Navios EX 유세포분석기를 사용하기 위해 수치 준비 및 정밀 병리학 서비스(텍사스주 샌안토니오)에 도움을 준 David Rodriguez에게 감사드립니다.

모든 절차는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행해야 합니다.
1. TCPP 원액의 제조, 1.0 mg/mL
참고: 매월 준비할 수 있습니다.
<ol><li>분석 저울, 주걱 및 계량 용지를 사용하여 49.0-50.9mg의 TCPP를 계량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다. 측정된 TCPP 양을 빛으로부터 보호해 두십시오. 알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오.</li>
	<li>1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 정제수 및 이소프로판올(IPA)의 필요한 양을 결정합니다. 정제수와 이소프로판올을 100mL 유리 비커에 넣고 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 덮습니다.</li>
	<li>1.1단계에서 칭량한 TCPP의 양을 기준으로 표 1 에서 필요한 중탄산나트륨의 양을 결정합니다.</li>
	<li>분석 저울, 주걱 및 칭량지를 사용하여 1.3단계에서 결정된 필요한 양의 중탄산나트륨을 칭량합니다. 무게를 밀리그램의 1/10로 반올림합니다. 알림: 무게 판독값이 불안정한 경우 정적 건을 사용하십시오.</li>
	<li>정제수와 이소프로판올이 들어있는 100 mL 비이커에 중탄산나트륨을 넣는다. 증발로부터 보호하기 위해 파라 필름으로 용액을 덮으십시오.</li>
	<li>1.5단계의 용액을 교반 플레이트에 놓고 용해될 때까지 저어줍니다(약 10분)</li>
	<li>pH를 측정하여 단계 1.6의 중탄산나트륨 함유 용액의 pH가 9에서 10 사이인지 확인합니다.</li>
	<li>단계 1.1에서 칭량한 TCPP를 단계 1.7의 용액에 천천히 첨가하고 용해될 때까지 계속 교반합니다(~30분). 이 단계에서 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>유리 또는 폴리프로필렌 용기에 담아 실온에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
</ol>2. 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) 및 hemisodium salt buffer solution, 0.1 M, pH 6.0-6.2 ("MES buffer")의 제조
알림: 사용 당일에 준비하여 실온에 보관해야 합니다.
<ol><li>MES 헤미소듐염 2.50g의 무게를 측정하여 150mL 플라스틱 병에 넣습니다.</li>
	<li>정제수 121mL를 넣고 고체가 보이지 않을 때까지 수동으로 흔들어 녹입니다.</li>
	<li>MES 버퍼의 pH를 측정하여 6에서 6.2 사이인지 확인합니다.</li>
	<li>당일 사용할 수 있도록 실온에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) 분말
<ol><li>냉동실에서 EDC 분말을 꺼내 5단계에서 사용할 때까지 실온에 둡니다.</li>
</ol>4. 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 TCPP 용액의 결합
<ol><li>상기 단계 2에서 제조된 0.1 M MES 완충용액 4.3 mL를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 넣는다.</li>
	<li>아민 작용화 폴리스티렌 비드 현탁액(10μm, 2.5% w/v)을 최대 속도로 60초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>이 갓 와류된 비드 현탁액 288μL를 4.1단계의 MES 버퍼에 추가합니다.</li>
	<li>MES/비드 용액을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>1단계에서 준비한 1mg/mL TCPP 용액을 최대 속도로 60초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>1.20 mL의 갓 소용돌이 된 TCPP 원액을 4.4단계의 MES/비드 현탁액에 추가합니다.</li>
	<li>MES/비드/TCPP 서스펜션을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>EDC 용액이 준비되는 동안 튜브를 호일로 덮으십시오.</li>
</ol>5. N-(3-dimethlyaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) hydrocholoride (HCl) 원액의 제조
알림: EDC 용액은 부패하기 쉬우므로 준비 직후에 사용해야 합니다.
<ol><li>정제수 20.0mL를 새 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>3단계에서 EDC HCl 200mg의 무게를 측정하고 물에 첨가합니다(5.1단계).</li>
	<li>EDC HCL을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이치면 투명한 용액이 생성됩니다.</li>
</ol>6. EDC HCl/MES 작업 용액 준비
알림: EDC HCl/MES 용액은 부패하기 쉬우므로 준비 직후에 사용해야 합니다.
<ol><li>54.0mL의 MES 완충 용액(2단계에서 준비)을 150mL 플라스틱 병에 추가합니다.</li>
	<li>6.0mL의 EDC HCl 원액(단계 5에서 제조)을 MES 완충액에 넣고 10초 동안 진탕하여 혼합합니다.</li>
</ol>7. TCPP로 비드 라벨링
<ol><li>4.5mL의 EDC 작업 용액(6단계에서)을 MES 버퍼에 비드와 TCPP가 들어 있는 15mL 폴리프로필렌 튜브에 추가합니다(4.7단계).</li>
	<li>튜브를 실온에서 35시간 동안 16rpm으로 반전 회전자에 넣고 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 1,000×g으로 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS) 0.8mL에 비드를 재현탁합니다.</li>
