대표 결과에 나타난 데이터 수집에 기여해 주신 Kellie Breen Church 박사님, Michael Kreisman 씨, Jessica Jang 씨께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) R00 HD104994(R.B.M.)의 지원을 받았습니다.

모든 절차는 콜로라도 주립 대학(#3960)과 캘리포니아 대학 샌디에이고 기관 동물 관리 및 사용 위원회(S13235, PI Kellie Breen Church)의 승인을 받았습니다. 5마리의 성체 암컷과 2마리의 성체 수컷 C57/BL6 마우스(9-16주령)의 데이터가 대표 데이터 섹션에 묘사되어 있습니다. 암컷 마우스는 앞서 기술한 바와 같이 ICV 주사 및 채혈 3-4주 전에 난소 절제술을 하였다7. 실험 전에 이 쥐는 12시간 빛/12시간 어두운 빛 주기로 수용되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 사료와 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.
1. 개두술 시행
참고: 개두술은 실제 주사 하루 이상 전에 시행할 수 있으므로 실험 당일에 주입 과정이 더 빨라집니다.
<ol><li>아래에 설명된 대로 개두술을 위한 재료를 준비합니다.<ol><li>작업 표면에 깨끗한 벤치 패드나 드레이프 재료를 놓습니다. 이소플루란 기화기의 노즈 콘을 작업 표면에 테이프로 붙입니다(실험자와 가깝지만 반대쪽을 향함, 그림 1A 참조).</li>
		<li>멸균 된 날카로운 18G 바늘 끝에 실라스틱 튜브를 놓아 바늘 끝의 ~ 1mm가 튀어 나오도록합니다. 멸균 뭉툭한 바늘 끝에 실라스틱 튜브를 놓아 바늘 끝의 ~1mm가 튀어나오도록 합니다. 알림: 각 마우스에는 별도의 멸균 사전 포장된 바늘(날카롭고 뭉툭한 바늘)을 사용해야 합니다.</li>
		<li>전기 면도기, 요오드 스크럽, 멸균 거즈, 알코올 패드를 모아 주사 부위를 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명과 같이 바늘을 옆으로 2mm, 꼬리로 1mm 움직이는 연습을 합니다.<ol><li>눈금자와 펜을 사용하여 시작점(브레그마), 왼쪽 또는 오른쪽으로 2mm 표시, 마지막 표시에서 1mm 위에 다른 표시(주입 부위, 그림 1B 참조)를 종이에 표시합니다.</li>
		<li>바늘을 시작점에서 표시점 1, 표시점 2(브레그마에서 주입 부위까지)로 가이드 없이 이동이 반복될 수 있을 때까지 연습합니다. 참고: 여기에 설명된 좌표는 성인 C57/BL6 마우스에 효과적이지만 다른 균주 또는 연령 그룹은 조정이 필요할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명된 대로 개두술을 위해 마우스를 준비합니다.<ol><li>마우스를 유도 챔버에 넣고 의료용 산소에 3%-4% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 시술에 익숙해지고 연습하면 개두술 시술을 위해 이소플루란 노출의 총 지속 시간을 10분 미만으로 줄이십시오. 주의 : 이소플루란 노출은 인체 건강에 해롭습니다. 폐가스를 청소하는 수단으로 환기가 잘 되는 곳에서 승인되고 검사된 이소플루란 기화기를 사용하십시오.</li>
		<li>발가락 반사가 없으면 동물의 머리를 면도하십시오. 눈 윤활제를 바르십시오.</li>
		<li>마취를 유지하기 위해 머리를 노즈콘에 대고 마우스를 작업 표면에 놓습니다.</li>
		<li>공급자의 지시에 따라 부프레노르핀(0.6-0.8mg/kg 마우스 체중, 피하)과 같은 진통제를 투여합니다.</li>
		<li>요오드 용액에 적신 멸균 거즈로 헤드를 닦고(3회 문지르기) 알코올 스크럽 패드로 닦기(3회 수행)하여 주사 부위를 청소합니다. 알림: 털을 제거하고 주사 부위 주변의 피부를 청소하고 감염 예방을 위해 미국 수의학 협회에서 권장하는 대로 멸균 기구와 바늘을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>자주 사용하지 않는 손으로 마우스의 머리를 단단히 잡습니다. 헤드를 작업 표면에 가능한 한 평평하게 놓으십시오.</li>
	<li>주사 부위를 찾습니다.<ol><li>준비된 날카로운 18G 바늘을 사용하여 먼저 브레그마를 식별하십시오. 이를 위해 정중선을 따라 머리 피부를 가로질러 바늘을 드래그하여 로스트랄-꼬리 평면에서 움직입니다. 두 꼭짓점이 눈이고 세 번째 꼭짓점이 브레그마의 대략적인 위치인 정삼각형을 상상해 보십시오( 그림 1C 참조).</li>
		<li>브레그마에서 바늘을 측면 2mm, 꼬리 1mm를 주사 부위로 이동합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바늘을 수직으로 잡은 상태에서 튜브가 피부와 같은 높이가 될 때까지 바늘을 피부와 뼈를 통해 단단히 밀어 넣습니다.</li>
