이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81960226,81760223)의 보조금으로 지원되었습니다. 윈난성 자연과학재단 (202001AS070045,202301AY070001-011)

실험 프로토콜은 쿤밍 의과대학 동물 윤리 및 사용 위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 남녀 모두의 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (300-350 g)가 사용되었습니다.
1. SAH 모델 유도
<ol><li>2% 이소플루란과 100% 산소를 사용하여 쥐를 마취합니다. 연속 흡입 마취에 이소플루란(1%-3%)을 공급하여 마취를 유지합니다. 입체 장치를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>아래 단계에 따라 SAH 모델을 만듭니다.<ol><li>미세 주사 바늘을 suprasellar 수조에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 쥐의 꼬리 동맥(항응고제 없음)에서 자가 혈액을 suprasellar 수조에 주입합니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>언급된 좌표를 사용하여 오른쪽 외측 뇌실에 미세 주입 바늘을 이식합니다: 브레그마, -0.8mm; 측면, 1.4mm; 깊이, 4mm9. SAH 그룹의 경우 쥐 꼬리 동맥혈 0.2mL를 주사합니다. 가짜 그룹의 경우 동일한 양의 등장성 식염수를 투여합니다(그림 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 뇌 절편 준비 및 안정화
<ol><li>2% 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 깊이 마취시킵니다. 참수 후 뇌 전체를 적출하여 얼음처럼 차가운 인공 뇌척수액(ACSF)에 담그십시오. 참고: 134mM NaCl, 2.8mM KCl, 29mM NaHCO3, 1.1mM NaH2PO4, 1.5mMMgSO4, 2.5mM CaCl2 및 10.11mM D-Glucose(재료 표 참조). pH를 7.3에서 7.4 사이로 유지하십시오.</li>
	<li>비브라톰(재료 표 참조)을 사용하여 5% CO2 및 95%O2로 폭기된 얼음처럼 차가운 ACSF에서 SD 쥐로부터 200μm 두께의 급성 뇌 절편을 준비합니다(그림 2).</li>
	<li>200μm 두께의 급성 뇌 절편을 ACSF에 잠긴 나일론 메쉬의 보관실에 넣습니다. 35-37 °C의 온도 범위를 유지하면서 ACSF 용액을 95 % O 2 및 5 % CO2 와 평형을 이룹니다. 뇌 절편이 2시간 동안 안정화되도록 하여 적응할 시간을 줍니다(그림 3).</li>
</ol>3. TO-PRO-3를 이용한 급성 뇌절편의 주위 세포 표지
참고: 급성 뇌 절편의 주위 세포는 추적자 TO-PRO-310을 사용하여 형광 표지되었습니다.
<ol><li>형광 염료 TO-PRO-3을 ACSF에 첨가하여 최종 농도 1μM를 달성합니다. TO-PRO-3 함유 ACSF를 사용하여 어두운 환경의 실온에서 20분 동안 급성 뇌 절편을 배양합니다. 알림: 보호를 위해 TO-PRO-3을 취급하는 동안 라텍스 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오.</li>
	<li>브레인 슬라이스를 운반하는 나일론 메쉬 스트레이너를 로딩 챔버에서 6웰 플레이트 헹굼 챔버로 옮깁니다( 재료 표 참조). 뇌 절편을 헹굼실에 10분 동안 그대로 둡니다(그림 4D). 알림: 이 헹굼 단계는 염색 과정을 종료하고 배경 라벨링을 줄이며 비특이적 염색을 방지합니다.</li>
	<li>15 % CO 2 및 5 % O2의 혼합물로 평형을 이루는 ACSF 용액을 사용하여 총 95 분 동안 제제를 헹굽니다. 이 헹굼 단계는 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다(그림 4C).</li>
</ol>4. 급성 뇌 절편에서 대뇌 미세 순환의 비생명 주위 세포 염색
<ol><li>어두운 환경에서 30분 동안 Alexa Fluor 488(FITC-ISOB4, 5μg/mL, 재료 표 참조)에 접합된 이솔렉틴 B4를 사용하여 37°C에서 TO-PRO-3이 사전 로드된 뇌 절편을 배양합니다. 배양 후 뇌 절편을 ACSF에서 15분 동안 헹굽니다(그림 4E).</li>
	<li>평소와 같이 5 % CO 2 및 95 % O2 로 가스 처리 된 ACSF에서 뇌 절편을 배양합니다. 37μM 농도의 프로피듐 요오드화물(PI)을 37°C의 두 용액에 모두 첨가합니다. 이것은 중요하지 않은 뇌 주위 세포에 라벨을 붙일 것입니다. 이 ACSF 용액에서 어두운 곳에서 60분 동안 제제를 배양합니다(그림 4F).</li>
	<li>그런 다음 ACSF 용액으로 15분 동안 준비물을 헹구어 염료 흡수를 중단하고 배경 라벨링을 최소화합니다.</li>
</ol>5. 급성 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비생명 뇌 주위의 이미징
<ol><li>플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 절편을 유리 바닥 공초점 접시(재료 표 참조)로 부드럽게 옮깁니다. 이전에 5 % CO 2 및 95 % O2 로 평형을 이룬 ACSF 용액으로 접시를 채웁니다. 철망을 사용하여 쥐의 뇌 조각을 제자리에 고정합니다.</li>
	<li>유리 바닥 컨포칼 접시를 컨포칼 현미경의 스테이지로 옮깁니다. 급성 뇌 절편을 접시 바닥에 놓고 컨포칼 현미경 이미징 중에 95% O2 및 5%CO2의 혼합물로 평형화된 ACSF 용액으로9를 관류합니다(그림 5A 및 그림 5Ab').</li>
	<li>40x 대물렌즈를 사용하여 대뇌 피질 미세혈관의 벽 세포를 시각화합니다. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다( 재료 표 참조). IB4(여기/방출 460nm/520nm), PI(여기/방출 545nm/595nm) 및 TO-PRO-3(여기/방출 606nm/666nm)에 적합한 필터를 사용합니다(그림 5D). 참고: 40× DIC N1 대물 렌즈, 3 × 12비트: 512 × 512픽셀(0.22 × 0.22mm), 보정: 0.42μm/px.</li>
	<li>대뇌 미세혈관과 주위세포를 네트워크와 형태에 따라 식별합니다. 각 뇌 절편에서 대뇌 미세혈관 네트워크를 포함하는 특정 영역을 찾아 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>후속 캡처에서 일관성을 보장하기 위해 이미징 위치를 주의 깊게 기록해 둡니다(그림 5B,C). 추가 처리 및 분석을 위해 이미지 분석 소프트웨어(ImageJ) 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하십시오(재료 표 참조).</li>
</ol>

