습관화 및 냄새 선택 분석 설정을 해준 Mani Ramaswami(NCBS, 방갈로르)와 Baskar Bakthavachalu(IIT Mandi), 공격성 분석에 대한 귀중한 제안을 해준 Pavan Agrawal(MAHE), 구애 분석 챔버 프로토타입 및 Fmr1 돌연변이 플라이 라인을 공유해 준 Amitava Majumdar(NCCS, Pune), MB247-GAL4 라인을 공유해 준 Gaurav Das(NCCS, 푸네)에게 깊은 감사를 드립니다. Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC, 인디애나, 미국), National Institute of Genetics(NIG, 교토, 일본), Banaras Hindu University(BHU, 바라나시, 인도) 및 National Center for Biological Science(NCBS, 방갈로르, 인도)에 초파리 계통에 감사드립니다. 실험실에서의 연구는 SERB-DST (ECR/2017/002963)에서 AD에 수여한 보조금, AD에 수여된 DBT Ramalingaswami 펠로우십(BT/RLF/재진입/2016년 11월) 및 인도 IIT Kharagpur의 기관 지원으로 지원되었습니다. SD와 SM은 CSIR-Senior Research Fellowship에서 박사 학위를 받습니다. PM은 인도 MHRD에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다.

초파리 자폐 스펙트럼 장애의 유전 및 행동 특성에 대한 모델

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

초파리(Drosophila )는 파리와 인간 질병 유전자 사이의 유전자 염기서열 보존이 높기 때문에 인간 신경 질환 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 사용된다9. 수많은 강력한 행동 패러다임은 인간의 질병을 요약하는 돌연변이에서 나타나는 표현형을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 수백 개의 유전자가 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련이 있기 때문에 어떤 모델 유기체에도 ...

