우리 연구실에서는 특정 다운스트림 이벤트를 트리거하는 조건을 이해하기 위해 순환 AMP의 공간적 및 시간적 조절을 조사합니다. 세포 내 활성화 및 주기적 AMP 신호 전달의 억제를 효과적으로 모방하기 위해 bPAC-nanoluciferase라는 광유전학 도구의 분포를 특성화합니다. 현재 순환 AMP 신호 전달 모델의 유효성을 테스트하기 위해 당사는 살아있는 세포의 세포 내 구획에서 순환 AMP 신호 전달을 평가, 모방 및 차단하는 도구를 개발했습니다.
이 프로토콜은 체계적인 방식으로 광유전학 도구의 분포와 기능을 자극하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 글쎄요, 우리의 목표는 포커스 라이트 프로세스가 특정 세포 영역에서 광유전 단백질을 정확하게 활성화하여 주변 단백질에 미치는 영향을 피할 수 있는지 테스트하는 것이었습니다. 이 방법은 확산 분포를 가진 단백질을 연구하거나 의도된 효과가 주기적 AMP 또는 기타 신호 분자에서 국부적인 증가를 생성하는 데 매우 중요합니다.
광유전학 실험에서 일반적인 접근 방식은 세포의 전체 영역 또는 때로는 더 작은 지정 영역을 자극하는 것입니다. 그러나 이 영역과 강도의 선택은 종종 임의적입니다. 당사의 체계적인 접근 방식을 통해 연구자는 보다 정확한 실험을 수행하여 신호 경로의 패턴을 모방하는 데 도움이 됩니다.
이 연구에서는 핵 표적 고리형 AMP 센서 및 광유전학적 핵 표적 단백질인 NLS-bPAC-나노루시페라제와 함께 형질 주입된 세포를 사용합니다. 어두운 환경에서 핵 bPAC을 발현하는 세포를 배양하고 조작합니다. 적색 안전광 램프를 사용하여 500나노미터 미만의 파장에 노출되지 않도록 하십시오.
다중 LED 조명 엔진, 방출 필터 휠, 전동 XY 스테이지, ORCA-Fusion 디지털 CMOS 카메라 및 1.4 개구수의 100배 배율 오일 대물렌즈가 장착된 전동 2층 현미경에서 이미징 실험을 수행합니다. 이미지를 캡처하려면 디지털 현미경 소프트웨어를 사용하십시오. 이 설정은 ZT458rdc 이색성 필터가 장착된 독립적인 광경로를 사용하여 세포를 자극하고 FRET 측정을 동시에 수행할 수 있습니다.
UGA-42 Geosystem 및 LDI-7 레이저를 켠 후 현미경을 켜서 H208 FRET 센서로 데이터를 수집하기 위해 적절하게 설정합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어와 현미경을 제어하는 SysCon 소프트웨어를 순차적으로 엽니다. 매번 사용하기 전에 시스템을 보정하려면 카메라 창으로 이동하여 보정 탭을 선택합니다.
광유전 단백질과 호환되는 레이저 파장을 설정합니다. 445나노미터를 선택하여 bPAC-나노루시페라아제를 자극합니다. 카메라 탭을 선택하고 수집 시작을 클릭하여 이미징 소프트웨어에서 수집을 시작합니다.
보정 탭을 다시 선택합니다. Start Calibration 버튼을 클릭합니다. 표시되는 드롭다운 목록에서 적절한 보정 모드를 선택합니다.
제조업체에서 지정한 보정 단계를 따릅니다. 필요한 경우 이미징 소프트웨어 설정을 변경하여 적절한 보정을 수행합니다. 샘플의 셀이 없는 영역에서 보정을 수행해야 합니다.
다음으로, 이미징 소프트웨어를 사용하여 하나의 형광 이미지를 획득합니다. 형광 세포가 이미지 뷰어 창에 나타납니다. 현미경 제어 XY를 사용하여 자극할 세포를 영향 영역 내, 가급적이면 중앙에 배치합니다.
