이 연구는 Wings for Life Foundation(WFL-IT-20/21), European Union Next-Generation EU-National Recovery and Resilience Plan(NRRP)-mission 4 component 2, investment n. 1.4-CUP N. B83C22003930001(Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) 및 Marina Romoli Onlus의 지원을 받았습니다. 이 원고는 저자의 견해와 의견만을 반영하며, 유럽연합이나 유럽연합 집행위원회는 이에 대한 책임을 지지 않습니다. 데이터 및 메타데이터는 Zenodo 10.5281/zenodo에서 사용할 수 있습니다.10433147. 이미지는 Biorender https://www.biorender.com/ 로 생성되었습니다.

척수 유기형 배양에서 h-SC-NES 세포의 장기 생착

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

SCI 환자를 위한 효과적인 치료법은 아직 없습니다. 다양한 접근법이 테스트되었으며 가장 유망한 접근법 중 하나는 재생 전략 세포 교체를 기반으로 합니다. 현재 재생 의학 분야의 발전은 세포 이식의 효능과 안전성을 단독으로 또는 다른 접근법과 결합하여 테스트할 수 있는 새로운 플랫폼을 요구하고 있습니다. 이들의 전임상 검증은 추가 임상 연구를 진행하는 데 필수적입니다. SC 기관형 배양은 신경 퇴행, 신경 재생 및 신경 발달의 다양한 측면을 연구하고 새로운 치료 접근법의 효과를 조사하는 데 유용한 플랫폼입니다23. 특히, 원래의 조직구조(histoarchitecture)와 세포 및 미세환경 조성(cell and microenvironment composition)의 유지와 같은 유기형 배양(organotypic culture)의 특정 특징은 세포 생착(cell engraftment), 통합(integration), 분화(differentiation) 및 성숙(maturation)과 같은 이식 역학을 밝히는 데 유리합니다.
발표된 프로토콜과 일관되게 SC 기관형 절편은 건강한 조건에서 약 2-3주 동안 배양액을 유지할 수 있으며, 이는 세포 치료의 테스트 계획에 필요한 장기 조사 및 기능 스크리닝에 대한 사용을 제한합니다. SC 조직 내에서 이식된 세포의 올바른 운명을 향한 분화 및 성숙과 같은 중요한 과정을 탐색하려면 장기적인 모니터링이 필요합니다. 이러한 세포 과정은 동물 모델의 일반적인 이식 과정에서 매우 중요합니다. 생체 내에 존재하는 많은 특징을 모방하는 생체 외 시스템의 가용성은 전임상 스크리닝 단계에서 도움이 될 것입니다.
이러한 이유로 이 연구에서는 최대 90일 동안 생존 가능한 SC 절편을 유지하여 일반적인 배양 기간을 3배로 늘릴 수 있는 최적의 장기(≥30일) SC 유기형 배양 방법을 제안합니다. 또한, SC 절편 내에서 안정적인 h-SC-NES 세포 생착과 최대 30일 동안 이식 배양이 유지되는 것을 보여줍니다. DPT 30까지 세포 생존을 확인하기 위해 GFP 발현을 관찰하여 시간 경과에 따른 세포 생착을 모니터링했습니다. 30 DPT 후, 세포 사멸 속도를 평가했습니다. 문헌에서, 7 DPT에서 SC-절편에서 이식된 h-SC-NES 세포의 세포사멸 평가가 보고되었다40. 여기에서는 DPT 30에서 세포 사멸 분석을 확장하여 이전 시점(DPT 7)에 대한 자가사멸 속도를 비교했습니다. 우리는 우리의 데이터가 문헌과 일치한다는 것을 알게 되었으며, 이는 이식된 h-SC-NES 세포가 우리 연구에서 최적화된 배양 조건에서 유지될 경우 나중에 시점에서도 생존할 수 있음을 시사합니다. 이 개선된 장기 생체 외 플랫폼 단독으로 그리고 이식 구성에서 SCI를 위한 줄기세포 기반 이식에 대한 전임상 스크리닝에서 연구자들에게 도움이 될 것입니다. 이를 통해 이식의 성공을 촉진하는 추가 생체 내 연구를 위한 최상의 세포 후보를 식별할 수 있습니다. 또한, 초기 스크리닝 후 SC 기관형 절편을 생체 내 연구와 병행하여 동물 모델에서 관찰된 장기적인 세포 역학 및 거동을 확인 및 확증하거나 기계론적 연구를 지원하기 위해 사용할 수도 있습니다.
당사의 프로토콜은 이러한 장기 유기형 모델을 생성하는 방법을 자세히 설명하지만 몇 가지 중요한 단계도 논의해야 합니다. SC organotypic 배양의 생성과 관련하여, 수술 및 배양의 첫 단계에서 몇 가지 어려움이 있습니다. 잘 수행된 수술 절차는 원래의 조직 구조를 유지하는 절편을 생성하는 데 필수적입니다. 격리 중에 SC가 손상되면 절편은 전형적인 해부학적 구조를 잃을 수 있으며 조직 손상은 과도한 염증 유발을 유발하여 건강에 해로운 상태와 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 수술 중 가장 어려운 단계는 척추에서 SC를 추출하고 분리된 SC에서 수막을 제거하는 것입니다. 이러한 단계의 성공 여부는 운영자의 경험에 달려 있습니다. 따라서 실험을 시작하기 전에 훈련 기간을 두는 것이 좋습니다.
헬리콥터를 통한 SC의 관상 절개도 어려운 단계입니다. 격리된 SC는 블레이드에 정확히 수직인 절단 데크에 배치해야 합니다. 작업자는 또한 블레이드를 절단 데크에 수직으로 배치해야 합니다. 이러한 예방 조치는 동일하고 다른 실험 간에 재현 가능한 슬라이스를 생성하는 데 필요합니다. 또 다른 중요한 문제는 수술 시간이 제한되어 있다는 것입니다: 전체 절편 생성 절차는 ~30분이 소요되어야 합니다. 작업자가 수술과 절단에 더 많은 시간을 할애하면 SC 조직에 문제가 발생하여 배양의 성공과 실험의 다음 단계를 손상시킬 수 있습니다.