	<li>비드 용액을 1 mL 피펫이 있는 호박색 폴리프로필렌 바이알에 옮기고, 추가 사용이 될 때까지 4°C에서 보관한다. 알림: 이 시점에서 비드는 최소 3개월 동안 안정적입니다.</li>
</ol>8. 유세포 분석에 의한 TCPP 비드의 품질 검사(QC)
알림: QC는 TCPP 비드의 중간 형광 강도(MFI)가 의도한 용도에 충분히 밝은지 여부와 절차에서 생성되는 미립자의 양에 중점을 두어야 합니다. 자세한 내용은 대표 결과 섹션을 참조하세요.
<ol><li>5mL 폴리스티렌 튜브 1개를 "TCPP 음성 비드"로 표시합니다. 알림: 네거티브 비드는 라벨링에 사용되는 아민 기능화 비드와 다릅니다. 재료 표를 참조하십시오.</li>
	<li>다른 튜브에 "TCPP 양성 비드"라는 레이블을 붙입니다.</li>
	<li>다른 튜브를 "무지개 구슬"로 표시하십시오.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 HBSS 300μL를 "TCPP 음성 비드" 및 "TCPP 양성 비드"로 표시된 튜브에 분취합니다.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 HBSS 500μL를 "레인보우 비드"라고 표시된 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>기능화되지 않은 폴리스티렌(표지되지 않은) 비드 현탁액을 최대 속도(2-3초)로 잠깐 소용돌이치고 10μL를 "TCPP 음성 비드"라고 표시된 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>TCPP 표지 비드 현탁액(7.5단계에서 마무리됨)을 최대 속도로 잠깐 소용돌이치고 3μL를 "TCPP 양성 비드" 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>레인보우 비드 서스펜션을 최대 속도로 잠깐 소용돌이 치고 "레인보우 비즈" 튜브에 두 방울을 떨어뜨립니다.</li>
	<li>모든 튜브를 얼음 위에 놓고 덮고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>유세포 분석기의 적절한 일일 시동 절차를 시작하고 QC를 수행하여 최적의 유체 및 레이저 정렬을 확인합니다. 참고: 프로토콜의 이 부분에서는 작업자가 광 산란 및 형광 강도를 표준화하는 절차와 올바른 보상 매트릭스를 계산하는 기본 원칙을 포함하여 사용 가능한 유세포 분석기 사용에 대해 교육을 받았다고 가정합니다.</li>
	<li>레인보우 비드와 TCPP 비드를 서로 다른 실행 사이에 전압 설정을 변경하지 않고 실행합니다.<ol><li>레인보우 구슬 이벤트 10,000개를 실행하고 수집하세요.</li>
		<li>물로 헹구고 TCPP 음성 비드의 10,000개 이벤트를 수집합니다.</li>
		<li>물로 헹구고 TCPP 양성 비드의 10,000개 이벤트를 수집합니다.</li>
		<li>1분 동안 물로 헹굽니다. 알림: TCPP 비드를 실행한 후 물로 헹구는 것이 중요합니다. TCPP가 세포분석기의 라인에서 헹구어지지 않으면 잔류 TCPP가 획득할 다음 튜브의 세포에 라벨을 붙일 수 있습니다.</li>
		<li>세포분석기에 대한 제조업체의 지침에 따라 적절한 세척 및 종료 프로토콜을 수행합니다. 참고: 대표적인 결과는 그림 1을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>9. 비드 여과
참고: 유세포 분석(8단계)에 의한 비드의 QC가 높은 비율의 미립자(70% 이상)를 나타내는 경우 아래 프로토콜을 사용하여 비드 현탁액을 필터링하는 것이 좋습니다(그림 2).
<ol><li>7.5단계에서 완성된 TCPP 비드 현탁액 0.8mL에 얼음처럼 차가운 HBSS 3.20mL를 추가합니다(5배 희석 생성).</li>
	<li>희석된 비드 현탁액을 최대 속도로 15초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>일회용 5mL 주사기에서 플런저를 제거합니다.</li>
	<li>유리 섬유 팁 필터(5μm, 직경 13mm)로 주사기를 맞춥니다.</li>
	<li>주사기에 HBSS 4mL를 추가합니다.</li>
	<li>0.5 mL의 와동된 희석된 비드 현탁액을 첨가한다(단계 9.2).</li>
	<li>플런저를 사용하여 주사기/필터 설정을 통해 약 2방울/초의 속도로 현탁액을 여과합니다.</li>
	<li>약 5방울/s의 속도로 필터를 통해 신선한 HBSS 2mL를 주사기에 끌어당겨 비드를 세척합니다.</li>
	<li>HBSS를 약 2방울/초의 속도로 폐기물 용기에 다시 밀어 넣습니다.</li>
	<li>필터에서 비드를 제거하려면 필터를 통해 주사기에 신선한 HBSS 5mL를 더 넣습니다.</li>
	<li>주사기에서 필터를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>주사기에서 비드 현탁액을 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브로 꺼냅니다.</li>
	<li>필터를 주사기에 다시 놓고 9.10-9.12단계를 네 번 더 반복합니다. 그런 다음 필터와 주사기를 버리십시오.</li>
	<li>9.1단계의 모든 비드가 필터링될 때까지 9.2-9.13단계를 반복합니다. 매번 새 주사기와 필터를 사용하십시오.</li>
	<li>여과된 비드 현탁액을 실온에서 1,000 × g 에서 10분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>각 50mL 튜브의 상층액을 흡인하고 비드를 부드럽게 재현탁하여 0.5mL의 신선한 HBSS에 결합합니다.</li>
	<li>p1,000 마이크로피펫이 있는 비드를 새로운 호박색, 유리 또는 폴리프로필렌 바이알에 옮기고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>8단계를 반복하여 여과된 비드 현탁액에서 TCPP 관련 미립자의 비율이 감소했는지 확인합니다. 대표적인 결과는 그림 3을 참조하십시오.</li>
</ol>

