는 피부에 해로운 것입니다. 또한, Xenopus은 인간에게 전송할 수있는 병원균이 없습니다. 따라서, 장갑의 사용은 선택 사항입니다. 그러나, 사용되는 모든 해부 악기는 autoclaved해야 할 모든 솔루션을 살균해야합니다. </li><li> 가위를 사용하여 LG - 15 기증자 개구리의 복부 피부의 조각 (때문에 irridophore 색소 세포의 존재에 은빛 나타나는 복부 피부) (X 5mm를 20mm) 잘라 작은 제거합니다. </li><li> Petridish 포함 APBS의 피부를 삽입하고 얼음에 보관하십시오. 아주 부드럽게 피부 조직을 조작, 포셉 사이에 그것을 들고 마십시오. </li><li> 면도칼이나 가위를 사용하면 5mm로 X 5mm의 조각 개별 이식 잘라. 얼음 APBS의 조각 보관하십시오. </li><li> 그것은 항생제를 (5 MG / L의 농도에서 Penstrep)가 포함된 물에 배치됩니다 깨어 후 때까지이 시점에서 기증 개구리는 얕은 물로 용기에 배치됩니다. 개구리는 그것이 일반 물에 반환되는 시점에 이틀 동안 항생제와 함께 물 속에 보관됩니다. 피부가 제거된 사이트에 작은 상처가 달고 다니는해야하며 일주일 이내 치유되지 않습니다. </li><li> 받는 LG - 6 개구리를 마취. </li><li> 받는 사람의 지느러미 (다시) 피부에 작은 절개를 만들고 은색 면을 피부 아래의 5mm X 5mm 그래프트를 삽입합니다. 그 변위 또는 이식의 손실로 이어질 수 있기 때문에 피부 아래의 대형 공기 방울을 소개하지 않도록주의하십시오. </li><li> 채점이 시작되면 이들은 이식 거부 반응으로 계산하지 않기 때문에 당신이 이식에 가위와 집게 표시를 참고 있는지 확인하십시오. </li><li> 24 시간 후에 오버레이 호스트 피부의 일부가 이식에서 제거되어야합니다. </li><li> 받는 LG - 6 개구리를 마취. 5.1에서 설명한대로 동물을 취급하고 있습니다. </li><li> 이식 자유롭게 시각 수 있도록 autoclaved 가위를 사용하면 이식 주위에 창 밖을 잘라 버릴거야. 기증자 피부를 만지거나 출혈을 유발하지 않도록주의하십시오. 5.5에서 설명하는 것처럼 개구리는 회복하자. </li><li> 스케치를 취하여 바로 그래프트를 채점 시작합니다. 피부 이식의 거부는 이식할 피부 irridophores 파괴의 비율에 의해 결정됩니다. </li><li> 이식 2-3 일마다 검사해야하지만 동물이 일을 anesthetized 될 필요가 없습니다. 이식을 시각화하기 위해 개구리 해부 현미경 petridish에 배치해야합니다. </li></ol> 6. 이식 피부의 전체 마운트 Immunohistology 프로그 전체 - 마운트 immunohistology는 이전에 다음 ID로 6 설명했습니다. 간단히, 개구리 anesthetized와 개구리 물 (작업 공간도 무균 준비)로 사전에 젖은 멸균 종이 타월에 현미경으로 배치됩니다. 이식 피부가 다음 호스트 피부 주변의 작은 금액을 함께 수확하고 있으며 그것은 유동세포계측법 분석 6 셀 얼룩 비슷하게 항체 물들일 것입니다. Autoclaved 악기 및 살균 버퍼는 사용해야합니다. 피부 얼룩 후 현미경 슬라이드에 배치하고 부드럽게 커버 전표와 함께 누르면. 이 시점에서 피부 이식을 침투가 다른 세포 집단을위한 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 섹션 5.5에서 설명한대로 절차 후 개구리는 항생제로 물에 유지됩니다. 와 일반 물에 돌아왔습니다. 피부가 제거 어디에 왼쪽으로 작은 상처가 일주일 이내 깨끗하 데요. 7. 혈액 Leukocytes의 특성화 <ol><li> 개구리의 혈액을 제거하기 전에, 하나 이상의 멸균 화염 파스퇴르 pipettes를 당기는하여 &quot;유리 바늘&quot;을 준비해야합니다. 피펫의 벌금 끝단은 stereomicroscope 아래 날카롭게입니다. 피펫은 다음 열망 플라스틱 튜브에 연결되어 있습니다. 같은 포셉 및 가위 등 모든 악기 사용하기 전에 autoclaved해야합니다. </li><li> 또한 APBS 1 ML 당 헤파린 50 단위를 추가하여 APBS과 헤파린 솔루션의 얼음 차가운 10 ML을 준비합니다. 얼음 솔루션 보관하십시오. 사용된 모든 솔루션 살균해야합니다. </li><li> 3.7에서 설명한대로 개구리를 마취하고, 같은 5.1에서 설명한 동일한 동물 처리 절차를 따르십시오. . </li><li> 노출에 대한 사후 발 위에 피부를 잘라지느러미 족근의 정맥. </li><li> APBS + 헤파린 용액 1-2 ML과 파스퇴르 피펫을 입력합니다. </li><li> 정맥에 &quot;유리 바늘&quot;을 넣고 천천히 입으로 aspirating하여 혈액을 수집 시작합니다. 