절편을 배양막에 올려놓으면 올바르게 공급하는 것이 중요합니다. GDNF는 조직 회복과 생존을 유지하는 데 필요합니다. 헬리콥터로 절단하는 것은 조직에 충격을 주며, 이러한 이유로 절단 직후 얼음처럼 차가운 해부 매체에 조각을 넣어 염증 유발 및 사망 촉진 분자의 과잉을 제거합니다. 그런 다음 GDNF로 개질된 신선한 배지로 절편을 배양막(세포 배양 삽입물)에 올려 멤브레인에 대한 더 빠른 회수와 절편 접착을 촉진합니다. GDNF는 그것의 짧은 반감기 때문에 문화에 있는 첫번째 주 동안 매체에 매일 추가되어야 한다50,51. 우리는 절편이 조직 회복과 생존력을 촉진하기 위해 배양 첫 날 동안 GDNF의 지속적인 존재가 필요하다는 것을 관찰했습니다. 어쨌든 GDNF의 존재는 전체 배양 기간 동안 중요하므로 추가 시점에서 GDNF 투여를 중단하는 것은 강력히 권장되지 않습니다.
배양 첫 주에는 육안과 현미경으로 절편을 거시적으로 확인하는 것도 중요합니다. 반투명 조직과 테두리의 투명성은 절편이 멤브레인과 생존 가능한 조직에 적절하게 접착되었다는 신호입니다. 괴사 조직은 처음 거시적으로 볼 때 매우 하얗게 보이고 괴사 부위는 현미경에서 짙은 회색으로 보입니다. 배양에서 몇 주 후에 조직의 형태가 바뀔 수 있습니다: 세포의 움직임과 막에 대한 조직 접착이 이 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 세포로 채워진 일부 조각에서 중앙 내강이 손실되고 등쪽 및 배쪽 뿔 형태가 손실되는 것을 관찰했습니다. 이것은 주로 더 작은 조각에서 발생하지만 대부분은 원래 조각에 가까운 해부학적 구조를 유지합니다. 슬라이스는 일반적으로 요추 또는 흉부 영역에서 생성되는데, 이러한 방식으로 시간이 지남에 따라 원래의 조직 구조를 유지할 수 있는 적절한 크기를 가질 수 있기 때문입니다: 너무 작으면 구조를 잃고 너무 크면 중앙 영역이 괴사를 겪을 수 있습니다. 따라서 우리는 최적의 장기 배양을 위해 적절한 크기의 절편을 생성하기 위해 새끼 쥐의 요추 영역을 사용했지만 원칙적으로 다른 세그먼트를 고려할 수 있습니다. 또한, 우리는 요추 부위를 사용하기로 결정했는데, 이는 복부 영역과 등쪽 부위가 서로 더 잘 구별되기 때문입니다. 또한, 이 영역은 SCI에서 세포 교체 요법의 관심 부위인 운동 뉴런과 회백질의 비율이 더 높은 조직 영역을 나타냅니다. 세포를 절편에 이식하는 것과 관련하여 주요 문제는 유리 마이크로니들 팁의 파손과 관련이 있습니다. 세포가 통과하기 위한 구멍이 너무 크면 미세주입 중에 SC 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 너무 작으면 세포 적층이 바늘을 막아 이식 과정을 방해할 수 있습니다. 이식 절차는 세포의 고통과 사멸을 최소화하기 위해 1시간 이내에 완료되어야 합니다.
제안된 프로토콜은 다양한 유형의 조사를 위한 최적의 다재다능한 도구를 제공합니다. 여기에서는 장기 플랫폼을 적용하여 30일 동안 마우스 SC 조직 내에서 분화의 첫 단계에서 h-SC-NES 세포의 이식을 검증합니다. 제안된 접근 방식의 주요 참신함은 공동 문화 프로토콜의 최적화입니다. GM의 구성 요소는 SC 절편과 이식된 h-SC-NES 세포의 장기 신경 세포 생존을 유지합니다. 실제로, GM은 무혈청 배지로서, 이전에 유기형 절편 배양에 사용된 배지와 관련하여 신경 세포의 운명을 향하여 이식된 세포의 분화를 유지한다47.
SCI에 대해 제안된 모델과 관련하여, 실험은 일반적으로 성체 마우스를 대상으로 수행됩니다. 지금까지, 신생아와 성체 SC 사이의 가장 중요한 차이점은 성체 마우스에 비해 신생아에서 발견되는 더 높은 재생 잠재력과 관련이 있다(52). 그러나 이러한 차이는 우리가 제안하는 프로토콜의 유형에 영향을 미치지 않는데, 여기서는 상주 뉴런의 재생 능력보다는 호스팅 조직 환경에 대한 이식된 세포의 반응에 초점을 맞추기 때문입니다. SCI 후 신생아 마우스와 성인 마우스의 또 다른 차이점은 성인에서 발생하는 신경교 반흔의 형성과 관련이 있습니다. 이 측면은 1 차 및 2 차 부상으로 인한 복잡한 생리 병리학 적 과정을 고려하지 않는 제안 된 모델에서 고려되지 않습니다.
응용 분야와 관련하여, 이 플랫폼은 SC 유기형 모델에 존재하는 상주 회로와 이식된 세포 간의 통합을 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 유전 공학 도구는 이미 시냅스 연결성을 평가하기 위해 CNS에서 사용되었으며 이와 관련하여 활용 될 수 있습니다 53,54,55. 특히, 생착된 세포와 SC 체외 조직 사이의 시냅스 형성을 평가하여 통합을 조사하고 검증할 수 있습니다. 이러한 장기 유기형 배양은 신경 보호 및 신경 재생제 또는 새로운 분자/물질을 테스트하거나 SC와 관련된 신경 퇴행성 질환을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다. 특정 신경퇴행성 질환을 연구하기 위해서는 병리학 관련 단계(즉, 신생아, 청소년, 성인)에서 특정 병리학 관련 돌연변이를 보유한 형질전환 마우스와 같은 관련 모델에서 생성된 SC 절편을 배양하기 위해 프로토콜을 조정해야 합니다. 결론적으로, 당사의 프로토콜 및 기관형 배양은 일반적으로 특정 장기의 이식물로서 2D 세포 배양과 in vivo 모델 간의 격차를 해소하는 기능을 제시하여 기초 연구와 전임상 테스트 모두에 귀중한 도구임을 확인합니다.