실제 실험을 시작하기 전에 Click-And-Fire 모드를 사용하여 개별 세포의 반응성을 빠르게 평가할 수 있습니다. 타임라인(Timeline) 창에서 광원, 지속 시간, 자극의 강도를 포함한 세포 자극 파라미터를 조정합니다. 이미지 뷰어 창에서 셀의 중심을 대략적으로 클릭하고 응답을 평가합니다.
이미지 뷰어 창에서 왼쪽 도구 모음에 있는 원형 아이콘을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 Filled를 클릭하여 채워진 원형 자극 개체를 그립니다. 이 단계를 반복하여 여러 개의 동일한 원을 만들고 균일하게 분포시켜 자극할 세포의 전체 세포질이 균일하게 분포되도록 합니다. 이미지 뷰어(Image Viewer) 창에서 왼쪽의 마우스 포인터 아이콘을 클릭한 다음, stimulation 객체 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 속성을 확인하고 편집합니다.
또는 그려진 모든 자극 객체를 선택한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택한 모든 자극 객체의 속성을 함께 편집합니다. View(보기) 하위 창에서 Snap to Grid(그리드에 스냅) 버튼을 클릭합니다. 이 그리드는 적절한 행렬 또는 배열을 형성하기 위해 원의 균일한 간격과 정렬을 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
또한 Set Grid 버튼을 사용하여 그리드의 속성을 사용자 지정합니다. 그리드의 도움으로 자극 객체를 고르게 분배합니다. 필요한 경우 전체 세포를 덮기 위해 더 많은 자극 물체를 추가합니다.
모두 동일한 속성을 가지고 있는지 확인합니다. 이전에 이미지 뷰어 창에서 생성된 각 자극 객체는 타임라인 창에 표시되며, 여기서 시작 시간, 지속 시간, 지연, 강도 등을 포함한 다양한 속성 세트를 편집할 수 있습니다. 자극 객체를 올바르게 시각화하려면 먼저 타임라인 창을 확장하십시오.
이제 타임라인 창에서 자극 객체의 시간적 속성을 볼 수 있습니다. 모든 자극 객체를 선택하고 Object Timing 하위 창에서 지연과 지속 시간을 편집합니다. Lightsource(광원) 하위 창에서 물체의 파장과 강도를 구성합니다.
모두에 대해 동일한 파장과 강도를 보장합니다. 두 개 이상의 자극으로 인한 과도한 영향을 방지하려면 각 개체에 대해 다른 시작 시간을 설정하거나 예상 결과에 따라 개체 간의 지연을 다르게 설정합니다. 다음으로, 타임라인 창에서 필요한 경우 각 자극 객체가 활성화되는 순서를 변경합니다.
실험에 따라 자극 시퀀스를 규칙적 또는 무작위 패턴으로 구성합니다. 시퀀스를 시스템에 업로드한 후 Sequence 하위 창에서 시스템이 수행할 시퀀스 주기 또는 실행 횟수를 구성합니다. 자극된 세포의 형광 변화를 측정하려면 이미징 소프트웨어의 관심 영역을 원하는 위치에 배치합니다.
형광 이미지 획득을 시작합니다. 마지막으로 UGA-42 창에서 재생을 눌러 세포 자극을 시작합니다. 카메라로도 캡처할 수 있는 실제 자극 빔과 자극 객체와의 상관 관계를 관찰합니다.
녹색 트레이스의 강도 변화만 주목하십시오., 이는 센서에 의해 측정된 순환 AMP 농도의 증가를 보여줍니다. 이는 특히 빔이 최소량의 bPAC-nanoluciferase로 세포의 일부에 도달할 때 발생합니다. H208의 YFP 형광은 핵의 위치를 결정하는 데 사용되었습니다.
전체 핵을 포함하는 관심 영역을 사용하여 표시된 파란색 반점에서의 자극으로 인한 H208 센서의 FRET 비율 변화를 측정했습니다. 그 결과, 순환 AMP의 일시적인 증가는 청색광이 bPAC-나노루시페라아제를 함유한 영역으로 향할 때만 발생한다는 것을 밝혔습니다. 이를 통해 핵 표적 bPAC-nanoluciferase가 HC-1 세포의 핵 구획에서만 독점적으로 발현됨을 확인했습니다.
