Aedes aegypti 후각 부속기에 대한 현장 교잡 프로토콜을 공유해 주신 Margo Herre와 Leslie Vosshall 연구실에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 C.J.P.(NIAID R01Al137078), J.I.R.의 HHMI Hanna Gray 펠로우십, J.I.R.의 Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award, J.I.R.의 Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. 존스 홉킨스 말라리아 연구소(Johns Hopkins Malaria Research Institute)와 블룸버그 자선재단(Bloomberg Philanthropies)의 지원에 감사드립니다.

1. 자료의 고려 사항 및 준비
<ol><li>조직의 전체 마운트 또는 극저온 절편이 적절한지 결정합니다. 이 프로토콜은 냉동 절개 없이 Anopheles 모기 안테나와 상악 구개에서 RNA의 전체 마운트 in situ 이미징에 최적화되어 있습니다. 샘플이 5mm보다 두꺼우면 프로브 침투를 위해 극저온 절편을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>관심 유전자를 식별하고 적절한 데이터베이스에서 인트론 및 엑손을 포함한 염기서열을 복사합니다. 합성을 위해 유전자 염기서열을 RNA로 전사합니다.</li>
	<li>상용 공급업체로부터 프로브를 구매할지 또는 실험실에서 프로브를 합성할지 여부를 결정합니다. 알림: 이 연구에서 현장 프로브는 상용 공급업체에서 구입했습니다( 재료 표 참조). 대안적으로, 이전에 보고된 바와 같이 합성될 수있다 10. 연구에 사용된 시약은 표 1에 설명되어 있습니다. 시약을 준비하는 데 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.</li>
</ol>2. 조직 전 고정
<ol><li>출현 후 5-10 일 된 10-15 성인 여성 또는 남성 Anopheles coluzzii 모기 (균주 N' Gousso)를 구강 흡인기로 종이컵 또는 플라스틱 튜브에 모으고 얼음이 들어있는 양동이에 넣어 마취합니다. 성공적인 감기 유도 마취는 모기가 움직이지 않을 때 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게로 목 부위에서 머리를 제거하여 목을 베십시오. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 집게로 흉부를 잡고 주로 사용하는 손으로 잡은 집게로 목과 몸을 분리합니다. 얼음 위에 500μL의 키티나아제-키모트립신 디메틸 설폭사이드 완충액(CCD 완충액)이 들어 있는 1.5mL 튜브에 헤드를 넣습니다. 알림: 얼린 동물은 더듬이를 변형시킬 수 있습니다. 얼음 위에서 빠르게 녹다운하는 것이 좋습니다. 테스트 중 모기의 나이는 프로젝트에 따라 다를 수 있습니다. 피를 먹었는지, 굶주렸는지, 짝짓기를 했는지와 같은 생리적 상태를 확인하고 조정하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 피를 먹고 짝짓기를 한 모기에서 후각 부속물을 채취했습니다.</li>
	<li>CCD 완충액의 모기머리를 히트 블록 상에서 37°C로 5분 동안 예열한 후 모기두가 들어있는 튜브를 교잡 오븐으로 옮기고 37°C에서 회전시킵니다. 암컷 Anopheles 더듬이의 경우 20분, 수컷 더듬이의 경우 15분이 필요하며 상악 손바닥의 경우 더 긴 잠복기(1시간)가 필요합니다.</li>
	<li>튜브의 전체 내용물을 해부 시계 유리에 옮깁니다. 시계(해부) 유리의 움푹 들어간 곳에 샘플을 부드럽게 붓습니다. 모기 머리가 튜브 안에 끼인 경우 피펫을 사용하여 CCD 버퍼를 튜브에 추가하고 머리를 헹굽니다.</li>
	<li>겸자를 사용하여 배양 중에 분리된 머리 또는 더듬이/손바닥을 조심스럽게 옮기고 사전 고정제 1mL에 고정합니다. 알림: 남은 CCD 버퍼는 -20°C에서 보존할 수 있으며 버퍼는 최대 3배까지 재사용할 수 있습니다. 조직에 의한 CCD 완충액 캐리오버로 인해 사전 고정제가 약간 갈색으로 변하면 다른 1mL의 고정제로 교체합니다.</li>