Visualization of Brain pericyte Contractility Post-Subarachnoid Hemorrhage(뇌주막막막 출혈 후 뇌주막구 수축률의 시각화)

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

중요한 뇌 주위 세포, 비필수 뇌 주위 세포 및 뇌 절편의 미세혈관을 시각화하기 위한 고해상도 공초점 이미징 기술이 개발되었습니다. 급성 쥐 뇌 절편에서, 이 과정은 TO-PRO-311을 사용한 주위 세포의 초기 표지를 수반한 후 IB412를 사용한 미세혈관 내피 세포를 수반합니다. 그 후, PI를 사용하여 죽은 pericyte의 식별이 수행됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현 가...

가느다란 돌기와 돌출된 세포체로 구별되는 뇌 주피세포는 미세순환 1,2를 둘러싸고 있습니다. 대뇌 혈류 확대는 주로 모세혈관 확장에 의해 이루어지지만, 동맥이 작을수록 확장 속도가 느려진다3. 주위 수축력은 모세혈관 직경과 주위 세포 형태에 영향을 미쳐 혈관 역학에 영향을 미친다4. 뇌 주위세포의 수축은 모세혈관 수축을 유발하며, 병리학적 시나리오에서 과도한 수축은 적혈구 흐름을 방해할 수 있다5. 유전자좌(locus coeruleus)에서 분비되는 노르에피네프린(norepinephrine)을 포함한 다양한 요인이 모세혈관 내에서 뇌주위 세포 수축을 유도할 수 있다6. 대뇌 혈류를 조절하는 역할을 하는 pericyte는 20-HETE 합성을 나타내며 과산소증7 동안 산소 센서 역할을 한다. 산화-질화 스트레스로 유발된 뇌 주위 세포의 수축은 모세혈관에 해로운 영향을 미친다5. 뇌 주위 세포 수축에 대한 생체 내 및 생체 외 연구에도불구하고8, 뇌 절편 내에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포의 이미징에 관한 제한된 지식은 여전히 남아 있다.
결정적으로, 뇌 주위의 조직 고정 후 영상은 활력과 후속 수축성 평가를 손상시킵니다. 또한, 신경학적 장애(예: 지주막하 출혈 - SAH)와 같은 시나리오에서 뇌 주피세포의 형질전환 표지는 예비 SAH 유도 뇌주위 세포 사멸 연구에서 확인된 바와 같이 생존 가능한 주위세포와 생존 불가능한 주위를 구별하지 못합니다9. 
이러한 문제를 극복하기 위해 TO-PRO-3를 사용하여 살아있는 pericyte를 라벨링하고 죽은 pericyte는 propidium iodide (PI)로 염색했습니다. 고해상도 컨포칼 이미징 기술을 사용하여 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 시각화하는 동시에 이미징 중 절편 활성을 보존했습니다. 이 논문은 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주위 세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 이미징하기 위한 재현 가능한 방법을 제시하는 것을 목표로 하며, SAH 후 뇌 미세 순환에 대한 뇌 주위 세포의 영향을 조사하는 귀중한 도구 역할을 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