유세포 분석에서의 Porphyrin-modified beads

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+esters+of+N-hydroxysuccinimide+in+peptide+synthesis.">The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2013).</li><li>El-Faham, A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+coupling+reagents,+more+than+a+letter+soup.">Peptide coupling reagents, more than a letter soup.</a> Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization,+calibration,+and+control+in+flow+cytometry.">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2005).</li><li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy.">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li><li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+photodynamic+therapy:+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment.">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li><li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma:+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative.">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li></ol>

모든 저자는 bioAffinity Technologies의 직원입니다.

암 진단 및 치료학에 포르피린이 많이 적용되고 있음에도 불구하고2, 일차 인간 조직에서 암성 대 비암성 세포 집단을 식별하기 위한 유세포 분석 시약으로서의 포르피린의 잠재적 용도에 대한 문헌은 제한적이다24,25,26. 인간 객담24,27의 유세포 분석에 대한 우리의...

포르피린은 형광 및 종양 표적화 특성으로 인해 생물 의학 분야에서 수년 동안 관심의 대상이었습니다 1,2,3. 광역학 요법(PDT) 및 초음파 요법(SDT)과 같은 치료 적용은 암 환자에게 포르피린의 전신 투여, 종양에 약물 축적, 특정 파장 또는 초음파의 레이저 광에 대한 종양의 국소 노출을 수반합니다. 레이저 광선 또는 초음파에 노출되면 포르피린에 의한 활성 산소 종의 생성과 그에 따른 세포 사멸이 일어난다 4,5. 광역학 진단(photodynamical, PDD)에서 포르피린 형광은 암세포와 정상세포를 구별하는 데 사용된다6. 이러한 맥락에서, 전구체 인 5- 아미노 레불린 산 (5-ALA)의 전신 또는 국소 주사시 종양에 축적되는 천연 형광 포르피린 인 protoporphyrin IX는 위장관 간질 종양, 방광암 및 뇌암을 확인하는 데 사용됩니다 7,8. 최근에는 다발성 골수종에서 최소 잔류 질환을 검출하기 위한 접근법으로 5-ALA 치료법이 연구되었다9. 우리 연구실은 인간 객담 샘플에서 폐암 세포와 암 관련 세포를 선택적으로 염색하는 능력을 위해 테트라아릴 포르피린 TCPP(5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23 H-porphine)를 사용해 왔으며, 이는 슬라이드 기반 및 유세포 분석 분석 분석에서 활용된 특성이다10.
일부 포르피린은 치료 및 진단제로 사용될 수 있다는 점에서 이중 기능성이다 2,11. 생물 의학 연구에서, 이러한 이중 기능성 포르피린은 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 다른 화합물 12,13,14,15,16의 존재에 의해 어떻게 영향을 받는지뿐만 아니라 암세포를 선택적으로 표적화하고 죽이는 능력이 어떻게 작용하는지 평가하는 데 사용됩니다. 포르피린의 세포 흡수와 세포 독성은 모두 고처리량 방식으로 유세포 분석 플랫폼에서 측정할 수 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 및 방출 스펙트럼은 복잡하지만 대부분의 유세포 분석 플랫폼은 이를 정확하게 식별할 수 있는 장비를 갖추고 있습니다. 형광 포르피린의 흡수 스펙트럼은 Soret 밴드로 알려진 380-500 nm 범위의 강한 흡수 밴드를 특징으로합니다. 2-4 개의 약한 흡수 밴드는 일반적으로 500-750 nm 범위 (Q 밴드)에서 관찰됩니다 17. 대부분의 유세포 분석기에 존재하는 청색 488nm 레이저 또는 보라색 레이저(405nm)는 포르피린을 여기시키기 위해 적절한 파장의 빛을 생성할 수 있습니다. 포르피린의 방출 스펙트럼은 전형적으로 600-800 nm 범위(18)에서 피크를 나타내는데, 이는 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 피코에리트린(PE) 형광단과는 스펙트럼 중첩이 거의 없지만, 알로피코시아닌(APC)과 같이 자주 사용되는 다른 형광단뿐만 아니라 PE-Cy5 등과 같은 탠덤 형광단과는 상당히 겹친다. 따라서 다색 유세포 분석에서 포르피린을 사용할 때 포르피린의 형광을 측정하도록 지정된 채널이 아닌 다른 채널에서 형광의 유출을 적절하게 보정하기 위해 단일 형광단 제어가 필수적입니다.