자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder, ASD)는 이질적인 신경 장애 그룹을 포함합니다. 여기에는 사회적 의사소통 및 사회적 상호 작용의 다맥락적이고 지속적인 결핍과 제한적이고 반복적인 행동 및 활동 패턴과 관심의 존재를 특징으로 하는 다양한 복잡한 신경 발달 장애가 포함됩니다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 아동 100명 중 1명이 ASD 진단을 받고 있으며, 남성과 여성의 비율은 4.2입니다2. 이 병은 생후 2년이나 3년째에 뚜렷하게 나타난다. ASD 아동은 사회-정서적 호혜성, 비언어적 의사소통 및 관계 기술에 대한 관심이 부족합니다. 그들은 정형화된 운동 운동, 융통성 없고 의례적인 일상 추종, 제한된 관심사에 대한 강렬한 집중과 같은 반복적인 행동을 보입니다. ASD 아동은 촉각, 후각, 소리, 미각에 대한 반응이 높은 반면, 통증과 온도 반응은 상대적으로 낮습니다1. 이 장애의 침투율은 ASD를 앓고 있는 환자마다 다르기 때문에 변동성이 증가합니다.
현재 ASD의 임상적 진단은 모든 형태의 ASD를 포괄하는 확증적인 바이오마커 기반 또는 일반적인 유전자 검사가 없기 때문에 개인의 행동 평가를 기반으로 합니다3. 유전적 및 신경생리학적 기반을 해독하는 것은 치료 전략을 표적으로 삼는 데 도움이 될 것입니다. 지난 10년 동안 대규모 연구를 통해 ASD 환자에서 삭제되거나 돌연변이가 발생하거나 발현 수준이 변경된 수백 개의 유전자를 확인할 수 있었습니다. 현재 진행 중인 연구는 생쥐나 초파리와 같은 모델 유기체를 사용하여 이러한 후보 유전자의 기여도를 검증하는 데 중점을 두고 있으며, 이러한 유전자를 녹아웃하거나 녹다운시킨 후 ASD와 같은 행동 결함을 검사하고 이상을 유발하는 기저 유전 및 분자 경로를 규명합니다. 인간 염색체 유전자좌 16p11.2에서 복제 수 변이(CNV)를 요약한 마우스 모델은 ASD 행동 결함 중 일부를 보여줍니다 4,5,6. 기형 유발 약물인 발프로산(VPA)에 대한 태아 노출은 인간 ASD 7,8과 유사한 특성을 나타내는 또 다른 마우스 모델입니다. 또한, 유전적 증후군 관련 자폐증을 나타내는 다양한 마우스 모델이 존재하는데, 예를 들어, Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c의 돌연변이에 의한 단일 유전자 증후군 모델과 Cntnap2, Shank, Neurexin 또는 Neuroligin 유전자와 같은 유전자의 돌연변이에 의한 단일 유전자 비증후군 모델5.
초파리(Drosophila melanogaster)는 ASD를 포함한 다양한 인간 질환9의 세포, 분자 및 유전적 기반을 연구하기 위한 또 다른 저명한 모델 유기체이다. 초파리와 인간은 분자, 세포 및 시냅스 수준에서 고도로 보존된 생물학적 과정을 공유합니다. 초파리는 ASD 연구에서 성공적으로 사용되어 왔다10,11,12 ASD와 연결된 유전자를 특성화하고 시냅스 형성, 시냅스 기능 및 가소성, 신경 회로 조립 및 성숙에서 그들의 정확한 역할을 해독하기 위해; ASD 관련 유전자의 파리 상동체는 사회적 및/또는 반복적 행동의 조절에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 초파리는 또한 ASD 유전자 및 그 변이체 15,22,23의 스크리닝을 위한 모델로 작용했습니다. 파리에 대한 ASD 연구의 가장 큰 과제는 다른 질병 모델과 달리 단일 ASD 파리 모델이 없다는 것입니다. 돌연변이 또는 특정 ASD 유전자의 파괴의 영향을 이해하기 위해 연구자는 행동 표현형이 ASD 환자의 증상을 충분히 모방하는지 검증한 다음 표현형의 분자 또는 생리학적 토대를 이해해야 합니다.
따라서 ASD와 유사한 표현형을 검출하는 것은 플라이 모델에서 ASD 연구에 매우 중요합니다. 사회적 행동/상호 작용, 의사 소통, 반복적 행동 및 자극에 대한 반응의 결함과 같은 이상을 감지할 수 있는 몇 가지 행동 기술이 수년에 걸쳐 등장했습니다. 또한 이러한 행동 기법의 여러 수정 및 업그레이드는 업스케일링, 분석 자동화, 판독, 정량화 및 비교 방법과 같은 특정 요구 사항에 맞게 여러 실험실에서 이루어졌습니다. 이 비디오 기사에서는 5가지 행동 패러다임의 가장 기본적인 버전을 보여주며, 이를 조합하여 가장 쉬운 방법으로 ASD와 유사한 행동 결과를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
공격성은 생존과 번식에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 타고난 행동이다24. 동족에 대한 공격적 행동은 '사회화 동기'25,26 및 '의사소통'27에 의해 영향을 받으며, 둘 다 ASD의 영향을 받은 개인에서 손상됩니다. 공격적인 행동은 초파리(Drosophila)에 잘 설명되어 있으며, 강력한 공격성 분석법(aggressive assay)28,29,30을 통한 정량화(quantifiability)와 잘 이해된 유전적 및 신경생물학적 기반(neurobiological basis)31은 파리 모델에서 ASD 표현형을 평가하기 위한 적합한 행동 패러다임(behavioral paradigm)32을 만든다. 공격성은 사회적 환경으로부터 멀리 떨어진 사회적 고립에 의해 영향을 받으며, 이는 공격성을 강화합니다. 수컷 파리가 며칠 동안 고립되어 있을 때도 동일한 현상이 관찰되었다33,34. 파리의 사교성을 정량화하는 또 다른 행동 분석법은 소셜 스페이스 어세이 (Social Space Assay) (35)로, 이는 작은 파리 그룹에서 가장 가까운 이웃과 파리 사이의 거리를 측정하여 파리 12,21,36,37 및 환경적으로 유도 된 ASD 파리 모델(38)에서 ASD 유전자 ortholog의 역할을 테스트하는 데 완벽하게 적합합니다. 39.
 Drosophila courtship assay는 자폐증 관련 유전자 18,19,21,40을 포함하여 회로 또는 유전자 조작에 따른 사회적 및 의사 소통 기술의 변화를 분석하는 데 자주 사용되는 또 다른 행동 패러다임입니다. ASD 환자에서는 반복적인 행동 패턴이 널리 나타나며, 이는 청소 및 기타 목적을 위해 수행되는 일련의 뚜렷하고 정형화된 행동인 그루밍 행동에 의해 파리에서 재현됩니다. 그것은 파리21,41에서 ASD 유전자 돌연변이의 영향과 화학 물질 38,39에 대한 노출을 분석하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 분석의 여러 발전 및 자동화는 16,41,42,43 이전에 설명되었습니다. 여기에서는 채택하고 정량화하기 쉬운 가장 기본적인 분석 패턴을 시연합니다.
ASD는 일부 환자44,45,46,47,48,49,50, ASD 모델 유기체(51,52)에서 습관화, 학습 및 기억 능력에 영향을 미치며 다양한 후각 행동(50)에서 결함을 유발하는 것으로 알려져 있다. 초파리(Drosophila)의 빛-떨어짐 점프 습관화(Drosophila light-off jump habituation)는 이전에 ASD 유전자를 선별하기 위해 사용되었다23. 습관화는 후각 습관화 분석법(53,54,55)의 간단한 방법으로 분석할 수 있다. ASD 유전자 돌연변이 또는 유전자 녹다운 조건에서 습관화의 결함을 감지하는 데 사용할 수 있는 고전적인 Y-maze-based binary odor-choice assay56을 사용하여 후각 습관화를 유도하고 결과를 분석하는 방법을 설명합니다. 돌연변이(또는 유전자 녹다운) 또는 약리학적 치료가 파리의 행동에 미치는 영향이 ASD와 유사한 표현형에 해당하는지 평가하기 위해 여기에 설명된 이 5가지 분석을 조합하여 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aggression arena:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plate made of transparent polystyrene</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Diameter of a single well= 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; depth = 1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent plastic/acrylic sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternative: a perforated lid of a cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Social Space Assay:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass sheets and acrylic sheets of customized sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thickness = 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Courtship assay:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut and bolt with threading</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perspex sheets of customized shapes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>i) Lid: A custom-made round transparent Perspex disk (2-3 mm thickness, 70 mm diameter) with one loading hole at the peripheral region and another screw hole at the center (diameter ~ 3 mm for each); ii) A second transparent thicker Perspex disk (3-4 mm thickness, 70 mm diameter), with 6-8 perforations of diameter 15 mm, equidistant from the center; iii) Base: Same as lid except without the loading hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooming assay:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffused glass-covered LED panel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10&#8211;15-Watt ceiling mountable LED panel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Habituation and Y-maze assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Climbing chambers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>x2, Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for connecting Y-maze with entry vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Perspex, custom made, measurements in Figure 5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Borosil #1500017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas washing stopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Borosil #1761021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant (Ethyl Butyrate)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Merck #E15701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax (liquid) light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL #18211</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller clamps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polymed #14098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; roller clamps for flow control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hana #HN-648 (Any aquarium pump with flow direction reversed manually)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-maze</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-shaped glass tube (borosilicate glass)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made, measurements in Figure 5A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Common items:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Any software for video playback (eg.- VLC media player)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.videolan.org/vlc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer for video data analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OD= 60 mm x Height= 140 mm; glass/polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OD= 25 mm x Height= 85 mm; Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video camera with video recording set up</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Camcorder or a mobile phone camera will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fly Aspirator:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Absorbent, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sigma-aldrich #P7793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>200 &#181;L or 1000 &#181;L, choose depeding on outer diameter of the silicone tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone/rubber tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>length= 30-50 cm. The tube should be odorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Composition of Fly food:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ingredients (amount for 1 L of food)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar (8 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL # 19661 (CAS : 9002-18-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cornflour (80 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Organic, locally procured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (20 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid (4 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (40 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tego (Methyl para hydroxy benzoate) (1.25 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Powder (10 g)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HIMEDIA # RM027</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly lines used in the experiments in this study:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild type (Canton S or CS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 64349</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 3605</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]; Fmr1[&#916;50M]/TM6B, Tb[+]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 6930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[*]; Fmr1[&#916;113M]/TM6B, Tb[1]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 67403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 50742</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN1-GAL4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NP1227, NP consortium, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>row-shRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BDSC # 25971</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paradigms for behavioral assessment in drosophila model of autism spectrum disorder

