장내 미생물총에 의해 방출되는 대사 산물은 숙주에 복잡한 효과를 생성합니다. 이 프로토콜은 마우스의 뇌와 행동에서 장 대사 산물의 역할을 조사하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 자유롭게 움직이는 마우스의 뇌에 장 대사 산물을 전달하는 정확하고 세심하며 검증 된 방법을 제공합니다.
우리는 장 뇌 축 연구에 대한 통찰력을위한 포괄적이고 생리 학적 최상의 방법론을 제공합니다. 마우스를 정위 프레임에 놓고 입체 앞니 홀더의 앞니 막대에 마우스 앞니를 고정합니다. 코 콘 마스크로 코를 덮으십시오.
그런 다음 상단 핀치 반사를 통해 마우스의 통각을 평가하고 수술 부위를 절개하기 전에 일정한 호흡 속도를 확인하십시오. 머리에 손질 된 모피가 접착 테이프로 제거되면 진통제 케토 프로 펜을 피하 주사하여 통증을 완화하고 눈 연고를 바르십시오. 그런 다음 외이도에 뾰족한 이어 바를 삽입하여 머리를 고정하십시오.
앞니 홀더의 코 클램프를 조이고 머리를 부드럽게 눌러 머리가 고정되었는지 확인합니다. 클로르헥시딘 면봉을 3번 번갈아 가며 스크럽하여 두피를 소독합니다. 이제 해부 메스를 사용하여 두피를 앞쪽 뒤쪽으로 1cm 미만으로 절개하십시오.
절개 부위를 연 후 미세 해부 집게로 잡은 면봉으로 두개골을 닦으십시오. 입체 좌표를 기반으로 원고에 설명 된대로 오른쪽 측면 심실의 위치를 식별하고 레이블을 지정합니다. 다음으로, 정위 드릴을 사용하여 라벨이 붙은 부위의 두개골을 통해 구멍을 뚫고 나중에 두개골에 2-4 개의 구멍을 더 뚫습니다.
리도카인 면봉으로 두개골을 닦고 구멍에 2-4 개의 스테인리스 나사를 장착하십시오. 상업용 가이드 캐뉼러를 정위 캐뉼라 홀더에 놓고 섭씨 150도에서 유리 속도 살균기로 소독합니다. 그런 다음 정위 캐뉼라 홀더를 측심실용으로 뚫린 구멍으로 옮기고 원하는 깊이에 도달할 때까지 상업용 가이드 캐뉼라를 구멍에 천천히 삽입합니다.
이제 10 마이크로 리터의 n- 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용하여 드릴 구멍에 상업용 가이드 캐뉼러를 고정하고 3-4 분 동안 기다립니다. 정위 캐뉼라 홀더에서 상업용 가이드 캐뉼라를 부드럽게 풀고 절개된 두피에 치과용 아크릴을 바르고 상업용 가이드 캐뉼라를 고정하고 최소 5분 동안 기다립니다. 상업용 더미를 상업용 가이드 캐뉼러에 이식합니다.
그런 다음 마취에서 회복하기 위해 아래에 가열 패드가 있는 새 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 완전히 깨어날 때까지 계속 관찰합니다. 10 마이크로 리터의 증류수가 들어있는 마이크로 리터 주사기를 마이크로 주입 펌프에 장착하십시오. 인슐린 주사기를 사용하여 폴리에틸렌 튜브에 증류수를 채우고 마이크로 리터 주사기를 매달린 폴리에틸렌 튜브에 연결합니다.
미세 주입 컨트롤러를 켜고 모든 채널 표시를 눌러 명령 화면에 액세스합니다. 그런 다음 구성을 누르고 초당 100 나노 리터의 전달 속도로 볼륨 목표를 9, 800 나노 리터로 설정하십시오. 그런 다음 방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 실행을 눌러 마이크로 리터 주사기에 연결된 폴리에틸렌 튜브에서 9, 800 나노 리터의 증류수를 주입합니다.
이제 인젝터를 미네랄 오일이 들어있는 바이알에 넣고 구성을 누르고 볼륨 목표를 초당 100 나노 리터로 전달 속도로 3, 000 나노 리터로 설정하십시오. 3, 000 나노 리터의 미네랄 오일을 인출하려면 방향을 눌러 철수 모드로 전환 한 다음 실행을 누릅니다. 마이크로 리터 주사기 바늘에서 폴리에틸렌 튜브를 분해하십시오.
마이크로 리터 주사기 바늘에서 3, 000 나노 리터의 증류수를 뱉어 내려면 방향을 눌러 주입 모드로 전환하고 실행을 누릅니다. 그런 다음 마이크로 리터 주사기를 폴리에틸렌 튜브에 다시 삽입하십시오. SCFA가 들어있는 바이알에 인젝터를 넣습니다.
구성을 누르고 볼륨 목표를 9, 500 나노 리터로 설정하고 전달 속도를 초당 100 나노 리터로 설정합니다. 방향을 눌러 9, 500 나노 리터의 SCFA를 인출하여 인출 모드로 전환하고 실행을 누릅니다. 오일 SCFA 상에 라벨을 지정하여 SCFA가 성공적으로 주입되었는지 확인합니다.
구성을 누르고 전달 속도로 원하는 볼륨 목표를 초당 7나노리터로 설정합니다. 방향을 눌러 주입 모드로 전환합니다. SCFA 주입을 위해 캐뉼라에 주입기를 삽입하기 전에 상업용 인젝터의 앞쪽 끝에서 액체가 나올 때까지 마이크로리터 주사기를 앞으로 주입하려면 실행을 누릅니다.
마우스를 마취한 후 상업용 인젝터를 상업용 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 마우스가 마취에서 회복되면 새로운 케이지에 넣고 35 분 동안 자유롭게 탐색 할 수 있습니다. 처음 5 분 동안 2, 100 나노 리터의 목표 부피에 대해 초당 7 나노 리터의 전달 속도를 사용하여 SCFA를 주입하십시오.
그런 다음 주입 모드로 방향을 누르고 실행을 누릅니다. 행동 테스트 후 상업용 가이드 캐뉼라에서 상업용 인젝터를 제거합니다. 주입 부위를 확인하기 위해 초당 7 나노 리터의 전달 속도로 2, 100 나노 리터의 중성 추적자를 주입하십시오.
형광 현미경을 사용하여 주입 부위의 형광 신호를 이미지화합니다. ACSF와 SCFA가 주입 된 마우스는 총 35 분 동안 새로운 케이지에서 여행했습니다. SCFA와 ACSF의 주입 사이의 신규한 케이지에서의 운동 활성에는 차이가 관찰되지 않았다.
형광 염료는 상업용 가이드 캐뉼라를 주입했을 때 마우스 뇌실과 마우스 뇌의 주변 영역에서 검출되었습니다. 유사하게, 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼러를 통한 주입은 측면 심실과 마우스 뇌의 주변 영역에서 신호를 감지합니다. 이 절차를 회로 기반 신경 기술과 결합하면 과학자들은 장 대사 산물에 의해 기여하는 뇌 및 행동의 회로 기반 제어에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
이 기술은 연구자들이 복잡한 장내 뇌 축에서 미생물총과 대사 산물의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