이상적으로, 형광단 패널에 대한 스필오버 매트릭스를 계산하는 데 사용되는 단일 형광단 대조군("보상 대조군"이라고도 함)은 샘플과 동일한 세포 유형으로 구성되어야 합니다. 그러나 시작할 샘플이 거의 없거나 샘플 내의 대상 모집단이 매우 작은 경우(예: 질병의 초기 단계에서 최소 잔류 질병 또는 암세포를 확인하려는 경우) 이러한 목적으로 샘플을 사용하는 것은 최적이 아닙니다. 세포에 대한 유용한 대안은 샘플을 분석하는 데 사용되는 동일한 형광단과 결합된 비드입니다. 많은 이러한 비드가 시판되고 있으며; 이러한 비드는 원하는 형광단(prelabeled fluorophore-specific beads)19,20으로 사전 표지되거나 형광 표지된 항체가 부착될 수 있습니다(항체 캡처 비드)20,21. 상업적인 보상 구슬은 많은 형광단에 사용할 수 있지만 이러한 구슬은 기초 및 임상 연구에서 사용이 증가하고 있음에도 불구하고 포르피린에 사용할 수 없습니다.
시료 보존 및 적절한 크기의 양성 대 음성 모집단 외에도, 비드를 보상 대조군으로 사용하는 것의 다른 이점은 준비의 용이성, 낮은 배경 형광 및 시간 경과에 따른 우수한 안정성입니다22. 비드를 보상 대조군으로 사용할 때의 잠재적인 단점은 비드에 포획된 형광 항체의 방출 스펙트럼이 세포를 표지하는 데 사용된 동일한 항체의 방출 스펙트럼과 다를 수 있다는 것입니다. 이것은 스펙트럼 유세포 분석기(20)를 사용할 때 특히 중요할 수 있다. 따라서 보상 제어로서의 비드의 개발은 비드가 개발되는 분석에 사용될 유세포 분석기에서 수행되어야 합니다. 또한, 비드의 개발에는 동일한 형광 염색 시약으로 표지된 세포와의 비교가 포함되어야 합니다.
여기에서는 검출 채널의 중간 형광 강도가 객담의 TCPP 표지 세포의 형광 강도와 비슷한 TCPP 아민 기능화 폴리스티렌 보상 비드의 제조와 유세포 분석을 위한 보상 대조군으로 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 동등하고 기능화되지 않은 비드의 자가형광은 음성 형광 보상 대조군으로 사용하기에 충분히 낮았습니다. 또한, 이들 비드는 거의 1년 동안 보관시 안정성을 입증하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene</td>
			<td>Research Products International&#160;&#160;</td>
			<td>ZC1028-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 &#956;m diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>APX-100-10</td>
			<td>Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL, Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>with appropriate rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N&#39;- ethylcarbodiimide hydrochloride), &#8805;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03450-1G</td>
			<td>CAS No:&#160; 25952-53-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 &#181;m, 13 mm diameter)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1190M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423830010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (22- (N- mopholino)- N&#39;- ethanesulfonic acid, hemisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0164</td>
			<td>CAS No:&#160; 117961-21-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios EX flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter (UB 10 Ultra Basic)</td>
			<td>Denver Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller (Drummond)</td>
			<td>Pipete.com</td>
			<td>DP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,&#160; 2.5% w/v, 8.0-12.9 &#181;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-100-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes, 15mL, conical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tubes, round bottom&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9207381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>CAS No:&#160; 144-55-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)&#160; Frontier Scientific&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-393-68</td>
			<td>CAS No:&#160; 14609-54-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark Plate Reader (or similar)</td>
			<td>Tecan Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyrin-modified beads for use as compensation controls in flow cytometry