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 상호 작용 및 의사 소통 능력의 결핍, 제한적이거나 반복적인 행동 증가, 경우에 따라 학습 장애 및 운동 장애를 포함한 일반적인 행동 증상을 가진 이질적인 신경 발달 장애 그룹을 포함합니다. 초파리(Drosophila )는 수많은 인간 질병을 모델링하는 데 있어 타의 추종을 불허하는 모델 유기체 역할을 해왔습니다. 많은 유전자가 ASD와 관련이 있음에 따라, 초파리는 이 장애와 관련이 있는 것으로 추정되는 유전자를 검사할 수 있는 강력하고 효율적인 방법으로 부상했습니다. 다양한 기능적 역할을 가진 수백 개의 유전자가 ASD와 관련되어 있기 때문에 ASD의 단일 유전적 파리 모델은 실현 불가능합니다. 대신, 개별 유전적 돌연변이, 유전자 녹다운 또는 ASD 관련 유전자의 파리 상동체에 대한 과발현 기반 연구는 이러한 유전자 산물의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위한 일반적인 수단입니다. Drosophila 에서는 특정 행동 구성 요소의 결함을 쉽게 읽을 수 있는 다양한 행동 기술을 사용할 수 있습니다. 파리의 사회적 공간 분석과 공격성 및 구애 분석은 사회적 상호 작용 또는 의사 소통의 결함을 평가하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 파리의 그루밍 행동은 반복적인 행동을 잘 읽을 수 있습니다. 습관화 분석은 파리에서 습관화 학습 능력을 추정하는 데 사용되며, 이는 일부 ASD 환자에서 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 행동 패러다임의 조합은 파리의 인간 ASD와 유사한 질병 상태를 철저히 평가하는 데 활용될 수 있습니다. Fmr1 돌연변이 파리를 사용하여 인간의 Fragile-X 증후군을 요약하고 파리 뉴런의 POGZ-homolog row knockdown을 사용하여 사회적 간격, 공격성, 구애 행동, 그루밍 행동 및 습관화에서 정량화 가능한 결함을 보여주었습니다. 이러한 행동 패러다임은 파리 모델에서 ASD 및 기타 신경 발달 장애에 대한 연구에 널리 사용될 수 있다는 가정과 함께 가장 간단하고 직접적인 형태로 입증되었습니다.