외상성 척수 손상(SCI)은 환자와 간병인에게 파괴적인 신체적, 심리적, 경제적 결과를 초래합니다1. 다양한접근법으로 SCI에서 축삭 재생을 촉진하기 위한 많은 시도가 이루어졌으며, 2,3,4 세포 교체 요법을 통해 손상 부위의 근위 뉴런과 원위 뉴런 사이의 뉴런 릴레이 형성에 의해 일부 유익한 효과가 입증되었습니다. 이식된 세포는 영양 지원, 면역 조절, 가소성 유도를 통한 잃어버린 신경 회로 재생, 세포 교체, 축삭 재수초화 등 많은 역할을 할 수있기 때문에 세포 치료에 대한 관심은 여전히 증가하고 있다6.
최근에는 인간 신경 줄기/전구 세포(NSC/NPC)에 대한 연구가 주력되고 있습니다7. 여러 연구에 따르면 NSCs/NPCs는 성상세포 반응(astrocyte response)8을 조절하고, 재생 인자(proregenerative factor)9,10의 분비를 촉진하며, SCI11,12에서 누락된 신경 세포를 대체한다. 그러나 이식된 세포가 기능적 뉴런으로 분화하는 것을 뒷받침하는 연구는 여전히 빈약합니다. 더욱이, 손상된 척수(SC)에서 이식된 세포의 생존 및 분화율은 낮은데13, 이는 이식된 세포가 in vivo에서 분화하는 데 몇 주, 심지어 몇 달이 걸리기 때문일 수 있다. 또한 현재 연구는 세포 교체 요법의 많은 생화학적, 분자적, 세포 및 기능적 측면을 완전히 설명하지 못했습니다. 이러한 맥락에서 세포 생착 메커니즘, 생착된 세포의 증식 능력, 세포의 특정 유형 또는 하위 집단으로 분화하고 상주 뉴런과 시냅스를 형성하는 능력을 연구하기 위해 간단하고 빠르며 비용 효율적인 모델이 필요합니다.
조직학적 연구를 전기생리학적 기록과 전사체 및 단백질체 프로파일링에 통합하는 것은 세포 이식 후 발생하는 분자 캐스케이드를 완전히 이해하기 위해 필요합니다. 이는 확실히 전임상 모델 및 임상 연구에서 새로운 세포 대체 요법의 설계 및 검증을 가속화할 것입니다. 실제로, 현재까지 설치류, 대형 동물 및 비인간 영장류의 사용은 이식 후 많은 세포 과정을 설명하는 데 가치가 있었다14. 그러나 높은 비용, 높은 윤리적 영향 및 유기체의 복잡성으로 인해 그 사용은 종종 간단하지 않거나 생화학 및 분자 과정을 밝히는 데 적합하지 않습니다. 또한, 생물학적 차이, 종간(신진대사) 및 종내 변동성(성별, 연령) 모두와 관련된 많은 단점을 제시할 수 있습니다.  이러한 요인은 스트레스가 많은 상황과 같은 외부 요인과 함께 실험의 결과와 인간에 대한 치료적 번역 측면에서 예측 가능성을 변경할 수 있습니다 15,16,17.
따라서 많은 그룹에서 동물 모델 외에도 2D in vitro cell culture 및 ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures)를 사용합니다. 2D 세포 배양은 단일 세포 및/또는 세포 집단 수준에서 특정 생물학적 과정을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 시스템입니다. 그럼에도 불구하고, 단층 세포 배양은 전체 유기체에서 발견되는 복잡성을 반영하지 않습니다. 조직 구조 및 생리학적 환경의 부족으로 인해 2D 배양 시스템이 조사된 조직18,19,20의 주요 구조적, 형태학적, 기능적 측면을 완전히 모방할 수 없습니다. 유기형 배양은 이러한 문제 중 일부를 극복할 수 있습니다. 유기체형 모델(organotypic model)은 조직 또는 장기의 일부를 이식하고 제한된 기간 동안 생체 외(ex vivo)로 유지하는 것을 기반으로 한다21,22. 특히, 이식된 조직의 절편은 영양분이 절편의 거의 모든 세포에 쉽게 도달할 수 있도록 정확한 두께로 생성됩니다. 이들은 해마(hippocampus), 시상하부(hypothalamus), 소뇌(cerebellum), 시상(thalamus), 대뇌피질(cerebral cortex), 흑질(substantia nigra) 및 선조체(striatum), 척수(spinal cord)와 같은 중추신경계의 다양한 영역에서 생성될 수 있다 23. 기관형 배양은 조직 구조, 세포의 공간적 분포, 세포 다양성 및 기원 기관의 환경(즉, 세포외 기질 구성)을 유지합니다. 더욱이, 그들은 원래의 신경 활동, 세포 사이의 연결, 특히 이식 후 단거리 회로를 보존합니다.
이러한 측면은 단층 배양 및 동물 모델 모두와 관련하여 생체 외 배양에 몇 가지 이점을 제공합니다. 그들은 생체 내에서 발견되는 주요 조직 기능을 유지하지만 비용을 절감하고 배양 환경 매개변수 24,25,26,27,28,29의 정확한 조절로 다양한 유형의 분자, 세포 및 기능성 실험을 수행할 수 있습니다. 기관형 절편은 또한 특정 상태의 주요 조직병리학적 특징을 유사하게 함으로써 다양한 신경학적 장애에 대한 모델을 개발하기 위해 활용될 수 있다30. 더욱, 본래 다세포 조직 환경의 보유는 그(것)들에게 약 검열 그리고 신경 보호와 신경 재생 분자 및 물자 시험을 위한 적합한 플랫폼을 만듭니다.
