이 프로토콜은 마우스 뇌 및 성인 제브라피쉬에서 생체 내 심부 조직 삼광자 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 생명 과학에서 두 가지 중요한 모델 시스템. 장파장 삼광자 현미경 검사는 이광자 현미경으로 접근 할 수없는 깊이에서 손상되지 않은 조직 또는 장기의 생체 내 고공간 해상도 이미징을 가능하게합니다.
이 기술은 질병이 뇌에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 완전한 이해가 부족한 알츠하이머 및 자폐증과 같은 신경 질환의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스 뇌 영상 시술을 시연하는 것은 우리 실험실의 박사후 연구원이자 제브라피쉬 뇌 영상 절차를 시연하는 Kibaek Choe가 될 것이며, Fetcho Research Laboratory의 연구원 인 Kristine Kolkman이 될 것입니다. 시작하려면 레이저를 켜고 비공선형 광학 파라메트릭 증폭기의 아이들러 출력의 중심 파장을 1, 300 또는 1, 700 나노미터로 설정한 다음 광 경로에 펄스 압축기를 배치하여 펨토초 레이저를 미리 처프하고 3광자 이미징을 위한 펄스 지속 시간을 최적화합니다.
실리콘 플레이트와 레이저 경로 사이의 각도를 브루스터의 각도로 설정하여 레이저 투과율을 최대화한 다음, 실리콘 플레이트를 회전시켜 반사를 최소화하여 브루스터의 각도를 달성하십시오. 다음으로, 플리퍼 미러를 배치하여 1, 300 및 1, 700 나노미터 빔 라인 사이를 편리하게 전환할 수 있습니다. 회전 스테이지에 장착된 반파판과 편광 빔 스플리터를 배치하여 레이저의 강도를 제어한 다음 빔 스플리터의 반사 경로에 빔 차단기를 배치합니다.
0.5 센티미터의 2 % 고융점 한천으로 페트리 요리를 준비하십시오. 한천이 냉각되고 응고되면 한천의 직사각형 구멍을 물고기보다 길고 약간 넓게 자릅니다. 왁스를 사용하여 한쪽 끝이 직사각형인 페트리 접시에 얇은 튜브를 부착하고 페트리 접시의 가장자리에 직경이 큰 튜브를 부착하십시오.
다음으로, 밀리리터 트리카인 용액 당 0.2 밀리그램에 물고기를 넣어 마취 한 다음 마취 된 물고기를 젖은 스폰지 위에 옆으로 놓은 다음 미세 주사기를 사용하여 역궤도로 3 마이크로 리터의 판쿠로늄 브로마이드를 주입하여 물고기를 마비시키고 행크의 용액에 간단히 넣어 완전히 마비되도록하십시오. 다음으로, 머리를 튜브쪽으로 향하게하여 페트리 접시에 물고기 등쪽을 올려 놓은 다음 포셉을 사용하여 물고기의 입을 부드럽게 열고 튜브를 입으로 밀어 넣으십시오. 튜빙이 물고기의 입 뒤쪽에 오도록 물고기를 튜빙 쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
빨리, 그러나 부드럽게, 물고기 주위의 한천을 말리고 물고기 꼭대기에있는 물을 제거하십시오. 실험실 조직의 작은 조각을 실험실 접착제에 담그고 물고기의 양쪽에있는 한천과 아가미에 물고기의 등 꼬리 위에 조직을 넣으십시오. 다음으로, 머리 표면에 직접 작은 부피바카인 방울을 올려 물고기의 피부를 마취 한 다음 물고기가있는 페트리 접시를 현미경으로 가져 오십시오.
접시에 생선 시설 물을 채우고 튜브에 워터 펌프를 연결하여 시스템 물을 물고기의 입으로 펌핑하십시오. 물이 버블러로 산소를 공급하고 수족관 히터로 섭씨 30도까지 따뜻하게하십시오. 이미징을 위해 삼광자 현미경에 저배율 목표를 놓은 다음 물고기와 튜브가 들어있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓고 LED 광원을 사용하여 페트리 접시를 비추십시오.