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurological disorders. It includes a range of complex neuro-developmental disorders characterized by multi-contextual and persistent deficits in social communication and social interaction and the presence of restricted, repetitive behavioral and activity patterns and interests1. According to World Health Organization (WHO), 1 in 100 children is diagnosed with ASD worldwide with a male-to-female ratio of 4.22. The disease becomes evident in the second or third year of life. ASD children show a lack of interest in social-emotional reciprocity, non-verbal communication, and relationship skills. They exhibit repetitive behaviors like stereotyped motor movement, inflexible and ritualized routine following, and intense focus on restricted interests. ASD children show a high degree of response towards touch, smell, sound, and taste whereas pain and temperature response is comparatively low1. The penetrance of this disorder is also different among different patients suffering from ASD and hence, the variability increases.
Current clinical diagnosis of ASD is based on behavioral assessment of the individuals as there is no confirmatory biomarker-based or common genetic test that covers all forms of ASD3. Deciphering the genetic and neurophysiological bases would be helpful in targeting treatment strategies. In the last decade, a large body of research has resulted in the identification of hundreds of genes that are either deleted or mutated or whose expression levels are altered in ASD patients. Ongoing research emphasizes the validation of the contribution of these candidate genes using model organisms like the mouse or fruit-fly, in which, these genes are knocked out or knocked down followed by tests for ASD-like behavioral deficits and elucidation of underlying genetic and molecular pathways causing the anomalies. A mouse model recapitulating Copy Number Variations (CNVs) in the human chromosomal loci 16p11.2 shows some of the ASD behavioral defects4,5,6. Prenatal exposure to a teratogenic drug valproic acid (VPA) is another mouse model depicting traits resembling human ASD7,8. In addition, there exists a range of mouse models that exhibit genetic syndrome-associated autism, for example, single-gene syndromic models caused by mutations in Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c, and single-gene non-syndromic models caused by mutations in genes like Cntnap2, Shank, Neurexin, or Neuroligin genes5.
Fruit-fly (Drosophila melanogaster) is another prominent model organism for studying the cellular, molecular, and genetic bases of a plethora of human disorders9, including ASD. Drosophila and humans share highly conserved biological processes at the molecular, cellular, and synaptic levels. Fruit-flies have been used successfully in ASD studies10,11,12 to characterize genes linked to ASDs and decipher their exact role in synaptogenesis, synaptic function and plasticity, neural circuit assembly, and maturation; fly homologs of ASD-associated genes were found to have roles in the regulation of social and/or repetitive behavior11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. The fruit-fly has also worked as a model for the screening of ASD genes and their variants15,22,23. The biggest challenge in ASD research in flies is that, unlike other disease models, there is no single ASD fly model. To understand the impact of mutations or knocking down of a specific ASD gene, a researcher needs to validate whether the behavioral phenotypes sufficiently mimic the symptoms of ASD patients and then, proceed towards understanding the molecular or physiological underpinnings of the phenotypes.
Hence, the detection of ASD-like phenotypes is vital to ASD research in the fly model. A handful of behavioral techniques have emerged over the years that enable us to detect abnormalities like deficits in social behavior/interaction, communication, repetitive behaviors, and responsiveness to stimuli. In addition, several modifications and upgrades of these behavioral techniques have been made in different labs to suit specific requirements such as upscaling, automation of assays, readouts, quantification, and comparison methods. In this video article, the most basic versions of five behavioral paradigms are demonstrated, which, in combination, can be used to detect ASD-like behavioral outcomes in the easiest way.
Aggression is an evolutionarily conserved innate behavior affecting survival and reproduction24. Aggressive behavior towards conspecifics is influenced by &#39;motivation for socialization&#39;25,26 as well as &#39;communication&#39;27, both being compromised in ASD-affected individuals. Aggressive behavior is well described in Drosophila and its quantifiability through the robust aggression assay28,29,30 and a well-understood genetic and neurobiological basis31 makes it a suitable behavioral paradigm32 for assessing the ASD phenotype in a fly model. Aggression is affected by social isolation away from a social environment, which leads to enhanced aggression; the same has been observed when male flies are housed in isolation for a few days33,34. Another behavioral assay that quantifies sociability in flies is the Social Space Assay35, which measures distances between nearest neighbors and interfly distances in a small group of flies, making it perfectly suited for testing the roles of ASD gene orthologs in fly12,21,36,37 as well as environmentally induced ASD fly models38,39.
The Drosophila courtship assay is another behavioral paradigm frequently used to assay for alteration in social and communication skills upon circuit or genetic manipulation, including Autism related genes18,19,21,40. Repetitive patterns of behavior are prevalent in ASD patients, which is recapitulated in flies by grooming behavior-a series of distinct, stereotyped actions performed for cleaning and other purpose. It has been successfully used to assay for the impact of ASD gene mutations in flies21,41 as well as exposure to chemicals38,39. Multiple advancements and automation in the assay have been described before16,41,42,43; here, we are demonstrating the most basic assay pattern, which is easy to adopt and quantify.
ASD is known to impact the ability for habituation, learning, and memory in some patients44,45,46,47,48,49,50, ASD model organisms51,52 and also causes deficits in different olfactory behaviors50. Drosophila light-off jump habituation has been used previously to screen for ASD genes23. Habituation can be assayed by a simple method of olfactory habituation assay53,54,55. We describe the method to induce olfactory habituation and assay the outcome using a classic Y-maze-based binary odor-choice assay56 that can be used to detect defects in habituation in ASD gene mutant or gene knockdown condition. To assess whether the impact of a mutation (or gene knock-down) or a pharmacological treatment on the behavior of a fly amounts to an ASD-like phenotype, one can use a combination of these 5 assays described here.