이 연구에서는 NSC 이식을 최적화하기 위한 모델로 SC 기관형 배양을 사용할 것을 제안합니다. 몇 주 동안 숙주(SC 조직)와 이식(NSC)의 생존을 보장하기 위해 최적의 배양 조건이 필요하기 때문에 이는 사소한 일이 아닙니다. 유기형 배양, 뇌 유래 및 SC 유래, 다양한 유형의 세포에 이식된 다양한 연구 그룹. 대부분의 연구는 중간엽 줄기 세포(31,32,33), 후각 피복 세포(34) 또는 NSC (35,36,37,38,39,40)의 이식을 보여주었고 생착 된 세포와 숙주 세포의 상호 작용, 전체 시스템의 생존 및 이식 된 세포가 뉴런 또는 뉴런 유사 세포로 분화하는지 여부를 평가했습니다 생체 외 조직 환경내부 32,33,41. 그들 중 일부는 이식 후 세포의 재생 잠재력을 평가하고, 조직 내부의 축삭 성장(37,40,41), 희소돌기아교세포(42)의 생착된 전구체의 수초화 능력, 생착된 세포가 숙주 조직(43)으로 이동하는 것, 그리고 이식된 세포가 재생 환경(31)으로 밀어내는 인자를 방출하는지 여부를 관찰했다. 현재 연구의 한 가지 한계는 장기간 동안 생착을 탐색하지 않는다는 것입니다.
NSC가 in vivo44,45에서 분화하는 데 몇 주가 걸리는 것으로 보인다는 점을 고려하여, 이 연구는 최대 90일 동안 장기(≥30일) 마우스 SC 절편을 생성하고 유지하는 방법에 초점을 맞춥니다. 절편은 원래의 해부학적 구조를 유지하고 시간이 지남에 따라 낮고 안정적인 세포사멸률과 높은 세포 생존율을 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 우리는 신경 표지자 RNA 결합 fox-1 homolog 3(RBFOX3) 및 신경 필라멘트 경쇄(NFL)의 확산 발현을 관찰했으며, 후자는 시간이 지남에 따라 절편 주위에 축삭 돌기가 증가하는 추세를 보여 건강한 상태를 입증했습니다. 또한, 신경 세포 분화의 첫 단계에서 SC 슬라이스 GFP 발현 인간 SC 유래 신경 상피 줄기 세포(h-SC-NES) 세포에 성공적으로 이식했습니다. NSC 이식편은 이식 후 30일 동안 유지되었으며 세포는 배양 기간 내내 GFP 발현을 보였습니다. 이식 후 일일(DPT)(30)에 세포의 자가사멸 속도는 또한 동일한 세포(40)에서 DPT 7에서 관찰된 세포사멸 속도 값과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 세포는 조직 환경에 생착하는 것처럼 보였고 최대 몇 주까지 생존했습니다.
요약하면, 우리의 데이터는 원래의 세포 구조와 조직 환경을 손상시키지 않고 배양 SC 유기형 절편을 3개월 동안 유지할 수 있음을 보여줍니다. 가장 중요한 것은 in vivo 실험을 진행하기 전에 세포 요법을 테스트하는 데 활용할 수 있어 비용과 실험 시간을 줄일 수 있다는 것입니다. 여기에서는 마우스 SC 유기형 절편을 생성하는 모든 과정과 이를 장기간(≥30일) 동안 유지하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 절편에 NPC 이식을 수행하는 방법과 다운스트림 분석을 위해 이를 유지하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-cleaved Caspase-3,&#160; (Asp175) (5A1E) (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP (Mouse) - monoclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G6539</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Mouse) - monoclonal, clone 235-1&#160;</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Human Nuclei (Rabbit)</td>
			<td>NeoBiotechnologies</td>
			<td>RBM5-346-P1</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NeuN (RBFOX3) (Rabbit) - polyclonal</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL (Mouse)</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>MAB1615</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NFL H-Phospho (Rabbit) -polyclonal</td>
			<td>Biologend</td>
			<td>840801</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Polymount</td>
			<td>Poly-sciences</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>118364227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture graded water</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>W3500-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from rat tail</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>C7661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - A1 Confocal Microscope (Eclipse Ti)</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>gf144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>03-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;&#160;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Mouse IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21236</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti Rabbit IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21244</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph Pad-Prism</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Software for Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-050</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral prep</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>17446-LV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L32250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11090-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>to load cells in the needle for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture membrane</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscroscope cover glasses</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>ECN 631-1572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (35mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Microinjector for transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for imaging and acquisition</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope for surgery</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers-Dumont #5-inox</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors, 8.5 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term mouse spinal cord organotypic slice culture as a platform for validating cell transplantation in spinal cord injury

척수 손상(SCI)에 대한 해결책적 치료법은 복잡한 병태생리학으로 인해 여전히 부족합니다. 가장 유망한 재생 접근법 중 하나는 손실된 조직을 대체하고 기능 회복을 촉진하기 위한 줄기 세포 이식을 기반으로 합니다. 이 접근법은 더 비싸고 시간이 많이 소요되는 동물 실험을 진행하기 전에 안전성과 효능을 위해 in vitro 및 ex vivo 에서 더 잘 연구되어야 합니다. 이 연구에서는 인간 신경 줄기 세포를 이식한 쥐 척수(SC) 유기형 절편을 기반으로 SCI에 대한 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 장기 플랫폼 구축을 보여줍니다.
표준 SC 유기형 배양은 in vitro에서 약 2주 또는 3주 동안 유지됩니다. 여기에서는 최대 90일 동안 장기 유지 관리(≥30일)를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. SC 절편의 장기 배양에 사용되는 배지는 신경 줄기 세포를 기관형 모델에 이식하는 데에도 최적화되었습니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 운반하는 인간 SC 유래 신경상피 줄기(h-SC-NES) 세포를 마우스 SC 절편에 이식했습니다. 이식 후 30일이 지난 후에도 세포는 여전히 GFP 발현과 낮은 세포사멸 속도를 보이며, 이는 최적화된 환경이 조직 내에서 세포의 생존과 통합을 유지했음을 시사합니다. 이 프로토콜은 SC 조직에서 세포 대체 요법을 효율적으로 테스트하기 위한 강력한 참조를 나타냅니다. 이 플랫폼을 통해 연구자들은 다양한 세포 이식 요법에 대한 생체 외 사전 스크리닝을 수행할 수 있어 생체 내 실험을 진행하기 전에 가장 적절한 전략을 선택할 수 있습니다.