이미지 수집 소프트웨어에서 카메라 모드를 열고 라이브를 클릭한 다음 화면 오른쪽에서 채널 A를 선택하고 히스토그램 설정을 조정하여 이미지를 명확하게 볼 수 있습니다. 모터 컨트롤러의 모터 설정을 기본으로 설정 한 후 물고기가 보일 때까지 목표를 낮 춥니 다. 물고기 머리의 중심을 시야의 중앙에 놓은 다음 목표를 위로 움직여 물고기의 머리에서 멀리 떨어 뜨립니다.
저배율 대물 렌즈를 삼광자 이미징을 위해 고수치 조리개 대물 렌즈로 교체한 다음 물고기의 머리 쪽으로 가까이 움직입니다. 모든 모터의 축 값을 0으로 설정합니다. 대물 렌즈를 천천히 낮추어 목표물이 머리에 물리적으로 닿지 않도록하십시오.
CCD 카메라 소프트웨어에서 머리 상단이 보이면 목표 이동을 중지하고 X, Y 및 Z 위치를 0으로 설정합니다. LED 광원을 끄고 시스템 주변의 어두운 커튼을 닫은 다음 이미징 수집 소프트웨어를 삼광자 이미징을 위해 다중 광자 GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 전력을 1 밀리와트 미만으로 설정하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하십시오.
PMT 채널을 열고 필요에 따라 PMT 게인 및 배경 레벨을 조정합니다. 대물 렌즈를 천천히 위로 움직여 큰 혈관과 윈도우 글라스 표면으로부터 THG 채널을 모니터링하여 머리 표면을 찾습니다. 대물 렌즈를 창 가까이로 이동한 후 목표와 두개골 창 사이에 물을 바른 다음 모든 모터의 축 값을 0으로 설정합니다.
이미지 수집 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하십시오. PMT 채널을 열고 필요에 따라 PMT 게인 및 배경 레벨을 조정한 다음, 대물 렌즈를 천천히 위로 이동하여 큰 혈관과 윈도우 글라스 표면으로부터 THG 채널을 모니터링하여 커버 슬립의 표면을 찾습니다. 필요한 경우 창 방향을 조정 한 다음 모터를 제로로 설정하여 뇌 표면을 정의하십시오.
이미징을 수행하고 이미징 깊이에 따라 전력 레벨을 조정합니다. 성인 제브라피쉬 뇌에서 유전자 표지된 뉴런의 고해상도, 비침습적, 심층 이미징은 삼광자 현미경을 사용하여 달성된다. 시신경 구조체와 소뇌에서 세포층의 분포도 관찰 할 수 있습니다.
현미경의 카메라 기능은 물고기를 찾는 데 사용되었습니다. 두개골은 THG 채널에서 볼 수 있으며, 이는 뇌를 탐색하고 상단 표면을 찾는 데 도움이됩니다. 뉴런은 성인 뇌 깊숙한 곳에서 높은 신호 대 배경 비율로 구별 할 수 있습니다.
성인 마우스 뇌에서 THG 신호와 함께 GCaMP6s 표지 뉴런 및 텍사스 레드 표지 혈관의 다색 삼광자 이미지가 여기에 표시됩니다. 설정 최적화를 통해 CA1 해마 영역의 뇌 표면에서 1.2mm까지 고대비 이미지를 성공적으로 얻을 수 있었습니다. GCaMP6s 표지된 뉴런의 칼슘 활성 흔적은 10분 기록 세션 동안 750마이크로미터의 깊이에서 높은 기록 충실도를 나타냈다.
이 설정은 뇌 기능을 이해하기 위해 신경 활동을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 다양한 생물학적 시스템을 이해하기 위해 생물학적 조직 내에서 세포 이동을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 동물의 건강을 모니터링하기 위해 혈류 속도를 측정 할 수도 있습니다.