저자 스포트라이트: 초파리의 자폐 스펙트럼 장애 증상 탐구 - 유전자 모델 및 행동 검사

자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임

Autism spectrum disorder affects children, leading to impaired communication, social behavior, and enhanced repetitive behavior. Drosophila is an increasingly popular model for autism research to decipher underlying molecular pathways. We describe a set of standard techniques for behavioral characterization of fly autism models.For decoding the molecular underpinnings of autism spectrum disorder in flies, its behavioral manifestations must be precisely established. Quantifying human behavioral traits of autism in Drosophila melanogaster is quite a challenging task. There is no single behavioral paradigm in flies that addresses all the behavioral anomalies of this disorder.We have described a set of five well-established behavioral paradigms in Drosophila, namely, aggression assay, social space assay, coat shape, grooming, and habituation assay. All of these can be used in ASD fly models to characterize and quantify the level of impairments in communicative behavior, repetitive behavior, and social behavior. We described these five techniques in their simplest form so that every lab with minimal fly research facility can adopt them with ease and perform experiments on fly model of autism spectrum disorder, and contribute to the advancement of our understanding of this disease.

공격성 분석 파리 ASD 모델로, Fmr1 돌연변이 파리는63,64 번 사용되었습니다. w1118 수컷을 대조군으로 사용하고 Fmr1 트랜스 이형 접합체 Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M57 수컷 파리를 실험 파리로 사용했습니다. 성인 남성은 5일 동안 격리 튜브에 수용되었습니다. 동형형 수컷(동일한 유전자형, 동일한 ?...

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 및 의사소통 행동의 장애 및 반복적 행동의 출현과 관련이 있습니다. 초파리 모델에서 ASD 유전자와 행동 결핍 사이의 상관 관계를 연구하기 위해 이 논문에서는 사회적 간격, 공격성, 구애, 그루밍 및 습관화 행동을 분석하기 위한 5가지 행동 패러다임을 설명합니다.

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

자폐 스펙트럼 장애는 아이들에게 영향을 미쳐 의사 소통, 사회적 행동 및 반복 행동 강화로 이어집니다. 초파리(Drosophila)는 근본적인 분자 경로를 해독하기 위한 자폐증 연구에서 점점 더 인기 있는 모델입니다. 우리는 파리 자폐증 모델의 행동 특성화를 위한 일련의 표준 기술을 설명합니다.파리의 자폐 스펙트럼 장애의 분자적 토대를 해독하기 위해서는 파리의 행동 징후가 정확하게 규명되어야 합니다. Drosophila melanogaster에서 자폐증의 인간 행동 특성을 정량화하는 것은 상당히 어려운 작업입니다. 이 장애의 모든 행동 이상을 다루는 파리의 단일 행동 패러다임은 없습니다.우리는 Drosophila에서 잘 확립 된 5 가지 행동 패러다임, 즉 공격성 분석, 사회적 공간 분석, 털 모양, 그루밍 및 습관화 분석을 설명했습니다. 이 모든 것은 ASD 플라이 모델에서 의사 소통 행동, 반복 행동 및 사회적 행동의 장애 수준을 특성화하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 다섯 가지 기술을 최소한의 파리 연구 시설을 갖춘 모든 실험실에서 쉽게 채택하고 자폐 스펙트럼 장애의 비행 모델 실험을 수행할 수 있도록 가장 간단한 형태로 설명했으며 이 질병에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 기여했습니다.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