	<li>너트를 사용하여 24°C에서 4시간 동안 사전 고정제에서 헤드를 회전합니다. 참고: 이 연구에 사용된 너트의 흔들림 속도는 조정할 수 없었습니다. 제조업체에서 설정한 기본 속도(12rpm)가 사용되었습니다.</li>
</ol>3. 조직 해부
<ol><li>얼음 위에서 0.1% PBS-Tween 1mL로 헤드를 4회(세척당 5분) 헹굽니다. 샘플 손실을 방지하려면 겔 로딩 팁에 부착된 피펫을 사용하여 액체를 제거하십시오. 알림: 두 번의 빠른 세탁 후 10분 동안 세탁하고 3.1단계 대신 마지막 빠른 세탁을 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브의 헤드를 해부 시계 유리로 옮깁니다. 시계 유리의 움푹 들어간 곳에 샘플을 부드럽게 붓습니다. 튜브 안에 끼인 모기 머리를 0.1% PBS-Tween으로 헹굽니다.</li>
	<li>해부 현미경으로 날카로운 집게로 머리에서 관심 조직(더듬이/손바닥)을 제거합니다. 집게로 머리의 뒤쪽 부분을 잡고 베이스에서 다른 집게로 안테나를 잡습니다. RNAse-free 용매로 적신 종이로 집게를 청소하십시오. 동일한 과정을 사용하여 손바닥을 제거합니다.</li>
	<li>더듬이와 손바닥을 겸자로 얼음 위에 놓인 빈 DNA/RNase-free 튜브에 옮깁니다. 서로 다른 조직 부분을 미리 라벨이 붙은 다른 튜브로 분리합니다.</li>
	<li>메탄올(MeOH 80%)과 디메틸 설폭사이드(DMSO 20%)의 혼합물을 함유한 용매 400μL에서 실온에서 1시간 동안 조직을 탈수합니다. 알림: 너트 위에 조직을 놓을 필요가 없습니다. 실험실 벤치의 실온에서 튜브 랙에 놓아두십시오. 신선한 용매 혼합물을 사용하는 것이 좋습니다. 500μL 원액의 경우 400μL의 MeOH와 100μL의 DMSO를 혼합합니다.</li>
	<li>탈수 시약을 400μL의 절대(100%) 메탄올로 교체하고 -20°C에서 밤새 조직을 탈수합니다. 조직이 중력에 의해 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 액체를 제거합니다. 참고: 샘플은 장기간 탈수에 사용할 수 있으며 최대 4일 동안 신호 손실 없이 테스트되었습니다.</li>
</ol>4. 조직 포스트 고정
<ol><li>얼음 위에서 10분 동안 등급이 매겨진 400μL MeOH/PBS-Tween의 4단계 시리즈로 조직에 수분을 보충합니다. 75% MeOH/25% PBS-트윈으로 시작해서 50% MeOH/50% PBS-트윈, 25% MeOH/75% PBS-트윈, 마지막으로 100% PBS-트윈 순으로 합니다. 알림: 작은 구멍이 있는 젤 로딩 팁을 사용하여 튜브에서 버퍼를 제거하여 조직이 손실되는 것을 방지할 수 있습니다. 완충액 제거는 해부 현미경으로 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>실온에서 0.1% Tween-20(PBS-T)을 함유한 400μL의 인산염 완충 식염수로 10분 동안 세척합니다. 샘플을 너트 위에 올려 놓아 세척하십시오.</li>
	<li>20μg/mL Proteinase-K 용액을 만들고 400μL의 Proteinase-K 용액에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 20mg/mL Proteinase-K 스톡(1000x 원액) 즉 2mL의 0.1% PBS-Tween에 2μL를 희석합니다. 남은 음식은 -20 ° C의 냉동실에 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>0.1% PBS-트윈 400μL로 10분 동안 2번 세척하여 조직의 효소 분해를 중단합니다.</li>
	<li>400μL의 사후 고정제를 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 400μL의 0.1% PBS-Tween으로 15분 동안 3회 세척합니다.</li>
</ol>5. 프로브 하이브리드화
<ol><li>400μL의 프로브 교잡 완충액에서 조직을 5분 동안 배양합니다. 부드럽게 피펫팅하여 조직이 완충액에 완전히 잠기도록 합니다.</li>
	<li>프로브 혼성화 완충액의 분취액을 30분 동안 37°C로 가열하여 다음 단계를 준비합니다.</li>
	<li>완충액을 제거하고 37°C에서 30분 동안 400μL의 예열된 프로브 혼성화 완충액으로 예비-하이브리드화합니다.</li>