이것은 혈액 응고와 바늘의 팁을 막히는에서 혈액을 방지하기 때문에 그것은 &quot;유리 바늘&quot;에 APBS + 헤파린 솔루션을 가지고하는 것이 중요합니다. </li><li> 혈액 1 ~ 2 ML 하나의 평균 크기의 개구리에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 개구리 다리에있는 작은 절개는 꿰매 필요하지 않으며 상처가 일주일 이내에 치유. </li><li> 4 10 분 1,000 RPM에서 혈액을 원심 ° C. </li><li> 뜨는를 제거하고 차가운 APBS 10 ML과 1X 세포를 씻으십시오. </li><li> ficoll Histopaque 1.077 (시그마)는 적혈구에서 혈액 leukocytes을 구분하기 위해 상온에서 사전 예열 1 ML에 혈액의 중첩이 ML (1-5 X 10 6 세포). </li><li> 없이 브레이크와 함께 상온에서 1,000 rpm으로 20 분 원심 분리기 다음 백혈구 밴드를 수집합니다. </li><li> 4 10 분 1,400 rpm으로 원심 분리에 의해 APBS와 2X 세포를 세척 ° C 잔류 ficoll을 제거합니다. </li><li> 이 시점에서 세포 유동세포계측법 분석을위한 항체 물들일 준비, 또는 체외 문화 assays에 사용 될 수 있습니다. </li></ol> 8. 종양 이식 분석 <ol><li> 약 일주일 새 15 / 0 종양 세포의 배치와 세포가 잘 성장 시작되었는지 확인 밖으로 실험 해동하기 전에. 문화 매체가 간결 다음 섹션에서 3에서 자세히 설명되어 있습니다. </li><li> 15 / 0 종양 세포를 확장합니다. </li><li> 실험 당일에 세포를 세고 Trypan 파랑 제외 의한 세포 죽음을 결정합니다. 세포 죽음은 5 % 미만되어야합니다. 4 천 rpm으로 추위 APBS에 1X 세포 및 원심 분리기를 씻어 ° C, 10 분. </li><li> 300 μL 당 5 X 10 5 15 / 0 세포의 밀도에 종양 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 동물의 등의 (뒤쪽) 측면 한쪽에 25 게이지 8분의 5 바늘을 사용하여 피하 주사에 의해 개구리 300 μL 볼륨에 이식 5 X 10 5 세포. </li><li> 종양 성장은 종양 도전 후 2-3 주 내에 시작됩니다. 초기 종양의 외관은 주목하고 종양 볼륨 2-3 일마다 기록해야합니다. 종양 부피 (높이 X 길이 X 너비)는 캘리퍼스를 사용하여 측정됩니다. </li><li> 종양이 3,500mm 3 커지거나 개구리는 기면 찾고 시작되면, 그것은 불편을 방지하기 위해 euthanized해야합니다. </li></ol> 9. 시약이 필요 : <ul><li> 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L 나 2 HPO 4, 0.2 g / L KH 2 PO : 수륙 양용 인산이 살린 (APBS)를 버퍼. 10N NaOH와 필터를 사용 산도 7.5 필터 0.2 μm의를 통해 살균. </li><li> Tricaine의 메탄 설 폰 산염 (TMS, MS - 222) (크레 스 켄트 연구 화학 CAS # 886-86-2). </li><li> 나트륨 중탄산염 (피셔 사이 언티픽 S - 233-500). </li><li> Histopaque - 1077 (시그마 - 알드리치 10771-100 ML) </li><li> 헤파린 나트륨 소금 (시그마 - 알드리치 H3149 - 50KU) </li><li> Xenopus 15 / 0 종양에 대한 문화 매체 [자세한 내용은 3 참조] : 10 ML의 인슐린, 10 ML 아닌 필수 아미노산, 10 ML 페니실린 - 스트렙토 마이신과 Iscove DMEM 기초 중간 1 L (Gibco - Invitrogen 11,965) 10 μg / Kanamycin의 ML; primatone (셰필드 제품 사업부), β2 - 메르 캅 토 에탄올 1 ML, 그리고 물에 3.02 g NaHCO 3 (산도 7.0) 3 ML. 이 매체는 30% 더블 증류수를 추가하여 수륙 양용 osmolarity로 희석하고, 5% 태아 소 혈청, Xenopus의 신장 세포 라인 A6에서 20 % superantant, 그리고 정상 Xenopus 혈청의 0.25 %로 보충합니다. </li></ul> 10. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 피부 이식 거부 12일 포스트 이식의 Stereomicroscopic 분석. LG - 6 복제 개구리 중 (A) MHC - 동일 LG - 6에서 피부 이식을받은 것은 (아무 거부를 표시하지 않음) 또는 (b) MHC - 이질 outbred 기증자 (80 % 제거). 화살표 건강 (비 거부) 이식할 조직을 표시 은빛 iridophore 색소 세포를 보여줍니다. (*)의 마크는 거절로 인해하지 포셉. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Gp96는 Xenopus의 종양 항원의 교차 프레 젠 테이션을 용이하게합니다. LG - 15 PLS (5 × 10 5) APBS (대조군), E.의 정화 재조합 gp96 1 μg과 중 얼음에 1 시간을위한 펄스되었습니다 gp96의 콜리 문화, 또는 1 또는 0.5 μg 15 / 0 종양 조직에서 정화. 3 세척 후, 세포가 adoptively LG - 15 성인 수신자로 전송되었습니다 (1 × 10 6 / 개인). 사흘 후, 15 / 0 종양 세포 (5 × 10 5)되었습니다 라이브SC 주입하여 이식. 각 곡선 한 개구리의 종양 성장 속도론을 나타냅니다. 종양이 처음 출현 일 게시 도전 모니터링했고, 종양 크기는 캘리퍼스 (길이 X 폭 X 두께)를 주기적으로 결정했다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