유세포 분석은 형광 측정을 기반으로 다양한 세포 집단을 신속하게 특성화하고 정량화할 수 있습니다. 세포는 먼저 하나 이상의 형광 시약으로 염색되며, 각각은 세포 표면 항원 발현과 같은 표현형 특성에 따라 세포에 선택적으로 결합하는 상이한 형광 분자(형광단)로 기능화됩니다. 세포에 결합된 각 시약의 형광 강도는 지정된 파장 범위를 감지하는 채널을 사용하여 유세포 분석기에서 측정할 수 있습니다. 여러 형광단을 사용하는 경우 개별 형광단의 빛이 원치 않는 검출 채널로 흘러 들어가는 경우가 많으며, 이는 보상이라는 프로세스에서 형광 강도 데이터를 수정해야 합니다. 
보상 제어 입자, 일반적으로 단일 형광단에 결합된 폴리머 비드는 세포 표지 실험에 사용되는 각 형광단에 필요합니다. 유세포 분석기의 보상 입자 데이터는 형광 강도 측정에 보정을 적용하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 형광 시약인 메조테트라(4-카르복시페닐) 포르핀(TCPP)과 공유 작용화된 폴리스티렌 보상 비드의 준비 및 정제와 유세포 분석 보상에서의 적용에 대해 설명합니다. 이 작업에서, 아민 작용화 폴리스티렌 비드를 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC(N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염)로 pH 6 및 실온에서 16시간 동안 교반하면서 처리했습니다. TCPP 비드를 원심분리에 의해 단리하고, 보관을 위해 pH 7 완충액에 재현탁시켰다. TCPP 관련 미립자는 부산물로 관찰되었습니다. 이러한 미립자의 수는 선택적 여과 프로토콜을 사용하여 줄일 수 있습니다. 생성된 TCPP 비드는 다중 형광단으로 표지된 인간 객담 세포를 사용한 실험에서 보상을 위해 유세포 분석기에서 성공적으로 사용되었습니다. TCPP 비드는 냉장고에 300일 동안 보관한 후 안정적인 것으로 입증되었습니다.