883 조회수.  Indian Institute of Technology Kharagpur. 자폐 스펙트럼 장애는 아이들에게 영향을 미쳐 의사 소통, 사회적 행동 및 반복 행동 강화로 이어집니다. 초파리(Drosophila)는 근본적인 분자 경로를 해독하기 위한 자폐증 연구에서 점점 더 인기 있는 모델입니다. 우리는 파리 자폐증 모델의 행동 특성화를 위한 일련의 표준 기술을 설명합니다.파리의 자폐 스펙트럼 장애의 분자적 토대를 해독하기 위해서는 파리의 행동 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 초파리의 자폐 스펙트럼 장애 증상 탐구 - 유전자 모델 및 행동 검사

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in social interaction and ability for communication, enhanced restricted or repetitive behaviors, and also, in some cases, learning disability and motor deficit. Drosophila has served as an unparalleled model organism for modeling a great number of human diseases. As many genes have been implicated in ASD, fruit flies have emerged as a powerful and efficient way to test the genes putatively involved with the disorder. As hundreds of genes, with varied functional roles, are implicated in ASD, a single genetic fly model of ASD is unfeasible; instead, individual genetic mutants, gene knockdowns, or overexpression-based studies of the fly homologs of ASD-associated genes are the common means for gaining insight regarding molecular pathways underlying these gene products. A host of behavioral techniques are available in Drosophila which provide easy readout of deficits in specific behavioral components. Social space assay and aggression and courtship assays in flies have been shown to be useful in assessing defects in social interaction or communication. Grooming behavior in flies is an excellent readout of repetitive behavior. Habituation assay is used in flies to estimate the ability for habituation learning, which is found to be affected in some ASD patients. A combination of these behavioral paradigms can be utilized to make a thorough assessment of the human ASD-like disease state in flies. Using Fmr1 mutant flies, recapitulating Fragile-X syndrome in humans, and POGZ-homolog row knockdown in fly neurons, we have shown quantifiable deficits in social spacing, aggression, courtship behavior, grooming behavior, and habituation. These behavioral paradigms are demonstrated here in their simplest and straightforward forms with an assumption that it would facilitate their widespread use for research on ASD and other neurodevelopmental disorders in fly models.

Autism Spectrum Disorder (ASD) is associated with impaired social and communicative behavior and the emergence of repetitive behavior. For studying the interrelation between ASD genes and behavioral deficits in the Drosophila model, five behavioral paradigms are described in this paper for assaying social spacing, aggression, courtship, grooming, and habituation behavior.

연구

신경과학

Aggression Assay in Drosophila to Analyze Autism Spectrum Disorder &#40;ASD&#41;&#45;Related Communication and Social Behavior Deficit

To begin, take a standard 24-well plate and fill half of each well with regular fly food. Let the food dry overnight. Make a small, 2.5-millimeter hole on a transparent plastic or acrylic sheet and place it over a well plate.Using a stereo microscope, separate newly enclosed flies of the desired genotype based on their sex. Insert half the male flies individually into single housing tubes. Keep the other half of the male flies in a group of 10 with the female flies in a regular group housing vial, creating a social condition.Store all vials at 25 degrees Celsius for five days. Mouth aspirate two male flies from either the single or group housing chambers to the aggression arena plate through the hole in the lid. Move the hole away immediately to ensure that the flies cannot escape.After one to two minutes of acclimatization, start a timer for 20 minutes. Make sure to video record the flies. Play the video on a computer and count the total number of aggressive bouts for each fly.The number of aggressive bouts in 20 minutes was significantly reduced in the case of mutant males than in the control males.