수륙 양용 Xenopus은 면역력을 공부하는 독특한 다목적 아닌 포유 동물 모델입니다. 생명 의학 및 면역 연구에 광범위한 사용에는 MHC 정의 클론 LG - 6와 LG - 15뿐만 아니라 다른 세포 라인과 단클론 항체와 같은 많은 중요한 연구 도구가 생긴 거죠. 우리가 강력한 AG - 특정 안티 - 사소한 H - AG 및 안티 종양 T 세포 응답 7 중재하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능 연구를 체외에서 생...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
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<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
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<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
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<td>&nbsp;</td>
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<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
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<td>Helios calipers </td>
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<td>Dissecting microscope</td>
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<td>High intensity illuminator</td>
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<td>Hemacytometer</td>
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<td>Un-bunsen burner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>&nbsp;</td>
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<td>37&deg;C shaking incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
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comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

우리는 수륙 양용 Xenopus의 개발은 chaperoned 항원의 교차 프레 젠 테이션을 촉진하고 타고난 및 적응 T 세포 반응을 이끌어내는 수 있습니다. Xenopus 피부 이식 거부와 같은 gp96와 같은 특정 열 충격 단백질 (hsps)의 능력을 연구하기위한 독특한 아닌 포유 동물 모델을 laevis 고전 MHC 클래스 구이 (클래스 구이) 제한 T 세포 반응을 이끌어내는 위해 gp96의 능력을 연구하는 뛰어난 플랫폼을 제공합니다. 또한, Xenopus 모델 시스템은 또한함으로써 면역 감시를 탈출 자신의 클래스 구이 분자를 아래로 조절이 종양에 대한 응답을 생성하는 gp96의 능력을 탐험 마우스에 대한 매력적인 대안을 제공합니다. 최근, 우리는 항원 제시 세포 (APCs)로 복막 leukocytes를 사용하여 Xenopus 클론에서 입양 세포 전송 분석을 개발하고, 같이 가지고 가벼운 histocompatibility 피부 항원에 대한뿐만 아니라 Xenopus thymic 종양 15에 대한 생체내에 gp96 수있는 최고급 CD8 T 세포 응답 클래스 구이 분자를 표현하지 않습니다 / 0. 우리는 여기서 복막 leukocytes의 이끌어 냄, pulsing과 입양 전송뿐만 아니라 피부 이식 및 종양 이식 assays 포함하여 이러한 assays을 수행하기 위해 관련된 방법론을 설명합니다. 또한 우리는 유동세포계측법 피부 제거 및 안티 종양 반응에 관여 효과기 인구의 자세한 특성화를 허용 확산 assays에 사용되는 주변 혈액 leukocytes의 수확과 분리를 설명하고 있습니다.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

개구리<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 항원에 특정한 CD8 T 세포 응답을 촉진하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능을 탐험에 대한 매력적인 대안이 아닌 포유 동물 모델을 제공합니다. 우리는 방법을 연구 제시<em&gt; 생체내에</emgp96로 피부 종양 항원의 교차 프레 젠 테이션&gt; 촉진.

비교적 생체내에</em개구리의 gp96 Adjuvanticity의> 학습 Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K 조회수.  University of Rochester. 개구리 Xenopus laevis 항원에 특정한 CD8 T 세포 응답을 촉진하기 위해 gp96로 열 충격 단백질의 기능을 탐험에 대한 매력적인 대안이 아닌 포유 동물 모델을 제공합니다. 우리는 방법을 연구 제시 생체내에 촉진.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

햄스터의 지느러미 피부에 피부 Leishmaniasis : Antileishmanial 약물의 상영을위한 유용한 모델

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

비교적 생체내에 학습 Xenopus laevis