극저온 시료 전처리는 특히 불균일한 입자 분포와 같은 효과를 제한할 수 있는 문제에 직면해 있습니다. 이 문제는 종종 새로 구성된 단백질 구조에서 분리능이 떨어지고 정확도가 감소하는 원인이 됩니다. 불균일한 입자 분포를 극복하기 위해 샘플에 세제 또는 멤브레인 모방체를 추가하고, 그리드 지지 필름을 수정하고, 데이터 수집 중 특정 단계를 기울이는 등 다양한 실험 접근 방식이 사용됩니다.
이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하는 간단하고 실용적인 방법을 분석하며, 연구자가 극저온을 사용하여 거대분자 구조를 효율적으로 설명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다. 먼저 MJ small heat shock protein 16.5를 포함하는 풀링된 단백질 분획을 수집합니다. 분자량 컷오프가 50킬로달톤인 원심 필터를 사용하여 섭씨 4도에서 분획을 약 65mg으로 농축합니다.
농도 후에, 16, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 표본을 응집체를 제거하기 위하여 원심 분리하십시오. 50 마이크로 리터 부피의 상등액을 0.2 밀리리터 얇은 벽 PCR 튜브에 분취합니다. 투과 전자 현미경의 경우 얼음 위에서 두 개의 냉동 단백질 튜브를 해동합니다.
해동되면 튜브를 여러 번 튕겨 섞습니다. 다음 16, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 단백질 해결책을 응집체를 제거하기 위하여 원심 분리하십시오. 다음으로, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 상등액을 주입하고 0.5ml 용리 분획을 수집합니다.
피크에 해당하는 elucian fractions를 수집하여 280나노미터에서 가장 높은 자외선 흡광도를 나타냅니다. 완충액 교환을 위해 가위로 투석막을 30 x 30mm 조각으로 자릅니다. 조각을 증류수 또는 완충 용액에 배양하여 평형을 이룹니다.
다음으로, 55마이크로리터의 단백질 용액을 50마이크로리터의 미세투석 버튼이 있는 챔버에 추가합니다. 집게를 사용하여 투석막을 수직으로 잡고 투석막의 한쪽 가장자리를 티슈 페이퍼에 부드럽게 닿아 여분의 액체를 배출합니다. 미세 투석 버튼을 멤브레인으로 조심스럽게 덮습니다.
투석막 위에 O-링을 놓고 버튼 가장자리의 홈으로 부드럽게 굴립니다. 각 투석 버튼을 멤브레인 면이 위쪽을 향하도록 하여 대상 버퍼가 들어 있는 별도의 비커에 담그십시오. 가는 바늘이 달린 주사기를 사용하여 멤브레인을 조심스럽게 펀칭하고 미세 투석 챔버에서 단백질 용액을 회수합니다.
밀리리터당 20-120나노그램의 농도로 5마이크로리터의 샘플을 글로우 방전 그리드에 로드합니다. 파라핀 필름 시트에 각각 50마이크로리터의 물방울 3개를 준비합니다. 격자 표면을 물방울에 문질러 샘플을 씻습니다.
이제 여과된 1%소변기 아세테이트 용액 5마이크로리터를 그리드에 로드하고 즉시 소변기 아세테이트 용액을 피펫으로 제거합니다. 또 다른 5마이크로리터의 소변기 아세테이트 용액을 그리드에 로드합니다. 그리드의 핀셋 쪽을 여과지로 부드럽게 만져 과도한 염색 용액을 제거하고 그리드를 건조시킵니다.
핀셋과 글로우 방전 그리드 어셈블리를 기기에 장착합니다. 그런 다음 4마이크로리터의 샘플을 그리드의 탄소 쪽에 로드합니다. 플런지 동결 프로세스를 시작합니다.
투과 전자 현미경(TEM)에 로드할 그리드를 준비하려면 먼저 자동 그리드 조립 스테이션에 유리화 그리드가 포함된 그리드 상자를 놓고 유리화 그리드가 포함된 그리드 상자의 뚜껑을 풉니다. 자동 그리드 링을 어셈블리 스테이션의 지정된 컷아웃 공간에 배치합니다. 격자 상자에서 유리화된 격자를 조심스럽게 이동하여 자동 격자 링 안에 맞춥니다.
이제 디스크를 정렬하여 원형 개구부를 자동 그리드 링과 그리드 어셈블리 위에 배치합니다. 그리드를 자동 그리드 링에 고정하려면 C 클립 삽입 도구를 그리드 위에 놓고 부드럽게 눌러 C 클립을 내부에 고정합니다. 디스크를 다시 회전시키고 조립된 그리드를 자동 그리드 보관 상자로 이동합니다.
카세트 로딩 스테이션을 조립하고 액체 질소로 냉각합니다. 자동 그리드 보관 상자를 적재 스테이션에 놓습니다. 그리드 어셈블리를 자동 그리드 보관 상자에서 카세트로 이동합니다.
핸들을 사용하여 카세트를 자동 로더 캡슐에 넣습니다. 자동 로더의 핀을 확인하여 자유롭게 움직이는지 확인하고 얼지 않았는지 확인하십시오. 어레이의 입자 축적은 버퍼 조건 또는 표면 전하 수정에 관계없이 테스트된 모든 그리드에서 관찰되었습니다.
9 밀리몰의 mobstress, 50 밀리몰의 염화나트륨 및 0.1 밀리몰의 EDTA 버퍼에서 음전하를 띤 그리드와 결합된 더 높은 단백질 농도는 그리드 구멍 내에서 단일 입자의 원하는 분포를 초래하여 단백질 어레이 형성을 감소시켰습니다. 이 최적화된 조건으로 인해 0.80의 높은 원뿔형 FSC 면적 비율 값과 0.859의 SCF 값이 나타나 균일한 입자 분포를 확인했습니다.