Traumatic spinal cord injury (SCI) has devastating physical, psychological, and economic consequences for patients and caregivers1. Many attempts have been made to promote axonal regeneration in SCI with different approaches2,3,4 and some beneficial effects were demonstrated by the formation of neuronal relays between proximal and distal neurons in the injury site through cell replacement therapies. The interest in cell therapies is still growing5 since transplanted cells can play many roles, including providing trophic support, immune modulation, regenerating lost neural circuits through induction of plasticity, cell replacement, and axon remyelination6.
Recently, the main effort in the field focused on human neural stem/progenitor cells (NSCs/NPCs)7. Several studies suggest that NSCs/NPCs modulate astrocyte response8, promote the secretion of proregenerative factors9,10, and replace missing neuronal cells in SCI11,12. However, studies that support the differentiation of transplanted cells into functional neurons are still poor. Moreover, transplanted cell survival and differentiation in the injured spinal cord (SC) are low13, possibly because transplanted cells take several weeks, even months, to differentiate in vivo. Additionally, current studies have not completely elucidated many biochemical, molecular, cellular, and functional aspects of cell replacement therapies. In this context, simple, fast, and cost-effective models are required to study the mechanisms of cell engraftment, the ability of engrafted cells to proliferate, differentiate into specific types or subpopulations of cells, and form synapses with resident neurons.
Integrating histological studies into electrophysiological recording and transcriptome and proteome profiling is necessary for a full comprehension of the molecular cascade occurring after cell transplantation. This certainly will speed up the design and validation of new cell replacement therapies in preclinical models and clinical studies. Indeed, to date, the use of rodents, large animals, and non-human primates has been worthwhile for elucidating many cellular processes after transplantation14. However, due to the high cost, the high ethical impact, as well as the complexity of the organism, their use is often not straightforward or not adequate to unravel biochemical and molecular processes. In addition, they may present many disadvantages correlated with biological differences, both interspecies (metabolism) and intraspecies variability (sex, age).&#160;&#160;These factors, together with external factors such as stressful situations, could alter the outcome of an experiment and their predictability in terms of therapeutic translation to humans15,16,17.
Thus, many groups employ 2D in vitro cell culture and ex vivo organotypic slices (ex vivo cultures) in addition to animal models. 2D cell culture is the most commonly used system for studying specific biological processes at a single-cell and/or cell population level. Nevertheless, monolayer cell cultures do not reflect the complexity found in a whole organism. The lack of tissue structures and&#160;physiological environment does not allow the 2D culture systems to completely emulate key structural, morphological, and functional aspects of the investigated tissue18,19,20. Organotypic cultures can overcome some of these issues. Organotypic models are based on explanting a fragment of a tissue or organ and maintaining it ex vivo for a limited period21,22. In particular, slices of the explanted tissue are generated with a precise thickness that allows nutrients to easily reach almost all the cells in the slices. They&#160;can be generated from various regions of the central nervous system, such as the hippocampus, hypothalamus, cerebellum, thalamus, cerebral cortex, substantia nigra and striatum, and spinal cord23. Organotypic cultures retain the tissue architecture, the spatial distribution of cells, the cellular diversity, and the environment (i.e., extracellular matrix composition) of the organ of origin. Moreover, they preserve the original neural activity, connections between cells, and in particular, short-distance circuits after the explant.
These aspects provide some advantages for ex vivo cultures with respect to both monolayer cultures and animal models. They retain key tissue features found in vivo but with the reduction of the costs and the possibility to perform different types of molecular, cellular, and functional experiments with an accurate regulation of the culture environmental parameters24,25,26,27,28,29. Organotypic slices can also be exploited to develop models for different neurological disorders by resembling key histopathological features of specific conditions30. Moreover, the retention of the original multicellular tissue environment renders them appropriate platforms for drug screening and for testing neuroprotective and neuro-regenerative molecules and materials.
In this work, we propose the use of SC organotypic cultures as a model to optimize NSC transplants. This is not trivial since optimal culturing conditions are required to guarantee the survival of both the host (SC tissue) and the transplant (NSCs) for weeks. Different research groups engrafted in organotypic cultures, brain-derived and SC-derived, various types of cells. Most of the works showed the transplantation of mesenchymal stem cells31,32,33, olfactory ensheathing cells34, or NSCs35,36,37,38,39,40 and evaluated the interactions of engrafted cells with the host cells, the survival of the whole system, and whether the transplanted cells differentiated into neurons or neuron-like cells inside the ex vivo tissue environment32,33,41. Some of them evaluated the regenerative potential of cells after transplant, observing their axonal growth inside the tissue37,40,41, the myelinating ability of engrafted precursors of oligodendrocytes42, the migration of engrafted cells into the host tissue43, and whether the transplanted cells released factors pushing towards a proregenerative environment31. One limitation of the current studies is that they do not explore the engraftment for a long-term period.
Considering that NSCs seem to require several weeks to differentiate in vivo44,45, this study focuses on how to generate and maintain long-term (&#8805;30 days) mouse SC slices for up to 90 days. Slices were found to retain their original anatomical structure and to maintain a low and stable apoptotic rate over time and high cell viability. We observed diffuse expression of neuronal markers RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) and neurofilament light chain (NFL), with the latter showing an increasing trend of axonal sprouting around the slices over time, attesting to their healthy condition. Moreover, we successfully transplanted into the SC-slices GFP-expressing human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells at the first stages of neuronal differentiation. The NSC graft was maintained for 30 days after transplant and cells showed GFP expression for all the period in culture. The apoptotic rate of cells at day post-transplant (DPT) 30 was also found to be in line with respect to the apoptotic rate value observed at DPT 7 in the same cells40. Cells seemed to engraft into the tissue environment and survived up to several weeks.
In summary, our data demonstrate that it is possible to maintain in culture SC organotypic slices for 3 months without compromising their original cytoarchitecture and the tissue environment. Most importantly, they can be exploited to test cell therapies before proceeding with an in vivo experiment, thus reducing the costs and the experimental time. Here, we illustrate in detail all the passages to generate mouse SC organotypic slices and how to maintain them for long-term periods (&#8805;30 days). Moreover, we deeply explain how to perform NPC transplantation into the slices and how to maintain them for downstream analysis.