Porphyrins have been of interest for many years in the biomedical field owing to their fluorescence and tumor-targeting properties1,2,3. Therapeutic applications such as photodynamic therapy (PDT) and sonodynamic therapy (SDT) entail the systemic administration of a porphyrin to a cancer patient, the accumulation of the drug in the tumor, and the localized exposure of the tumor to a laser light of a specific wavelength or ultrasound. The exposure to laser light or ultrasound leads to the generation of reactive oxygen species by the porphyrin and subsequent cell death4,5. In photodynamic diagnosis (PDD), porphyrin fluorescence is used to distinguish cancer cells from normal cells6. In this context, protoporphyrin IX, a natural fluorescent porphyrin that accumulates in tumors upon the systemic or local injection of its precursor, 5-aminolevulinic acid (5-ALA), is used to identify gastrointestinal stromal tumors, bladder cancer, and brain cancer7,8. More recently, 5-ALA treatment was explored as an approach to detect minimal residual disease in multiple myeloma9. Our laboratory has been using the tetraaryl porphyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23H-porphine) for its ability to selectively stain lung cancer cells and cancer-associated cells in human sputum samples, which is a property that has been exploited in slide-based and flow cytometric diagnostic assays10.
Some porphyrins are bifunctional in that they can be used as therapeutic and diagnostic agents2,11. In biomedical research, such bifunctional porphyrins are used to evaluate how their ability to selectively target and kill cancer cells is a function of their structure as well as how it is affected by the presence of other compounds12,13,14,15,16. Both the cellular uptake of porphyrins and their cytotoxicity can be measured on a flow cytometric platform in a high-throughput manner. The absorption and emission spectra of fluorescent porphyrins are complex, but most flow cytometric platforms are equipped to correctly identify them. The absorption spectrum of fluorescent porphyrins is characterized by a strong absorption band in the 380-500 nm range, known as the Soret band. Two to four weaker absorption bands are generally observed in the 500-750 nm range (Q bands)17. A blue&#160;488 nm laser, present in most flow cytometers, or a violet laser (405 nm) can generate light of the appropriate wavelength to excite porphyrins. The emission spectra of porphyrins typically display peaks in the 600-800 nm range18, which results in very little spectral overlap with fluorescein isothiocyanate or phycoerythrin (PE) fluorophores but considerable overlap with other often-used fluorophores, such as allophycocyanin (APC), as well as tandem fluorophores, such as PE-Cy5 and others. Therefore, when using porphyrins in multi-color flow cytometry assays, single-fluorophore controls are essential to adequately correct the spillover of fluorescence in channels other than the one designated to measure the porphyrin&#39;s fluorescence.
Ideally, the single-fluorophore controls used to calculate the spillover matrix for a panel of fluorophores (also called &#34;compensation controls&#34;) should consist of the same cell type(s) as the sample. However, using the sample for this purpose is not optimal if there is very little sample to begin with or if the target population within the sample is very small&#160;(for example, if one wants to look at minimal residual disease or cancer cells at the early stages of the disease). A useful alternative to cells is beads coupled with the same fluorophore that is used to analyze the sample. Many such beads are commercially available; these beads are either prelabeled with the desired fluorophore (prelabeled fluorophore-specific beads)19,20, or a fluorescently labeled antibody can be attached to them (antibody capture beads)20,21. While commercial compensation beads are available for many fluorophores, such beads are unavailable for porphyrins, despite their increasing use in basic and clinical research.
In addition to sample preservation and appropriately sized positive versus negative populations, the other advantages of using beads as compensation controls are the ease of preparation, low background fluorescence, and excellent stability over time22. The potential disadvantage of using beads as a compensation control is that the emission spectrum of the fluorescent antibody captured on beads may differ from that of the same antibody used to label the cells. This may be of specific importance when using a spectral flow cytometer20. Therefore, the development of beads as a compensation control needs to be performed on the flow cytometer that will be used for the assay for which the beads are developed. Moreover, the development of the beads needs to include a comparison with cells labeled with the same fluorescent staining reagent.
Here, we describe the preparation of TCPP amine-functionalized polystyrene compensation beads, whose median fluorescence intensity in the detection channel was comparable to that of TCPP-labeled cells in sputum, and their use as compensation controls for flow cytometry. The autofluorescence of equivalent, non-functionalized beads was sufficiently low for their use as negative fluorescence compensation controls. In addition, these beads demonstrated stability in storage for nearly 1 year.

저자 스포트라이트: Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Control in Flow Cytometry  

유세포 분석에서 보상 대조군으로 사용하기 위한 포르피린 변형 비드

We developed polystyrene beads modified with the porphyrin TCPP as compensation controls and multicolor flow cytometry. The beads used in this protocol have fluorescence intensity comparable to TCPP stain cells and still passed through the flow cytometer. We accomplished that and are currently working on better methods to remove the particulate byproduct.Porphyrin-modified compensation beads were preferable to TCPP stained cells as compensation controls. These speeds were stable over months without significant loss of fluorescence. Porphyrins are known to stain cancer cells selectively.The research combines the selectivity of porphyrins with quantitative flow cytometry as a powerful platform for high-throughput analysis of human samples.

비드의 TCPP 라벨링을 위한 이 프로토콜은 비교적 빠르고 효율적입니다. 도 1은 유세포 분석에 의해 결정된 TCPP 비드 라벨링 공정의 대표적인 결과를 보여준다. 도 1A는 TCPP를 검출하기 위한 적절한 채널에서 검출된 레인보우 비드의 표준화된 프로파일을 보여준다. 이 비드는 유세포 분석기에 의한 TCPP 검출을 위한 레이저 전압의 표준화를 위한 QC 역할을 ...

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이 프로토콜은 아민 작용화 폴리스티렌 비드와 포르피린 TCPP 및 아미드 커플링 시약 EDC의 반응에 의해 유세포 분석을 위한 포르피린 기반 보상 비드를 준비하는 방법을 설명합니다. 미립자 부산물을 줄이기 위해 여과 절차가 사용됩니다.