	<li>바늘을 집어넣고 바늘을 돌려 피부와 뼈를 다시 누릅니다. 뼈에 작은 구멍이 생길 때까지 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>뭉툭한 바늘을 사용하여 뼈에 충분한 구멍이 생겼는지 확인합니다. 뭉툭한 바늘이 통과할 수 있을 만큼 뼈에 구멍을 뚫는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>노즈콘에서 마우스를 제거하고 멸균 거즈로 주사 부위의 피를 닦아낸 다음 깨어날 때까지 케이지 워머의 케이지에 마우스를 넣습니다. 개두술로 만든 구멍이 작기 때문에(18G 바늘) 봉합사나 상처 클립으로 해당 부위를 닫을 필요가 없습니다. 참고: 여기에서 생산되는 개구부는 작기 때문에(18G) 많은 기관에서 이 절차를 수술이 아닌 주사로 간주합니다. 더욱이, 피부와 뼈를 통해 뇌로 통하는 구멍이 뚫려 있기는 하지만, 피부를 팽팽하게 유지하면 구멍이 정렬되지 않게 되는데, 이는 피부의 세균총이나 케이지 침구가 뇌에 닿는 것을 막는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 주사 만들기
<ol><li>아래 설명에 따라 주입 재료를 준비합니다.<ol><li>작업 표면에 깨끗한 벤치 패드나 드레이프 재료를 놓습니다. 이소플루란 기화기의 노즈 콘을 작업 표면에 테이프로 붙입니다(실험자와 가깝지만 반대쪽을 향함, 그림 1A 참조).</li>
		<li>45° 경사가 있는 10mm 길이의 27G 바늘을 5μL 유리 주사기에 부착합니다. 바늘 끝의 3.5mm가 돌출되도록 바늘에 실라스틱 튜브를 놓습니다. 실험실 테이프를 사용하여 튜브를 주사기 본체에 고정합니다( 그림 1D 참조).</li>
		<li>튜브에 주입 매체(약물, 바이러스 또는 기타 주입용 액체)를 준비합니다. 본 연구의 대표 결과로는 멸균 등장성 식염수를 주입하였다. 알림: 2mL 미세 원심분리 튜브와 같이 유리 주사기와 바늘로 접근할 수 있는 튜브를 선택하십시오.</li>
		<li>유리 주사기에 주입 매체 3μL를 그립니다. 먼저 원하는 부피 이상을 뽑고 주사기에 3μL가 남을 때까지 배출합니다.</li>
		<li>주사 부위를 준비하기 위해 요오드 스크럽, 멸균 거즈 및 알코올 패드를 모으십시오.</li>
		<li>카운트업 모드에서 실험실 타이머를 시작하고 주입하는 동안 실험자가 볼 수 있도록 타이머를 배치합니다.</li>
		<li>전날에 수행한 것처럼 바늘을 옆으로 2mm, 꼬리로 1mm 움직이는 연습을 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명에 따라 주입할 마우스를 준비합니다.<ol><li>마우스를 유도 챔버에 넣고 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 발가락 반사가 없으면 눈 윤활제를 바르고 머리가 코뿔에 있는 상태에서 마우스를 작업 표면에 놓습니다.</li>
		<li>요오드와 알코올을 각각 3 개의 물티슈로 주사 부위를 청소하십시오. 1.8단계에서 설명한 대로 18G 바늘(또는 무딘 바늘)로 주사 부위를 식별합니다. 개두술 중에 생긴 구멍은 감지할 수 있어야 합니다. 참고: 개두술을 미리 시행하지 않았거나 두개골의 구멍이 감지되지 않는 경우 여기에서 개두술을 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명에 따라 유리 주사기로 주입을 수행합니다.<ol><li>자주 사용하지 않는 손으로 마우스의 머리를 단단히 잡습니다. 헤드를 작업 표면에 가능한 한 평평하게 놓으십시오.</li>
		<li>2.1.2단계에서 준비한 바늘 위에 놓인 튜브가 마우스의 피부에 놓일 때까지 유리 주사기의 바늘을 두개골의 구멍을 통해 놓습니다.</li>
		<li>주사기를 가능한 한 수직으로 잡고 관상면과 시상면 모두에 주의를 기울입니다. 1분에 걸쳐 미디어를 천천히 주입합니다.</li>
		<li>역류를 최소화하기 위해 주사 완료 후 주사기와 바늘을 1분 더 제자리에 고정합니다. 마우스 머리에서 바늘을 천천히 집어넣습니다.</li>
		<li>콧방울에서 마우스를 제거하고 멸균 거즈(있는 경우)로 주사 부위의 혈액을 닦아내고 깨어날 때까지 케이지 워머의 케이지에 마우스를 넣습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 사출 주입점 확인
<ol><li>앞서 설명한 바와 같이 인산염 완충 식염수(PBS)에 식염수와 4% 파라포름알데히드로 마우스를 깊이 마취하고 관류합니다8. 뇌가 가라앉을 때까지(일반적으로 2일) 4°C의 PBS에서 30% 자당에 뇌를 보관합니다.</li>
	<li>앞에서 설명한 대로 저온 유지 장치에서 20-50μm 관상 절편을 절단합니다9. 절편하는 동안 조직 블록의 주입관을 관찰합니다. 주사관이 외측 심실과 명확하게 교차하는지 기록하십시오.</li>
</ol>