저자 스포트라이트: 척수 재생 요법의 발전을 위한 장기 척수 절편 문화

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for validating Cell transplantation in Spinal Cord (척수 손상에서 세포 이식을 검증하기 위한 플랫폼으로서의 장기 마우스 척수 유기형 절편 배양)

We are interested in developing a promising regenerative approach to address spinal cord injuries. In this paper, we validate spinal cord organotypic model for testing cellular replacement therapies in spinal cord research. So far, spinal cord organotypic models are maintained in culture for two or three weeks in vitro.And subculture media are suboptimal for neural stem cell engraftment, differentiation, and maturation. Cell replacement therapies still require the improvement to announce the ability of the grafted cells to reconstitute the lost circuits. Through this protocol, we provide a novel, long-term ex vivo platform to tackle cell transplant related issue like survival, integration, and maturation rate of the engrafted neural stem cells.This platform will be helpful for researchers to find the best strategy for cell transplantation, reducing the number of animals required for in vivo validation. Our protocol is simple, fast, and cost-effective to perform proof of concept and optimization studies.

설명된 방법은 P3 단계의 마우스에서 SC 유기형 절편을 확립하고 건강한 조건에서 장기간 동안 배양에서 유지할 수 있도록 합니다. 또한, 세포를 절편에 이식하고 최대 30일 동안 공동 배양하기 위한 프로토콜을 보여줍니다(그림 1). 먼저, 배양 조건의 최적화와 이식된 세포로 SC 절편의 장기 배양에 적합한 프로토콜을 보여줍니다(그림 2A). 슬라이스는 OM에서 DEV 0부터 DEV 2까지 생성되고 유지되며, 이는 원래 SC 슬라이스(47)의 유지 관리를 위한 최적의 매체로 제안되었습니다. 그러나, 혈청 단백질의 존재로 인해, 이 배지는 이식된 신경 전구 세포의 신경 세포 분화 및 성숙을 유지하기에 차선책이 될 수 있습니다. 실제로, DEV 3에서 우리는 신경 생존을 지원하는 Neurobasal과 B27을 함유하고 올바른 신경 세포 분화를 억제하는 혈청을 사용하지 않고 대신 신경교 운명을 촉진하는 제형인 OM에서 GM으로의 전환을 테스트했습니다48,49.
그림 2B는 스위치를 수신하지 않은 SC 절편과 비교하여 DEV 3에서 배지를 OM에서 GM으로 전환하여 얻은 결과를 보여줍니다(대조군 절편은 OM에서 배양됨). 우리는 슬라이스 내부의 NFL 신호 분포를 뉴런 무결성의 마커로 사용했습니다(그림 2B, C). DEV 7의 슬라이스는 두 배양 조건 모두에서 건강했으며, 이는 내부의 신경 필라멘트(NFL, 녹색)의 확산 분포를 보여주었습니다. DEV 10에서 GM에서 배양된 절편은 NFL 염색 분포에 의해 문서화된 바와 같이 OM에서 배양된 대조군 절편에 비해 더 건강한 것으로 나타났습니다. 또한 그림 2B의 대표 이미지에 표시된 슬라이스의 NFL+ 면적(% NFL+ Area/DAPI+ Area)을 추정했습니다. 추정된 NFL+ 면적은 그림 2C의 히스토그램으로 표시되며, 이는 NFL 신호가 두 조건 모두에서 DEV 7의 슬라이스에 확산 분포되어 있음을 확인합니다. 그러나 DEV 10에서 NFL 염색이 적용되는 추정 면적은 OM 배양 조건에 대해 감소합니다.
이러한 데이터는 DEV 3에서 GM으로 전환하는 것이 SC 슬라이스의 장기간 배양에 잘 견디는 것임을 시사합니다(DEV 10). 다음 단계로, DEV 30, DEV 60, DEV 90 등 더 긴 시간 동안 GM을 테스트했습니다. 그림 3A,B에서 볼 수 있듯이, 절편은 DEV 90까지 배양에서 건강하게 유지되었습니다. NFL 염색은 각 시점의 절편에서 널리 발견되었으며, 중앙 영역에서 출발하는 신경돌기 절편 주위에 확산성이 싹을 틔우고 있었습니다. 실제로, 그림 3A에 표시된 슬라이스의 NFL+ 면적을 추정했으며 그림 3B의 히스토그램에서 볼 수 있듯이 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 우리는 또한 신경 세포 마커 RBFOX3에 대한 양성을 관찰하여 절편의 신경 세포 분화에 대한 또 다른 증거를 제공했습니다. 각 시점에서 aCASP3에 양성인 세포의 수를 서로 다른 절편에서 평가하여 세포사멸 속도도 확인했습니다(그림 4A,B). 분석은 프로토콜 섹션 10.2에 설명된 대로 수행되었습니다. 세포사멸률(% aCASP3+ 세포/총 DAPI+ 세포 수)은 각 시점에서 매우 낮았으며(DEV 30, 60 및 90에 대해 각각 0.85 ± 0.52%, 0.71 ± 0.27%, 0.66 ± 0.45%), 고려된 세 가지 시점(p-값 > 0.05, 그림 4B) 간에 유의한 차이가 없었습니다. 이러한 데이터는 aCASP3와 관련된 세포사멸 속도가 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되며, 슬라이스에서 NFL의 광범위한 분포(그림 4A)와 함께 각 시점에서 슬라이스의 생존을 확인한다는 것을 시사합니다.