	<li>8pM의 프로브를 추가하여 표적 화학 감각 수용체(IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a 또는 Orco)에 대한 프로브 용액을 만듭니다. 8 μL의 1 μM 프로브 스톡을 500 μL 예열 프로브 혼성화 버퍼에 추가합니다.</li>
	<li>예열된 프로브 혼성화 버퍼를 제거하고 400μL의 가열된 프로브 용액으로 교체합니다.</li>
	<li>인큐베이터 내부에 배치하고 상자 아래에 덮은 너트에서 37 ° C에서 2 박 동안 조직을 배양합니다.</li>
</ol>6. 프로브 증폭
<ol><li>프로브 세척 버퍼를 37°C로 가열하고, 인큐베이터에서 너트를 추출하여 37°C에서 400μL의 프로브 세척 완충액으로 조직을 5x, 세척당 10분 헹구어 과잉 프로브 용액을 제거합니다. 참고: 6.4단계 준비가 시작될 수 있습니다. 6.4단계의 참고를 참조하십시오.</li>
	<li>실온에서 10% 트윈-20(SSCT)을 함유한 400μL의 5x 식염수-구연산나트륨 400μL를 사용하여 세척당 5분, 2회 세척합니다. ampliification buffer를 벤치 상단에서 실온으로 해동합니다.</li>
	<li>400μL의 증폭 완충액으로 실온에서 10분 동안 배양하여 증폭을 위한 조직을 준비합니다. 증폭 완충액의 점도로 인해 조직이 완전히 잠기지 않을 수 있습니다. 조직 아래에 증폭 완충액을 부드럽게 피펫팅하고 완충액이 잠길 때까지 조직 위로 완충액을 배출하여 혼합합니다.</li>
	<li>헤어핀 h1 18 pM과 헤어핀 h2 18 pM을 95°C에서 95μL 동안 가열하여 3μL 스톡을 90μL 가열하고 어두운 서랍에서 30분 동안 실온으로 냉각하여 별도로 준비합니다. 열 순환기에서 가열하는 동안 헤어핀의 증발을 방지하기 위해 PCR 튜브가 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오. 알림: 시간을 절약하기 위해 6.4단계의 4번째 세탁 단계에서 6.1단계를 시작할 수 있습니다. 머리핀은 교차 반응을 방지하기 위해 별도로 가열해야 합니다. 이 단계에서 헤어핀을 완충액으로 희석해서는 안 됩니다. 헤어핀은 프로브와 함께 프로브 제조업체에서 구입할 수 있습니다.</li>
	<li>6.3단계에서 추가된 증폭 버퍼를 100μL의 증폭 버퍼와 함께 가열된 헤어핀(6.4단계에서)을 포함하는 혼합물로 교체합니다. 일반적인 반응에는 6μL의 h1, 6μL의 h2 및 100μL의 증폭 완충액이 포함됩니다. 참고: 헤어핀 h1 및 h2는 실온으로 냉각한 후 100μL의 증폭 버퍼에 추가할 수 있습니다. 조직 샘플이 한 튜브에서 다른 튜브로 이동하는 것을 방지하기 위해, 단계 6.3의 증폭 버퍼를 제거하고 증폭 버퍼에 희석된 헤어핀 혼합물로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>하룻밤 동안 조직을 배양하고 너트 테이터의 기본 속도를 사용하여 실온의 어두운 곳에서 너트를 추출합니다.</li>
</ol>7. 장착 조직 샘플
<ol><li>배양 조직에서 300μL의 5x SSCT(Tween-20에 희석된 염화나트륨-구연산나트륨)로 희석한 증폭 완충액을 사용합니다. 알림: 희석은 점도를 낮추는 데 도움이 되며 조직에서 증폭 버퍼를 더 쉽게 제거할 수 있습니다. Triton-X 100은 고정전 단계에, Tween-20은 세포막을 투과시키는 작용의 차이 때문에 고정전 단계에, Tween-20을 사용했습니다.</li>
	<li>실온에서 400μL의 5x SSCT로 티슈를 5배 세척합니다. 알림: 필요한 경우 장착할 준비가 될 때까지 조직을 4°C에서 임시로 보관하십시오. 이미징 전 2일을 초과하지 않았습니다.</li>
	<li>유리 슬라이드에 장착 용액 5방울을 만듭니다. 200μL 피펫 팁의 팁을 잘라 더 넓게 만들고 조직을 새 유리 슬라이드로 옮깁니다.</li>
	<li>집게로 조직 샘플을 잡고 일련의 장착 용액 방울에 부드럽게 담그고 헹굽니다. 이 단계에서 조직이 깨지지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>장착 용액으로 장착하고 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 컨포칼 현미경을 사용한 현장 조직 샘플 이미지.</li>
</ol>