Free-Hand Approach를 사용하여 마우스에서 뇌내 주사 수행

<ol>
	<li>Roseweir, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+potent+kisspeptin+antagonists+delineate+physiological+mechanisms+of+gonadotropin+regulation.">Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation.</a> Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).</li><li>Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+intracerebroventricular+injection+of+CD4(+)+T+cells+into+mice.">An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).</li><li>Russo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+control+of+the+female+reproductive+axis+through+gated+responsiveness+of+the+RFRP-3+system+to+VIP+signaling.">Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling.</a> Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).</li><li>Laursen, S. E., Belknap, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+injections+in+mice.+Some+methodological+refinements.">Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements.</a> Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).</li><li>Haley, T. J., McCormick, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+effects+produced+by+intracerebral+injection+of+drugs+in+the+conscious+mouse.">Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse.</a> British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).</li><li>McCosh, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+hypoglycaemia+suppresses+pulsatile+luteinising+hormone+secretion+and+arcuate+Kiss1+cell+activation+in+female+mice.">Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation.">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).</li><li>Comba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+glioma+subregions+for+spatial+and+molecular+characterization+of+intratumoral+heterogeneity,+oncostreams,+and+invasion.">Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion.</a> Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).</li><li>Porteous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reformulation+of+PULSAR+for+analysis+of+pulsatile+LH+secretion+and+a+revised+model+of+estrogen-negative+feedback+in+mice.">Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice.</a> Endocrinology. 162 (11), (2021).</li><li>Hohmann, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+melanocortins+in+mediating+leptin's+central+effects+on+feeding+and+reproduction.">Differential role of melanocortins in mediating leptin's central effects on feeding and reproduction.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).</li><li>Gottsch, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+kisspeptins+in+the+regulation+of+gonadotropin+secretion+in+the+mouse.">A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).</li><li>Krasnow, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+galanin-like+peptide+in+the+integration+of+feeding,+body+weight+regulation,+and+reproduction+in+the+mouse.">A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse.</a> Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).</li></ol>

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여기에서, 마우스에서 ICV 주사를 만들기 위한 간단하고 효과적인 수단이 설명된다. 이 기술은 입체 구조를 필요로 하지 않기 때문에 약물 및 실험 제제의 중앙 전달을 위한 이 접근 방식은 더 많은 연구자가 접근할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 준비 및 주입 절차를 신속하게 수행할 수 있기 때문에 처리량이 상대적으로 높습니다.
이 시술은 대략적인 거리를 사용하여 바?...