이전 데이터를 뒷받침하기 위해, 우리는 또한 세 가지 다른 시점에서 절편의 생존 가능성을 평가하기 위해 라이브/데드 분석을 수행했습니다. Calcein(녹색 염색)을 사용하여 생존 가능하고 대사적으로 활동적인 세포를 라벨링하고 Sytox(청록색 염색)를 사용하여 세포 사멸을 평가했습니다. 그림 4C의 히스토그램에서 볼 수 있듯이 대사 활성 세포의 비율은 DEV 30에서 DEV 90까지 약간 증가하고(DEV 30, 60 및 90± 각각 93.17 ± 5.21%, 96.43 ± 3.02%, 96.33 3.10%), 마지막 두 시점 사이에서 안정화됩니다(DEV 30 대 DEV 60 p-값 = 0.018; DEV 30 대 DEV 90 p-값 = 0.027; DEV 60 대 DEV 90 p-값 = 0.99). 시간이 지남에 따라 감소하는 낮은 수준의 세포 사멸을 발견했으며(DEV 30, 60 및 90의 경우 각각 6.83 ± 5.21%, 3.57 ± 3.02%, 3.66 ± 3.10%), DEV 30과 그 이후의 시점인 DEV 60 및 DEV 90 간에 유의한 차이가 발견되었습니다(DEV 30 대 DEV 60 p-값 = 0.018; DEV 30 대 DEV 90 p-값 = 0.027; DEV 60 대 DEV 90 p-값 = 0.99). 이러한 데이터는 세포사멸 비율과 관련하여 시간 경과에 따른 절편 생존을 확인하고 수행된 장기 배양 프로토콜의 효과를 뒷받침합니다.
SC 절편의 장기 배양이 가능하다는 것이 확인되자, 우리는 신경 세포 분화의 첫 단계에서 h-SC-NES 세포를 이식하여 시스템에 도전했습니다. h-SC-NES 세포는 SCI 치료에 대한 유망한 결과를 보였기 때문에테스트했습니다 12. h-SC-NES 세포를 마우스 SC 절편에 이식하는 절차는 프로토콜 섹션 6에 설명되어 있습니다. SC 절편 및 이식된 h-SC-NES 세포는 DPT 30까지 유지하였다. 세포는 그림 5A의 프로토콜 체계와 같이 분화(신경 전구체 단계)의 DIV 10에서 DEV 4 기관형 절편에 이식되었습니다. 이식된 세포는 최대 30일 동안 배양에서 GFP의 발현을 모니터링했습니다. 그림 5B 는 GFP+ 세포가 이식된 SC 절편에서 서로 다른 DPT에서 대표적인 라이브 이미지를 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 GFP의 안정적인 발현(그림 5B 및 그림 6A)은 세포가 이전에 최적화된 배양 조건에서 SC 조직으로 살아남았다는 것을 시사합니다. 또한 프로토콜 섹션 10.2에 설명된 대로 이식된 세포의 자가사멸 속도를 확인했습니다. 세포사멸률(% aCASP3+ 세포/총 Hu-Nu+ 세포 수)은 30 DPT 후 매우 낮은 것으로 나타났습니다(0.44 ± 0.34%). 더욱이, DPT 30에서의 자가사멸 속도는 이전에 보고된40과 같이 DPT 7에서 동일한 유형의 세포에서 발견되는 것과 일치하는 것으로 나타났으며, 이는 배양이 시간이 지남에 따라 안정화됨을 문서화합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 워크플로우. 수행된 프로토콜의 일반적인 워크플로우를 보여주는 대표 체계입니다. (A) 왼쪽은 P3에서 분리된 새끼 쥐의 SC에서 마우스 SC 슬라이스 생성과 SC 유기체형 슬라이스의 장기 배양을 요약한 계획입니다. (B) 오른쪽은 GFP를 발현하는 h-SC-NES 세포를 마우스 SC-유기형 절편에 이식하는 과정을 요약한 계획. 이식된 세포는 이식 후 30일 동안 유지됩니다. 약어: h-SC-NES = 인간 척수 유래 신경 상피 줄기; GFP = 녹색 형광 단백질; DEV = 생체 외 일; DPT = 이식 후 일; NFL = 신경 필라멘트 경쇄; RBFOX3 = RNA 결합 fox-1 상동 3; aCASP3 = 활성 카스파제-3; SC= 척수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> 그림 2: 장기 배양 조건의 최적화. (A) OM 및 GM을 테스트하기 위한 프로토콜의 대표 체계. OM은 대조군에 대해 DEV 7-10까지 유지됩니다. 매체는 처리된 슬라이스에 대해 DEV 3에서 GM으로 전환됩니다. 그런 다음 컨트롤과 비교하기 위해 DEV 7-10에서 고정됩니다. (B) DEV 7 및 10에서 서로 다른 조건에서 배양된 마우스 SC 유기형 절편을 비교한 대표 이미지. 세포골격 마커 신경 필라멘트(NFL, 녹색)에 대해 절편이 염색됩니다. GM으로 배양된 절편에서 NFL 염색이 광범위하게 분포되어 있다는 것은 전반적인 생존과 차별화를 시사합니다. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (C) 그림 1B에 표시된 슬라이스에서 NFL이 커버하는 면적 추정치의 대표 히스토그램. DEV 10에서 NFL 표면적은 OM 배양 조건에서 감소합니다. 약어: DEV = day ex vivo; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; NFL = 신경 필라멘트 경쇄.; OM = 유기형 배지; GM = 접목 매체; SC = 척수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> 그림 3: 장기 배양된 마우스 SC 유기형 절편 . (A) 절편은 DEV 90까지 배양액으로 유지됩니다. 면역형광 분석은 세포골격 마커 신경 필라멘트(NFL, 녹색)와 핵 신경 마커 RBFOX3(빨간색)의 광범위한 분포를 보여주며, 이는 장기 배양 후 건강한 상태와 신경 세포 정체성을 입증합니다. 주목할 점은 NFL+ 축삭돌기가 시간이 지남에 따라 슬라이스 주변에서 확산적으로 싹을 틔운다는 것입니다. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) 패널 A에 표시된 슬라이스의 NFL+ 면적 및 시간 및 RBFOX3+ 면적 추정치의 대표 히스토그램 . NFL+ 신경돌기 면적은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 약어: DEV = day ex vivo; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; NFL = 신경 필라멘트 경쇄; SC = 척수; RBFOX3= RNA 결합 fox-1 상동체 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> 그림 4: 시간 경과에 따른 SC 절편의 세포 생존율 평가. (A) aCASP3(빨간색) 및 NFL(녹색)에 대해 염색된 DEV 60의 유기형 절편의 대표 이미지. 스케일 바 = 100 μm. NFL은 확산 패턴을 보여줍니다. 희귀 세포는 apoptotic marker aCASP3에 대해 양성입니다(삽입: 1-2-3). (B) 서로 다른 시점에서 조각으로 세포 사멸 속도 분석. 