모기 후각 부속기에서의 화학감각 유전자 발현 매핑

<ol>
	<li>Konopka, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction+in+Anopheles+mosquitoes.">Olfaction in Anopheles mosquitoes.</a> Chem Senses. 46, (2021).</li><li>Raji, J. I., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+ionotropic+receptors+in+human+host-seeking+mosquitoes.">Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes.</a> Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).</li><li>Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technical+review+and+guide+to+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization.">A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization.</a> PeerJ. 8, e8806 (2020).</li><li>Herre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-canonical+odor+coding+in+the+mosquito.">Non-canonical odor coding in the mosquito.</a> Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).</li><li>Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatial+map+of+antennal-expressed+ionotropic+receptors+in+the+malaria+mosquito.">A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito.</a> Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).</li><li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+in+situ+amplification+for+multiplexed+imaging+of+mRNA+expression.">Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).</li><li>Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+higher+gain,+lower+cost,+greater+durability.">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li><li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction:+multiplexed,+quantitative,+sensitive,+versatile,+robust.">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145 (12), dev165753 (2018).</li><li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed,+quantitative,+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization.">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), dev199847 (2021).</li><li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+a+multiplexed+zoo+of+mRNA+expression.">Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression.</a> Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).</li><li>Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+receptors+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae+tuned+to+amines+and+carboxylic+acids.">Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids.</a> Sci Rep. 7, 40297 (2017).</li><li>Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antennal+transcriptome+profiles+of+anopheline+mosquitoes+reveal+human+host+olfactory+specialization+in+Anopheles+gambiae.">Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae.</a> BMC Genomics. 14, 749 (2013).</li><li>Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-receptor-mediated+regulation+of+chemosensory+gene+expression+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).</li><li>Athrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+gene+expression+in+olfactory+organs+of+the+anthropophilic+Anopheles+coluzzii+and+zoophilic+Anopheles+quadriannulatus.">Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus.</a> BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).</li><li>Task, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoreceptor+co-expression+in+Drosophila+melanogaster+olfactory+neurons.">Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons.</a> eLife. 11, e72599 (2022).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+quantitative+analysis+of+mRNA+expression+within+intact+vertebrate+embryos.">Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos.</a> Development. 145 (1), dev156869 (2018).</li><li>Herre, M., Greppi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+to+visualize+gene+expression+in+peripheral+chemosensory+tissues+of+mosquitoes.">RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year:+spatially+resolved+transcriptomics.">Method of the Year: spatially resolved transcriptomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).</li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

3세대 혼성화 연쇄 반응(hybridization chain reaction, HCR)은 여러 RNA 표적을 시각화할 수 있는 감도와 견고성으로 주목할 만하다8. HCR WM-FISH는 초파리, 닭, 생쥐 및 제브라피쉬의 배아뿐만 아니라 선충류 및 제브라피시의 유충에도 성공적으로 사용되었습니다 10,16,17. 모기 더듬이와 상악 손바닥은 일반적으로 ?...