주위 세포는 대뇌 미세 순환 내에 위치한 중요한 벽화 세포로, 수축성 조절을 통해 대뇌 혈류를 능동적으로 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 일반적으로 수축성은 특정 상황에서 형태학적 변화와 인근 모세관 직경 변화를 관찰하여 측정됩니다. 그러나 조직 후 고정, 활력 평가 및 이미징된 뇌 주위 세포의 주위 세포 수축성이 손상됩니다. 마찬가지로, 뇌 주위 세포를 유전적으로 표지하는 것은 생존 가능한 주위 세포와 생존 불가능한 주위 세포를 구별하는 데 부족하며, 특히 지주막하 출혈(SAH)과 같은 신경학적 상태에서는 예비 조사에서 뇌 주위 세포의 사멸을 입증합니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 고안되어 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 주위 세포의 동시 형광 태깅을 가능하게 합니다. 이 표지 방법을 사용하면 고해상도 컨포칼 현미경을 시각화하여 뇌 절편 미세혈관을 동시에 표시할 수 있습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 뇌 주위 세포 수축성, 모세혈관 직경에 미치는 영향 및 주위 세포 구조를 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. SAH 맥락에서 뇌 주위 세포 수축성을 조사하면 대뇌 미세 순환에 미치는 영향을 통찰력 있게 이해할 수 있습니다.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

저자 스포트라이트: 설치류의 지주막막 후 출혈 pericytes 이미징 

지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

정상적인 생리학적 조건에서 뇌 주위세포는 일반적으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 그림 6 은 이 현상을 보여주며, 노란색은 중요한 뇌 주위 세포의 존재를 나타냅니다. 뇌 주위 세포는 PI로 염색되지 않아 생존 가능성을 나타냅니다. 세포 사멸 후 pericyte가 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 SAH 쥐 모델에 방법을 사용하고 후속 이미징을 수...

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예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

우리의 연구는 pericyte 사멸의 현저한 증가를 보여주었다. 따라서 SAH 후 아픈 말에서 시작하여 저생명 기생충의 수와 SAH 후 경과 시간 사이에 양의 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. SAH와 기생충 분리 기술에 따라 뇌 절편에서 중요한 뇌 기생충과 비생명 뇌 기생충을 이미징하는 것은 제 분야의 연구를 발전시켰습니다.현재 죽은 기생충과 죽은 내피 세포를 완전히 구별하는 것은 매우 어렵습니다. 우리의 연구는 SAH 후 기생충에서 수축 의존성 세포 사멸을 발견했습니다. 우리는 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 기생충 모두를 동시에 형광 라벨링을 가능하게 하는 매우 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

702 조회수.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. 우리의 연구는 pericyte 사멸의 현저한 증가를 보여주었다. 따라서 SAH 후 아픈 말에서 시작하여 저생명 기생충의 수와 SAH 후 경과 시간 사이에 양의 상관 관계가 있음을 보여주었습니다. SAH와 기생충 분리 기술에 따라 뇌 절편에서 중요한 뇌 기생충과 비생명 뇌 기생충을 이미징하는 것은 제 분야의 연구를 발전시켰습니다.현재 죽은 기생충과 죽은 내피 세포를 완전히 구?...

비디오: 저자 스포트라이트: 설치류의 지주막막 후 출혈 pericytes 이미징 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

연구

신경과학

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

형광 이미징을 위한 Murine Subarachnoid Hemorrhage Model 및 Brain Slice Preparation 유도

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging(형광 이미징을 위한 쥐 뇌 주위 세포 라벨링 및 염색)

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.