약물1, 바이러스2 또는 세포3와 같은 실험 물질의 뇌 전달은 종종 신경내분비 연구에 필요하다. 약제가 혈액뇌장벽을 쉽게 통과하지 못하거나 실험 목적이 약제의 중심 효과를 구체적으로 테스트하는 것이라면 뇌에 주사를 전달하는 신뢰할 수 있는 방법을 갖는 것이 중요합니다. 또한, 뇌내(ICV) 공간으로의 주입은 약제를 뇌에 널리 분포시킬 수 있는 기회를 제공하고 넓은 표적 영역을 제공하므로 성공적인 주입 가능성을 높인다2.
ICV 주사를 만드는 일반적인 방법에는 영구 유치 캐뉼라를 배치하는 것이 포함됩니다. 이 접근법에서, 캐뉼라가 제자리에 접착되거나 접합되기 때문에, 상업적으로 이용 가능한 또는 주문형 캐뉼라를 배치하기 위해 입체 프레임 (stereotaxic frame)이 필요하다. 종종 회복 시 안지오텐신 II의 초생리학적 용량이 캐뉼라를 통해 투여되며, 음주 행동이 즉시 관찰되면 캐뉼라가 올바르게 배치된 것으로 간주된다4. 이 접근 방식은 장기 주입을 수행할 수 있는 능력과 동일한 동물을 여러 번 주입할 수 있는 능력을 포함하여 많은 장점이 있습니다. 또한, 안지오텐신 II를 사용하는 경우, 실험 화합물을 투여하기 전에 올바른 배치를 확인할 수 있습니다. 그러나 영구 캐뉼라를 배치하는 데에는 고가의 장비(입체 프레임)에 대한 요구 사항, 배치 후 캐뉼라가 손상될 가능성(예: 쥐가 케이지 메이트의 캐뉼라를 씹을 수 있음) 및 영구 캐뉼라 주변의 감염 가능성을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 단일 ICV 주사는 입체탁스 프레임(stereotaxic frame)3을 사용하여 이루어질 수 있는데, 이는 효과적이기는 하지만, 마취에 대한 상당한 노출을 필요로 하며, 따라서 치료의 일부 급성 생리학적 및 행동적 효과를 모호하게 할 수 있다. 또한, 입체 프레임에 마우스를 배치하려면 안정적인 배치를 달성하고 외이도의 파열을 방지하기 위해 상당한 훈련이 필요합니다.
여기에서, 마우스에서 프리-핸드 주사를 하기 위한 확립된 방법이 설명된다. 이 방법은 이전 보고서 5,6을 기반으로 합니다. 이 기술의 장점은 간단하고 빠르며 입체 프레임과 같은 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 후술하는 바와 같이, 이 시술은 주사를 만들기 위해 마우스 헤드의 랜드마크에 대해 유리 주사기를 조작하는 것을 포함하며, 이는 신속하게 수행될 수 있으므로 실험 당일에 몇 분의 가스 마취만 필요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge blunt needles</td>
			<td>SAI Infusion</td>
			<td>B18-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-gauge needles</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62AC22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1696484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-892-5235</td>
			<td>Controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-218-8442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7634-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;&#160;</td>
			<td>Patterson Vet Supply</td>
			<td>07-893-8441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Vet Equip</td>
			<td>V-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89098-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical grade oxygen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USPEA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>8.18715.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>J67802.K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PulsaR Software</td>
			<td>Open source, University of Otago</td>
			<td></td>
			<td>See ref 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-00-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.040&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic tubing (0.078&#34; I.D.)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>508-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101320-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

free-hand intracerebroventricular injections in mice

신경 내분비계를 조사하려면 종종 약물, 바이러스 또는 기타 실험 물질을 쥐의 뇌에 직접 전달해야 합니다. 뇌내 심실(ICV) 주사는 뇌 전체(특히 심실 근처의 구조)에 실험 물질을 광범위하게 전달할 수 있습니다. 여기에서, 성체 마우스에서 프리-핸드 ICV 주사를 하는 방법을 설명한다. 쥐의 머리에 시각 및 촉각 랜드마크를 사용하여 측실에 빠르고 안정적으로 주입할 수 있습니다. 주사는 실험자의 손에 들린 유리 주사기로 이루어지며 랜드마크에서 대략적인 거리에 배치됩니다. 따라서 이 기술에는 입체 프레임 이 필요하지 않습니다. 또한, 이 기술은 잠깐의 이소플루란 마취만을 필요로 하며, 이는 깨어 있고 자유롭게 행동하는 마우스에서 마우스 행동 및/또는 생리학의 후속 평가를 허용합니다. 자유형 ICV 주사는 살아있는 쥐의 뇌에 실험 물질을 효율적으로 전달하기 위한 강력한 도구이며 빈번한 혈액 샘플링, 신경 회로 조작 또는 신경 내분비 과정을 조사하기 위한 생체 내 기록과 같은 다른 기술과 결합할 수 있습니다.