Anopheles gambiae와 같은 모기 매개체는 복잡한 화학 세계에서 번성하기 위해 말초 후각 부속지에서 발현되는 풍부한 화학 감각 유전자 레퍼토리에 의존하며, 인간 숙주에서 나오는 행동 관련 냄새를 식별하고, 꿀 공급원을 감지하고, 산란 부위를 찾습니다1. 모기 안테나와 상악 손바닥에는 이러한 후각 부속 기관에서 냄새 감지를 유도하는 화학 감각 유전자가 풍부합니다. 리간드 개폐 이온 채널의 세 가지 주요 부류는 모기의 후각 부속지에서 냄새 감지를 유도합니다: 의무 냄새 수용체 공동 수용체(Orco)와 함께 기능하는 냄새 수용체(OR); 하나 이상의 IR 코어 수용체(IR8a, IR25a 및 IR76b)와 상호 작용하는 이온성 수용체(IR); 화학 감각 미각 수용체 (GRs), 이산화탄소 (CO2)를 검출하기 위하여 3개의 단백질의 복합물로 기능하는1,2.
RNA 형광 in situ hybridization은 내인성 mRNA3의 발현을 검출하기 위한 강력한 도구입니다. 일반적으로 이 방법은 표적 mRNA에 상보적인 염기서열을 가진 형광단 태깅 단일 가닥 핵산 프로브를 사용합니다. 형광 RNA 프로브를 표적 RNA에 결합하면 관심 전사체를 발현하는 세포를 식별할 수 있습니다. 최근의 발전으로 이제 전체 마운트 모기 조직에서 전사체를 검출할 수 있게 되었다 4,5. 1세대 하이브리드화 연쇄 반응(HCR) 기술은 RNA 기반 HCR 증폭기를 사용했습니다. 이것은 HCR 증폭기 6,7에 대해 엔지니어링된 DNA를 대신 사용하는 2세대 방법에서 개선되었습니다. 이 업그레이드로 신호가 10배 증가하고, 생산 비용이 크게 절감되었으며, 시약의 내구성이 크게 향상되었습니다 6,7.
프로토콜에서는 모든 유전자 8,9의 공간적 국소화 및 발현을 검출하기 위해 설계된 3세대 HCR 전체 장착 RNA 형광 in situ hybridization(HCR RNA WM-FISH) 방법의 활용에 대해 설명합니다. 이 2단계 방법은 먼저 관심 mRNA에 특이적이지만 개시제 인식 서열도 포함하는 핵산 프로브를 사용합니다. 두 번째 단계에서는 형광 신호를 증폭하기 위해 개시제 시퀀스에 결합하는 형광단 표지 헤어핀을 사용합니다(그림 1). 이 방법은 또한 두 개 이상의 RNA 프로브를 멀티플렉싱하고 프로브 신호를 증폭하여 RNA 검출 및 정량화를 용이하게 한다8. 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 유전자의 전사체 풍부도 및 RNA 국소화 패턴을 시각화하면 화학 감각 유전자 기능 및 냄새 코딩에 대한 첫 번째 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification buffer</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2) 1M&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-50UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymotrypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CHY5S-10VL&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20901-551</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251</td>
			<td>Number 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4853</td>
			<td>1-200 &#181;L tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hairpins&#160;</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence</td>
			<td>h1 and h2 initiator splits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR25a probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRK149&#160;</td>
			<td>AGAP010272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR41t.1 probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>&#160;Probe Set ID: PRK978</td>
			<td>AGAP004432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR64a probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRK700&#160;</td>
			<td>AGAP004923</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR75d probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRK976</td>
			<td>AGAP004969</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR76b probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRI998</td>
			<td>AGAP011968</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR7t probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRL355</td>
			<td>AGAP002763</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR8a probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe Set ID: PRK150</td>
			<td>AGAP010411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80077-236</td>
			<td>0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium Chloride (MgCl2) 1M</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>43-879-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>Model 135</td>
			<td>3-D Mini rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orco probe</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Probe set ID PRD954</td>
			<td>AGAP002560</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (20% )</td>
			<td>Electron Microscopy Services&#160;</td>
			<td>15713-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe hybridization buffer</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>https://www.molecularinstruments.com/</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe wash buffer</td>
			<td>Molecular Instruments</td>
			<td>Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase-K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-557-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Diamond</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>S36972</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl) 5M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160; (10%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (10% )</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>742300</td>
			<td>&#160;1 5/8&#34; square; transparent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybridization chain reaction rna whole-mount fluorescence in situ hybridization of chemosensory genes in mosquito olfactory appendages