평균 ± SD, N(반복실험) = 6개 슬라이스, 각 슬라이스에 대해 n(총 셀 수) > 1,000, Kruskal-Wallis 검정, 다중 비교, p-값 > 0.05. 세포사멸 속도는 시간이 지남에 따라 안정적입니다. 패널 A의 삽입물 1-2-3에서 aCASP3에 양성인 세포의 세부 정보(빨간색 염색, 흰색 화살표)를 관찰할 수 있습니다. 작은 빨간 점은 세포 파편과 pyknotic nuclei를 표시합니다. 스케일 바 = 50 μm. (C) DEV 90에서 SC 절편에서 수행된 라이브/데드 분석의 대표 이미지: 대사 활성 세포는 Calcein으로 녹색으로 라벨링되고, 죽은 세포와 손상된 세포는 Sytox로 연한 파란색(청록색)으로 라벨링됩니다. 두 히스토그램은 총 세포 수에서 Calcein(왼쪽) 및 Sytox(오른쪽)에 대해 양성인 세포의 %를 보여줍니다. 평균 ± SD, N(반복실험) = 6개 슬라이스, n(총 셀) > 각 슬라이스에 대해 1,000, Kruskal-Wallis 검정, 다중 비교, DEV 30 대 DEV 60 p-값 = 0.018; DEV 30 대 DEV 90 p-값 = 0.027; DEV 60 대 DEV 90 p-값 > 0.99. 약어: DEV = day ex vivo; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; NFL = 신경 필라멘트 경쇄; SC = 척수; aCASP3 = 활성 카스파제-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> 그림 5: h-SC-NES 세포를 마우스 유기형 절편에 이식. (A) 이식 프로토콜의 대표 계획. 세포는 분화의 DIV 10에서 신경 전구체로서 DEV 4 유기형 절편으로 이식됩니다. (B) DPT 30까지 시간이 지남에 따라 GFP 발현 h-SC-NES 세포로 이식된 마우스 유기형 절편의 대표 이미지. 세포는 GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 transduction됩니다. 시간 경과에 따른 GFP 발현은 슬라이스 환경에 대한 생존 가능성과 적응을 확인합니다. 스케일 바 = 500 μm. 약어: DIV = 사전 분화의 첫날; h-SC-NES = 인간 척수 유래 신경 상피 줄기; GFP = 녹색 형광 단백질; DEV = 생체 외 일; OM = 유기형 배지; GM = 접목 매체; DPT = 이식 후 일수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> 그림 6: 이식 후 30일 후 이식된 h-SC-NES 세포의 세포사멸 속도 평가. (A) GFP 발현 h-SC-NES 세포가 이식된 마우스 기관형 절편의 대표 이미지. 세포는 이식 후 절편으로 세포를 모니터링하기 위해 GFP 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 transduction됩니다. 시간 경과에 따른 GFP 발현은 슬라이스 환경에 대한 생존 가능성과 적응을 확인합니다. 표시된 시점은 DPT 30입니다. 세포는 인간 핵(청록색) 및 aCASP3(빨간색)에 대해 염색됩니다. 스케일 바 = 150 μm. (B) 왼쪽은 DPT 30 (N(반복) = 5 슬라이스, n(셀) = 5,000)에서 슬라이스로 이식된 세포의 세포 사멸 분석의 대표적인 파이 차트, 오른쪽은 Hu-Nu+ 셀의 삽입과 aCASP3에 양성인 셀의 세부 정보(흰색 화살표). 눈금 막대 = 75 μm. 작은 빨간 점은 세포 파편과 pyknotic nuclei를 표시합니다. 약어: h-SC-NES = 인간 척수 유래 신경 상피 줄기; GFP = 녹색 형광 단백질; DPT = 이식 후 일; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; NFL = 신경 필라멘트 경쇄; aCASP3 = 활성 카스파제-3; Hu-Nu = 인간의 핵. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Long-Term Spinal Cord Slice Culture for Advancing Spinal Cord Regeneration Therapies at JoVE.com

이 논문에서는 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 생체 외 모델로 신경 줄기 세포로 이식된 장기 척수 기관형 절편을 생성하고 유지하기 위한 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

우리는 척수 손상을 해결하기 위한 유망한 재생 접근법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 이 논문에서는 척수 연구에서 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 척수 기관형 모델을 검증합니다. 지금까지 척수 기관형 모델은 시험관에서 2주 또는 3주 동안 배양된 상태로 유지됩니다.그리고 하위 배양 배지는 신경 줄기 세포 생착, 분화 및 성숙에 적합하지 않습니다. 세포 교체 요법은 이식된 세포가 손실된 회로를 재구성할 수 있는 능력을 발표하기 위해 여전히 개선이 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 생착된 신경 줄기 세포의 생존, 통합 및 성숙률과 같은 세포 이식 관련 문제를 해결하기 위한 새롭고 장기적인 생체 외 플랫폼을 제공합니다.이 플랫폼은 연구자들이 세포 이식을 위한 최상의 전략을 찾는 데 도움이 될 것이며, 생체 내 검증에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있을 것입니다. 당사의 프로토콜은 개념 증명 및 최적화 연구를 수행하기 위해 간단하고 빠르며 비용 효율적입니다.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

699 조회수.  University of Pisa. 우리는 척수 손상을 해결하기 위한 유망한 재생 접근법을 개발하는 데 관심이 있습니다. 이 논문에서는 척수 연구에서 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 척수 기관형 모델을 검증합니다. 지금까지 척수 기관형 모델은 시험관에서 2주 또는 3주 동안 배양된 상태로 유지됩니다.그리고 하위 배양 배지는 신경 줄기 세포 생착, 분화 및 성숙에 적합하지 않습니다. 세포 교체 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 척수 재생 요법의 발전을 위한 장기 척수 절편 문화

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.