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

우리는 보상 대조군 및 다색 유세포 분석으로 포르피린 TCPP로 변형된 폴리스티렌 비드를 개발했습니다. 이 프로토콜에 사용된 비드는 TCPP 염색 세포와 유사한 형광 강도를 가지며 여전히 유세포 분석기를 통과합니다. 우리는 이를 달성했으며 현재 미립자 부산물을 제거하는 더 나은 방법을 연구하고 있습니다.포르피린-변형된 보상 비드는 보상 대조군으로서 TCPP 염색된 세포보다 바람직하였다. 이 속도는 형광의 큰 손실 없이 몇 달 동안 안정적이었습니다. 포르피린은 암세포를 선택적으로 염색하는 것으로 알려져 있습니다.이 연구는 포르피린의 선택성과 정량적 유세포 분석을 결합하여 인간 샘플의 고처리량 분석을 위한 강력한 플랫폼입니다.

porphyrin-modified-beads-for-use-as-compensation-controls-flow

Research

JoVE Journal

Chemistry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

1.4K 조회수.  bioAffinity Technologies. 우리는 보상 대조군 및 다색 유세포 분석으로 포르피린 TCPP로 변형된 폴리스티렌 비드를 개발했습니다. 이 프로토콜에 사용된 비드는 TCPP 염색 세포와 유사한 형광 강도를 가지며 여전히 유세포 분석기를 통과합니다. 우리는 이를 달성했으며 현재 미립자 부산물을 제거하는 더 나은 방법을 연구하고 있습니다.포르피린-변형된 보상 비드는 보상 대조군으로서 TCPP 염색된...

비디오: 저자 스포트라이트: Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Control in Flow Cytometry  

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or more fluorescent reagents, each functionalized with a different fluorescent molecule (fluorophore) that binds to cells selectively based on their phenotypic characteristics, such as cell surface antigen expression. The intensity of fluorescence from each reagent bound to cells can be measured on the flow cytometer using channels that detect a specified range of wavelengths. When multiple fluorophores are used, the light from individual fluorophores often spills over into undesired detection channels, which requires a correction to the fluorescence intensity data in a process called compensation. 
Compensation control particles, typically polymer beads bound to a single fluorophore, are needed for each fluorophore used in a cell labeling experiment. Data from compensation particles from the flow cytometer are used to apply a correction to the fluorescence intensity measurements. This protocol describes the preparation and purification of polystyrene compensation beads covalently functionalized with the fluorescent reagent meso-tetra(4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) and their application in flow cytometry compensation. In this work, amine-functionalized polystyrene beads were treated with TCPP and the amide coupling reagent EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride) at pH 6 and at room temperature for 16 h with agitation. The TCPP beads were isolated by centrifugation and resuspended in a pH 7 buffer for storage. TCPP-related particulates were observed as a byproduct. The number of these particulates could be reduced using an optional filtration protocol. The resultant TCPP beads were successfully used on a flow cytometer for compensation in experiments with human sputum cells labeled with multiple fluorophores. The TCPP beads proved stable following storage in a refrigerator for 300 days.

The protocol describes how porphyrin-based compensation beads for flow cytometry are prepared by the reaction of amine-functionalized polystyrene beads with the porphyrin TCPP and the amide coupling reagent EDC. A filtration procedure is used to reduce the particulate byproducts.

연구

화학

Preparation of Meso-Tetra(4-Carboxyphenyl) Porphine (TCPP) Stock Solution

To begin, weigh 49.0 to 50.9 milligrams of TCPP using an analytical balance. Round the weight to 1/10 of a milligram. Set the measured amount of TCPP aside, protected from light.Based on the amount of TCPP, add the required amounts of purified water and isopropanol to a 100 milliliter glass beaker and cover it with parafilm to protect it from evaporation. Next, weigh the required amount of sodium bicarbonate based on the amount of TCPP and add it to the 100 milliliter beaker containing purified water and isopropanol. Cover the solution with parafilm to protect it from evaporation, and place it on a stir plate for approximately 10 minutes.Once the contents are dissolved, ensure that the pH of the solution is between nine and 10. Next, carefully add the weighted TCPP, protect the solution from light, and stir it for approximately 30 minutes until dissolved. Store the solution in a polypropylene container at room temperature protected from light.

Meso-Tetra(4-Carboxyphenyl) Porphine (TCPP) 원액의 제조

Combining Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP Solution

Begin by adding 4.3 milliliters of 0.1 molar MES buffer solution to a 15 milliliter polypropylene tube. Then add 288 microliters of the vortexed amine functionalized polystyrene bead suspension to the 15 milliliter polypropylene tube containing MES buffer. Vortex the MES bead solution for 15 seconds at maximum speed.Next, vortex the one milligram per milliliter TCPP solution for 60 seconds at maximum speed. Then add 1.2 milliliters of this solution to the MES bead suspension. After vortexing the resultant suspension for 15 seconds, cover the tube with foil.