모기는 치명적인 질병의 효과적인 매개체이며 후각 부속기에서 발현되는 화학 감각 수용체를 사용하여 화학적 환경을 탐색할 수 있습니다. 화학감각 수용체가 말초 후각 부속기에서 어떻게 공간적으로 조직되어 있는지 이해하면 냄새가 모기 후각계에서 어떻게 암호화되는지에 대한 통찰력을 제공하고 모기 매개 질병의 확산을 막는 새로운 방법을 알려줄 수 있습니다. 3세대 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡화(HCR, RNA, WM-FISH)의 출현으로 여러 화학 감각 유전자의 공간 매핑 및 동시 발현 프로파일링이 가능합니다. 여기에서는 Anopheles 모기 안테나와 상악 손바닥에서 HCR RNA WM-FISH를 수행하기 위한 단계적 접근 방식을 설명합니다. 우리는 이온성 후각 수용체의 발현 프로파일을 조사하여 이 기술의 민감도를 조사했습니다. 설명된 HCR WM-FISH 기법이 RNA 프로브를 스펙트럼적으로 구별되는 3개의 형광단에 테더링하여 다중 연구에 적합한지 물었습니다. 그 결과 HCR RNA WM-FISH가 더듬이와 상악 팔 후각 부속기에서 여러 화학 감각 유전자를 동시에 검출할 수 있도록 매우 민감하다는 증거가 제공되었습니다. 추가 조사를 통해 이중 및 삼중 RNA 표적의 동시 발현 프로파일링에 대한 HCR WM-FISH의 적합성이 입증되었습니다. 이 기술은 변형과 함께 적용될 때 다른 곤충 종의 후각 조직이나 다른 부속지의 관심 유전자를 국소화하는 데 적응할 수 있습니다.

Mosquito vectors such as Anopheles gambiae rely on a rich repertoire of chemosensory genes expressed in their peripheral olfactory appendages to thrive in a complex chemical world and identify behaviorally relevant odors emanating from human hosts, detect nectar sources, and locate oviposition sites1. The mosquito antenna and the maxillary palp are enriched with chemosensory genes that drive odor detection in these olfactory appendages. Three main classes of ligand-gated ion channels drive odor detection in mosquitoes&#39; olfactory appendages: the Odorant receptors (ORs), which function with an obligate Odorant receptor co-receptor (Orco); the Ionotropic receptors (IRs), which interact with one or more IR coreceptors (IR8a, IR25a, and IR76b); the chemosensory Gustatory receptors (GRs), which function as a complex of three proteins to detect carbon dioxide (CO2)1,2.
RNA fluorescence in situ hybridization is a powerful tool for detecting the expression of endogenous mRNA3. In general, this method utilizes a fluorophore-tagged single stranded nucleic acid probe with sequence complementary to a target mRNA. Binding of the fluorescent RNA probe to the target RNA allows identification of cells expressing a transcript of interest. Recent advancements now enable the detection of transcripts in whole-mount mosquito tissues4,5. The first generation of hybridization chain reaction (HCR) technology used an RNA-based HCR amplifier; this was improved upon in a second-generation method that instead used engineered DNA for the HCR amplifier6,7. This upgrade resulted in a 10x increase in signal, a dramatic decrease in production cost, and significant improvement in the durability of reagents6,7.
In the protocol, we describe the utilization of a third generation HCR whole-mount RNA fluorescence in situ hybridization (HCR RNA WM-FISH) method designed for detecting the spatial localization and expression of any gene8,9. This two-step method first utilizes nucleic acid probes specific for the mRNA of interest, but which also contain an initiator recognition sequence; the second step utilizes fluorophore-tagged hairpins which bind to the initiator sequence to amplify the fluorescent signal (Figure 1). This method also allows for the multiplexing of two or more RNA probes and amplifying probe signals to facilitate RNA detection and quantification8. Visualizing the transcript abundance and RNA localization patterns of chemosensory genes expressed in the olfactory appendages offers the first line of insight into chemosensory gene functions and odor coding.

