RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

혈소판은 혈관 손상 후 출혈을 예방하고, 감염과 싸우고, 염증이 발생하는 동안 혈관 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 지혈 플러그는 혈소판의 집단적 활성화와 응집을 필요로 하지만, 염증이 있는 혈관을 보호하는 역할은 단세포 수준에서 수행됩니다. 이러한 맥락에서 최근 연구에 따르면 혈소판은 자율적으로 이동할 수 있으며, 이는 접착 미세환경의 메카노센싱에 의존하는 과정입니다.

이 접근법을 사용하면 기질 접착 특성을 정밀하게 제어할 수 있으며 혈소판 이동의 기저에 있는 메커니즘을 연구하기 위한 간단한 체외 분석 역할을 합니다. 결과는 인테그린 리간드에 결합하는 이동하는 혈소판이 아비딘-비오틴 결합을 파괴할 수 있는 힘을 발휘할 수 있음을 나타냅니다. 이 분석은 혈소판 이동을 시각화하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

라이브 셀 이미징과 결합하면 이 중요한 혈소판 기능에서 다양한 세포골격 구성 요소의 상호 작용과 조절을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 우선, 초음파 처리 유리 커버는 1 분 동안 20 % 질산을 넣은 다음 이소프로판올, 에탄올 및 물을 각각 1 분 동안 초음파 처리합니다. 사전 세척된 커버 슬립을 플라즈마 클리너에 산소 플라즈마로 2분 동안 처리한 다음 끈적한 슬라이드로 조립합니다.

이제 97.5 마이크로 리터의 PLL-PEG에 희석 된 2.5 마이크로 리터의 PLL-PEG- 비오틴으로 채널을 채우고 실온에서 30 분 동안 배양 한 다음 PBS로 3 번 세척합니다. 다음으로 뉴트라비딘-FITC 100마이크로리터를 넣고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 3회 세척합니다. 마지막으로 100마이크로리터의 cyclo-RGD 비오틴을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 PBS로 3회 세척합니다.

마우스를 마취하고 흉부 피부를 제거한 후 흉골 왼쪽의 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입하여 심장에서 혈액을 뽑습니다. 혈액을 Tyrode의 완충액 1ml와 원심분리기 70g에 섞어 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 20분간 가열한 다음, 혈소판이 풍부한 혈장이 들어 있는 상부를 채취합니다. 3ml의 Tyrode 완충액과 혼합하고 프로스타시클린 1밀리리터당 100나노그램을 첨가하여 혈소판 활성화를 방지합니다.

그 후, 1200g에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 500마이크로리터의 Tyrode 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 혈소판 수를 측정합니다.

먼저 비오틴-뉴트라비딘-비오틴 cRGD 코팅 채널에서 마우스 혈소판을 채취하고 스테이지 인큐베이터가 장착된 도립 현미경을 사용하여 실시간 혈소판 이동을 기록합니다. 혈소판 유착 또는 이동 수를 계산하려면 도구 모음에서 포인트 도구의 드롭다운 메뉴를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다중 포인트 도구를 선택합니다. neutravidin-FITC 코팅에 각인된 이동 경로의 길이를 측정하여 고정된 샘플에서 이동 거리를 추출합니다.

도구 모음에서 직선 도구의 드롭다운 메뉴를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 자유 핸드라인 도구를 선택합니다. 혈소판의 모양을 정량화하려면 도구 모음에서 Image, Adjust 및 Threshold를 선택하여 형광 혈소판을 분할하여 이진 마스크를 생성합니다. Analyze and Set Measurements(분석 및 측정 설정)에서 형상 설명자를 선택한 다음 Display Results using Analyze Particles(입자 분석 및 분석)를 사용하여 결과 표시를 선택합니다.

혈소판은 2.5%PLL-PEG-비오틴 농도에서 최적의 이동을 보였습니다. 이동은 더 낮은 리간드 밀도와 더 높은 리간드 밀도 모두에서 감소되었습니다. 혈소판은 1%의 리간드 밀도에서 부적절하게 퍼져 있으며, 이는 낮은 면적과 둘레로 표시되며, 이는 불충분한 인테그린 활성화를 시사합니다.

2.5%의 리간드 밀도에서 혈소판은 효과적으로 퍼져 cRGD 리간드를 파괴하고 이동합니다. 높은 리간드 밀도는 혈소판이 분극 없이 확산되도록 하여 cRGD 리간드를 파괴하지 못하여 이동을 줄였습니다.