아민 기능화 폴리스티렌 비드와 TCPP 솔루션의 결합

Labeling Amine-Functionalized Polystyrene Beads with TCPP

To begin, add freshly prepared 4.5 milliliters of EDC working solution to a 15 milliliter polypropylene tube containing the amine-functionalized polystyrene beads and TCPP in MES buffer. Place the tube in an inverting rotator at 35 RPM for 16 hours at room temperature protected from light. Then, centrifuge it for 10 minutes.Aspirate the supernatant and re-suspend the beads in 0.8 milliliters of Hank's Balanced Salt Solution. Then, using a one milliliter pipette, transfer the bead solution to an amber polypropylene vial and store it at four degrees Celsius. The relationship between the particulate formation, the median, fluorescence intensity or MFI, and the bead TCPP/EDC ratio showed that with increasing ratios, the MFI increased until it formed a plateau.The particulates appeared only when EDC was used as a coupling reagent during the labeling procedure. Labeling the beads with TCPP alone resulted in much lower fluorescence intensity. When TCPP-labeled beads were tested after 300 days, no significant change in the MFI or in the particulate content was observed.The coupling of TCPP to the beads had a minimum effect on its fluorescence emission spectrum. However, its spectrum differed more from TCPP-labeled A549 lung cancer cells. In a multi-flora four labeled sputum sample, the TCPP-labeled beads worked equally well as the TCPP-stained A549 cells.

TCPP로 아민 기능화 폴리스티렌 비드 라벨링

Quality Check (QC) of the TCPP Beads by Flow Cytometry

Begin the quality check of the beads labeled as meso-tetra 4-carboxyphenyl porphine or TCPP beads in the flow cytometer by running and collecting 10, 000 events of the rainbow beads. Then perform a rinse with water and collect 10, 000 events of the TCPP negative beads. After rinsing with water again, collect 10, 000 events of the TCPP positive beads.Then perform a one minute water rinse before appropriate cleaning and shut down the flow cytometer. A representative outcome of the TCPP bead labeling process determined by flow cytometry is shown here with a standardized profile of rainbow beads. These beads serve as quality checks for standardizing the laser voltages to detect TCPP.The light scatter profile of amine functionalized polystyrene TCPP labeled beads was observed. The light scatter profile of non-functionalized beads was used as a negative bead control to calculate the compensation matrix. The population indicated by the red rectangle in the TCPP labeled beads was absent in the unlabeled bead suspension representing that the TCPP related particulates were not formed in the absence of TCPP and EDC.The fluorescence intensity of the labeled beads selected by the black gate was several logs higher than that of the unlabeled beads.

유세포 분석에 의한 TCPP 비드의 품질 검사(QC)

TCPP Bead Filtration

Begin the TCPP bead filtration by diluting 0.8 milliliters of the TCPP bead suspension with 3.20 milliliters of ice-cold Hanks'Balanced Salt Solution, or HBSS. Vortex the diluted bead suspension at maximum speed for 15 seconds. Then, remove the plunger from a disposable five-milliliter syringe and fit the syringe with a five-micrometer glass fiber tip filter having a 13-millimeter diameter.Next, add four milliliters of HBSS to the syringe before adding 0.5 milliliters of the vortexed diluted bead suspension. Using the plunger, filter the bead suspension through the syringe filter at approximately two drops per second. Then, wash the beads by drawing five milliliters of fresh HBSS into the syringe through the filter and pushing the HBSS out into the waste container at approximately two drops per second.To remove the beads from the filter, draw another five milliliters of fresh HBSS into the syringe through the filter. Then, remove the filter carefully from the syringe. After ejecting the bead suspension from the syringe into a 50-milliliter conical centrifuge tube, place the fresh filter back on the syringe and repeat the five-milliliter HBSS wash four times.Once done, discard the filter and syringe. Centrifuge the filtered bead suspensions at room temperature for 10 minutes at 1, 000g. Aspirate the supernatant from each 50-milliliter tube.Gently resuspend the beads and 0.5 milliliters of fresh HBSS. Transfer the combined beads with a P1000 micropipette to a new amber-colored glass vial, and store at four degrees Celsius. The filtration effect on a bead suspension comprising approximately 66%particulates is seen here.After filtration, the particulate content decreased to approximately 25%The adverse effects of filtration are the loss of beads and a slight loss in fluorescence intensity.