성공적으로 수행되면 이 기술은 실험 제제를 심실 시스템에 신속하게 전달할 수 있습니다. 많은 약리학적 화합물의 매개체인 멸균 등장성 식염수 3μL의 ICV 주사를 받은 난소 절제술 마우스의 황체 형성 호르몬(LH) 펄스 프로파일이 그림 2A에 나와 있습니다. 이 예는 가스 마취에 잠깐 노출되고 심실계에 3μL의 유체를 주입하는 것만으로는 박동성 LH 분비가 변하지 않는다는 것?...

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저자 스포트라이트: 생식 신경 조절의 통찰력, 혁신 및 미래 방안 

여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

우리는 생식 기능의 신경 조절, 특히 건강한 상태와 스트레스에 대한 반응 모두에서 뇌가 생식선을 조절하는 호르몬의 방출을 조절하는 방법에 관심이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 비교적 간단하고 빠르다는 것입니다. 측심실에 약물을 전달하는 것은 보다 자세한 후속 실험을 지원하기 위해 신호 전달 경로를 테스트하는 데 광범위한 그물을 던질 수 있는 좋은 방법입니다.황체 형성 호르몬 맥박 생성을 위한 분자 메커니즘, 스트레스 중 맥박 주파수를 조절하는 메커니즘, 배란 전 LH 급증 생성 등 생식의 신경 내분비 조절에 대해 아직 배워야 할 것이 많습니다. 앞으로 우리는 서로 다른 결과를 모델에 통합하는 데 특히 관심이 있습니다.

free-hand-intracerebroventricular-injections-in-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K 조회수.  Colorado State University. 우리는 생식 기능의 신경 조절, 특히 건강한 상태와 스트레스에 대한 반응 모두에서 뇌가 생식선을 조절하는 호르몬의 방출을 조절하는 방법에 관심이 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 비교적 간단하고 빠르다는 것입니다. 측심실에 약물을 전달하는 것은 보다 자세한 후속 실험을 지원하기 위해 신호 전달 경로를 테스트하는 데 광범위한 그물을 던질 수 있는 좋은 방법?...

비디오: 저자 스포트라이트: 생식 신경 조절의 통찰력, 혁신 및 미래 방안 

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

마우스에 모터 조정을 측정

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

연구

신경과학

Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

마우스의 비디오 - oculography

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

일반 마우스의 아밀로이드-β의 펩티드의 뇌 실내 주사는 급성 치매와 같은인지 적자를 유도합니다

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Intracerebroventricular Treatment with Resiniferatoxin and Pain Tests in Mice

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a thermosensitive cation channel, is known to trigger pain in the peripheral nerves. In addition to its peripheral function, its involvement in brain functions has also been suggested. Resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent TRPV1 agonist, has been known to induce long-term desensitization of TRPV1, and this desensitization has been an alternative approach for investigating the physiological relevance of TRPV1-expressing cells. Here we describe a protocol for intracerebroventricular (i.c.v.) treatment with RTX in mice. Procedures are described for testing nociception to peripheral TRPV1 stimulation (RTX test) and mechanical stimulation (tail pressure test) then follow. Although the nociceptive responses of mice that had been administered RTX i.c.v. were comparable to those of the control groups, RTX-i.c.v.-administered mice were insensitive to the analgesic effect of acetaminophen, suggesting that i.c.v. RTX treatment can induce supraspinal-selective TRPV1 desensitization. This mouse model can be used as a convenient experimental system for studying the role of TRPV1 in brain/supraspinal function. These techniques can also be applied to studies of the central actions of other drugs.

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) in the supraspinal region has been suggested to play some roles in the brain function. Described here is a protocol for intracerebroventricular injection of resiniferatoxin for supraspinal TRPV1 desensitization in mice. Procedures for some pain tests are also presented.

수지 성 소와 쥐의 통증 검사를 가진 뇌경치료

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a thermosensitive cation channel, is known to trigger pain in the peripheral nerves. In ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...