자폐 스펙트럼 장애(ASD) 관련 의사소통 및 사회적 행동 결핍을 분석하기 위한 초파리 의 공격성 분석

Social Space Assay to Explore Social Behavior Defects in the Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

To begin, separate the male flies from a mixed population of flies on ice and put them in a collection vial. To prepare the arena, place two triangular acrylic spacers flat on top of a rectangular glass pane, such that the right angles of the acrylic spacers are aligned with the corners of the glass pane. Then place two rectangular acrylic spacers flat on the glass pane aligned with the bases of the two triangular spacers.Confirm that the four acrylic spacers surround a triangular arena on the rectangular glass pane that is not covered by spacers. Position a sticker of a ruler on one of the triangular spacers, ensuring that it is visible from the top. Now place a second rectangular glass pane on top of the acrylic spacers to align it with the glass pane at the bottom.Using four small binder clips, secure the panes and spacers. For the assay, remove the bottom right binder clip and slightly shift the rectangular spacer outwards to create a gap. To transfer flies from the collection vial into the social space arena, gently aspirate them through the created space.Immediately slide the rectangular spacer and secure the binder clip back in its position. Holding the chamber upright, gently pound three times onto a soft pad to let all the flies settle at the base. Clamp the chamber in the upright position and start the timer.Take a clear photo of the arena after 20 minutes. Analyze with ImageJ to list the inter-fly nearest neighbor distances. The mutant flies show significantly higher nearest neighbor distances than the control counterparts, indicating a preference for greater distancing from other flies.

자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 사회적 행동 결함을 탐색하기 위한 사회적 공간 분석

Courtship and Grooming Behavior Assay to Study Autism Spectrum Disorder in Drosophila

To begin, assemble all four pieces of the courtship chamber together. Using the aspirator, gently transfer a five-day isolated test male fly from the single housing tube to the courtship chamber containing the single premated female. Rotate the lid quickly to close the chamber.Record the behavior of the flies for 15 minutes to calculate the courtship index and total number of copulation attempts. After setting up the assay arena, transfer a single housed male fly into the arena with an aspirator. Immediately slide away the hole in the lid to prevent the fly from escaping.Place the grooming arena on a diffused LED panel and let the fly acclimatize for one minute. Video record the fly for 10 minutes. Analyze the videos and calculate the grooming index, grooming latency, grooming bout number, and mean grooming bout duration.Mutant flies showed a significantly lower courtship index, as well as a reduced number of attempts to copulate. Latency to first grooming was significantly decreased in the mutant flies, whereas the mean grooming bout duration and grooming index were significantly increased.

초파리의 자폐 스펙트럼 장애를 연구하기 위한 구애 및 그루밍 행동 분석

Olfactory Habituation Assay to Gain Genetic and Behavioral Insights into Autism Spectrum Disorder Using Drosophila Models

To begin, obtain the flies prepared for habituation assay. Place one milliliter of the preferred odorant diluted with paraffin liquid light in a 1.5 milliliter microfuge tube. Vortex the tube for 10 minutes and cover it with evenly perforated plastic wrap.Using a wire, suspend the odorant tubes in separate media bottles containing flies. Cover the bottle well with cotton and wrap it with craft paper to prevent a fusion of the odor and vapor. Label the control and odor-containing bottles as naive and odor-exposed respectively.Maintain these induction bottles for three days in an incubator. For the Y-maze assay, attach the Y-maze to the adapter, fix the bottom of the Y-maze to the entry vial, and then attach to climbing chambers to the two arms of the Y-maze. Using odor-free silicone tubes, connect the tapering end of each climbing chamber with the reagent bottle containing the odorant.With the vacuum pump, drive the odorant from the gas bottles to the two arms of the Y and let it saturate for 15 minutes. Gently introduce the star flies of each vial into the entry vial of the Y-maze setup. After brief acclimatization, connect the entry vial with the Y-maze adapter to begin the test.Let the flies climb the Y-maze arms and get trapped in the two collection chambers for over one minute. Upon completion, tap back the flies to the bottom of the entry vial and switch the position of the arms of the Y-maze to avoid side bias. Record the number of flies climbing each of the two arms of Y-maze within the time duration.The row knockdown flies did not get habituated after a three day odorant exposure as compared to the wild-type flies.