이러한 기술의 성공적인 적용은 약리학적 시험의 운동 평가 또는 형태학적으로 그대로 태반을 통해 제노바이오틱 오염 물질의 통과를 허용할 것이다. 설치류 태반 관류 기술은 여러 화합물이 단일 댐의 조직을 사용하여 평가 될 수 있기 때문에 약리학적 또는 독성 연구의 더 높은 처리량을 허용합니다. 이 기술을 시연하는 것은 제 실험실에서 대학원생인 Jeanine D'Errico가 될 것입니다.
절차를 시작하기 전에 모든 챔버, 바늘, 유리 마이크로 파이프, 튜브 및 저수지를 따뜻하게 생리용염 용액 또는 PSS로 조심스럽게 채우고 필요에 따라 미세한 전달 파이펫으로 기포를 조심스럽게 제거하십시오. 파이펫 내의 유체를 고정하기 위해 3방향 스톱콕을 모두 오프 위치로 돌립니다. 자궁 캐니네이션을 위해 준비된 두 개의 유리 마이크로피펫과 배꼽 캐니네이션으로 지정된 두 개의 무딘 팁 바늘에 하나의 넥타이를 놓습니다.
그런 다음 챔버 이동 중에 손실을 방지하기 위해 관계를 확보하십시오. 마취 임신 일에 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후 20 여성 임신 쥐, 복부에서 하나의 자궁 경적을 들어 올려 동물 외부에, 먼 곳에서 뿔을 확산. 편조 실크 봉합사를 사용하여 자궁 뿔이 있는 봉합사 내부의 난소를 포함하여 뿔의 질과 난소 끝에 있는 자궁 동맥을 묶습니다.
외과 가위를 사용하여 난소 넥타이의 근근 면과 질 넥타이의 탈경면을 절개하십시오. 자궁 경적을 실리콘 고무가 늘어선 해부 접시에 옮기고 차가운 PSS로 채워져 있습니다. 난소 면이 왼쪽과 질의 측면을 오른쪽으로 누르면 자궁 경적을 통해 해부핀을 실리콘 고무로 부드럽게 밀어 자궁을 안정시합니다.
경적 의 중심에 모계 태반 태아 단위를 선택합니다. 미세 한 집게와 가위를 사용 하 여, 탯줄을 피하기 위해 주의 태반의 태아 표면에서 양수 막을 제거. 태아 새끼를 분리하기 위해 탯줄을 풀고 리디칭하십시오.
배꼽 동맥과 정맥을 식별 한 후, 부드럽게 분리하고 배꼽 혈관을 리게이트합니다. 그런 다음 탯줄 정맥을 탯줄 동맥보다 약간 짧게 잘라 식별의 용이성을 위해. 그리고 자궁 동맥과 정맥을 외과 가위로 장식하십시오.
자궁 동맥 해부학 혈류의 올바른 방향을 유지, 해부 현미경에서 따뜻한 산소 PSS로 채워진 수정 된 고립 된 혈관 챔버에 태반 단위를 배치. 각 손에 미세 집게 한 쌍을 사용하여, 유리 마이크로 파이프에 자궁 동맥의 근위 및 탈구 끝을 누를 수 있습니다. 이전에 배치 된 멸균 나일론 봉합사로 동맥을 단단히 고정하십시오.
23 게이지 무딘 바늘에 배꼽 동맥을 캐누레이하고 고정하십시오. 그런 다음 25 게이지 무딘 바늘에 배꼽 정맥을 캔누킹하고 고정하고 기포를 방지하기 위해 모든 스톱콕과 튜브를 백필합니다. 시스템의 공기 볼루스가 세포 고민으로 이어지고 태반 내의 카운터 전류 흐름을 제거하기 때문에 모든 스톱콕, 카누라 및 기포 튜브를 확인하는 것을 기억하십시오.
그림에 따라 모든 튜브를 연결합니다. 작은 계량 보트를 모계 자궁 동맥의 단경 수액 아래에 놓고 태아 배꼽 정맥의 바늘 캐너레이션 아래에 배치하여 절차 과정에서 나타날 유출물을 잡으세요. 나중에 분석을 위해 유출물을 위해 수집 플레이트를 준비합니다.
스톱콕을 열어 튜빙을 통해 태반쪽으로 유체가 흐를 수 있도록 하고 연동 펌프, 압력 제어 및 압력 모니터를 켭니다. 압력 모니터에서 판독된 수은80mm로 천천히 압력을 증가시면 됩니다. 자궁 동맥에 유체 흐름을 허용하기 위해 스톱콕을 천천히 엽니다.
실험 전반에 걸쳐 유체 부피를 유지하기 위해 모든 저장소를 리필합니다. 조직이 30분 동안 평형화한 후 혈관이 새로운 유체 흐름에 적응할 수 있도록 하고, 두 배 모두에서 10분 동안 유출물을 수집하여 기준관류를 확립한다. 자궁 동맥과 배꼽 정맥을 통해 나타나는 유체의 양을 측정합니다.
기준선 수집 기간이 끝나면 자궁 동맥내로 실험적 치료를 투여한다. 그런 다음 주입 후 총 180 분 동안 10 분마다 황산 자궁 동맥 및 태아 배빌레 정맥 유출물에서 샘플을 수집합니다. 유체 샘플 내의 오염 물질을 측정합니다.
에반스 블루 염료가 있는 관류는 시스템을 테스트하고 태아 구획으로의 오염물질 전달을 방지하기 위한 적절한 유체 및 태반 장벽 기능을 시각화하여 염료가 이 시스템 내의 태반 조직에 도달하고 퍼펙트한 것으로 나타났습니다. 자세히 조사하자마자 에반스 블루 염료가 태아 배꼽 정맥에 들어가지 않은 것은 분명하며, 에반스 블루 염료는 알부민에 묶여 있기 때문에 예상됩니다. 본 대표적인 실험에서, 폴리스티렌 주입 후 10분 이내에 태아 구획으로의 감소된 유체 전달이 확인되었다.
폴리스티렌은 태아 구획으로 옮겨진 후 20분 만에 최고조에 달해 90분 동안 계속되었습니다. 캐니옹 중에 기억해야 할 가장 중요한 것은 천천히 가는 것입니다. 파이펫과 조직은 매우 섬세하며 쉽게 깨지거나 찢어질 수 있습니다.
이 방법론은 응용을 계량함으로써 태반 생리학뿐만 아니라 물질 전좌를 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