저자 스포트라이트: 모기의 후각 수용체 발현 시각화 

혼성화(hybridization) 연쇄반응 RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages

Our group is interested in the chemo-sensory system of mosquitoes. We hope that by targeting a mosquito sense of taste and smell, we can stop it from finding us and biting us. Hybridization chain reaction fluorescent in situ hybridization is a recent development.This technology is highly sensitive, robust, and capable of multiplexing several gene targets such that we can visualize the expression and localization of these genes simultaneously within their native environment. Special transcriptomics is a cutting edge method used in the field of spatial biology. This technology is capable of multiplexing several thousands of genes, and you can visualize the expression of these genes simultaneously.Our protocol allows us to directly visualize which neurons in the antenna express any of the 50 or so possible ionotropic receptors. This provides us with a foundational roadmap to guide our understanding of how this classical factor receptors might mediate behaviors. Olfactory neurons within olfactory organs of an insect like the antenna, are typically buried inside a protective chitinous shell.This makes visualizing olfactory receptor expression in those neurons very challenging. Our protocol uses a combination of chitinase treatments and a state-of-the-art fluorescence and see-through protocols to overcome these challenges.

Anopheles 안테나에서 화학감각 유전자의 강력한 검출 모기 후각 조직에서 화학감각 수용체의 발현을 감지하기 위해 HCR FISH 방법(그림 1)의 민감도를 조사했습니다. 암컷 아노펠레스(Anopheles) 모기 안테나에서 이전에 보고된 RNA 전사체 데이터에 따라 다양한 IR을 표적으로 하는 프로브를 생성했습니다. 4개의 독립적인 더듬이 전사체 연구의 평균 전사...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Olfactory Receptor Expression in Mosquitoes at JoVE.com

이 기사에서는 모기 안테나와 상악 팔프에서 화학 감각 수용체 유전자의 공간 및 세포 분해능에 대한 통찰력을 밝히기 위해 혼성화 연쇄 반응 RNA 전체 장착 형광 in situ 교잡(HCR, RNA WM-FISH)을 수행하는 데 필요한 방법과 시약을 설명합니다.

Mosquitoes are effective vectors of deadly diseases and can navigate their chemical environment using chemosensory receptors expressed in their olfactory ...

우리 그룹은 모기의 화학 감각 시스템에 관심이 있습니다. 우리는 모기의 미각과 후각을 표적으로 삼아 모기가 우리를 찾아 무는 것을 막을 수 있기를 바랍니다. 혼성화: 연쇄 반응 형광 in situ 혼성화는 최근의 개발입니다.이 기술은 매우 민감하고 견고하며 여러 유전자 표적을 다중화할 수 있어 이러한 유전자의 발현과 국소화를 본래 환경 내에서 동시에 시각화할 수 있습니다. 특수 전사체학은 공간 생물학 분야에서 사용되는 최첨단 방법입니다. 이 기술은 수천 개의 유전자를 다중화할 수 있으며 이러한 유전자의 발현을 동시에 시각화할 수 있습니다.우리의 프로토콜을 통해 안테나의 어떤 뉴런이 50개 정도의 가능한 이온성 수용체를 발현하는지 직접 시각화할 수 있습니다. 이것은 이 고전적 요인 수용체가 어떻게 행동을 중재할 수 있는지에 대한 이해를 안내하는 기본 로드맵을 제공합니다. 더듬이와 같은 곤충의 후각 기관 내에 있는 후각 뉴런은 일반적으로 보호용 키틴질 껍질 안에 묻혀 있습니다.이것은 이러한 뉴런에서 후각 수용체 발현을 시각화하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 당사의 프로토콜은 이러한 문제를 극복하기 위해 키티나아제 처리와 최첨단 형광 및 투명 프로토콜의 조합을 사용합니다.

hybridization-chain-reaction-rna-whole-mount-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Hybridization Chain Reaction RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages

953 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine. 우리 그룹은 모기의 화학 감각 시스템에 관심이 있습니다. 우리는 모기의 미각과 후각을 표적으로 삼아 모기가 우리를 찾아 무는 것을 막을 수 있기를 바랍니다. 혼성화: 연쇄 반응 형광 in situ 혼성화는 최근의 개발입니다.이 기술은 매우 민감하고 견고하며 여러 유전자 표적을 다중화할 수 있어 이러한 유전자의 발현과 국소화를 본래 환경 내에서 동시에 시각화할 수 ?...