우리의 노력은 현재 새로운 후성유전학적 치료 표적을 식별하는 궁극적인 목표와 함께 후성유전학적 변화와 대사 재배선 사이의 기존 상관관계를 더 잘 특성화하는 데 중점을 두고 있습니다. 후성유전학적 변형의 역동성과 가역적 특성을 감안할 때 최근 여러 에피약물 제제가 개발되어 암 치료의 개선과 화학 내성의 감소로 이어지고 있습니다. 최근에는 최신 질량 분석기의 적용 덕분에 인스턴스 특성화 분야에서 상당한 진전이 이루어졌으며, 이는 톱 페이지 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분리 기술과 결합되어 있습니다.
히스톤 특성화의 주요 과제는 동적 변형 효소와 대사 산물의 가용성 사이의 누화로 인해 발생하는 셀 수 없는 히스톤 단백질형의 존재입니다. 미니 수직 폴리아크릴아미드 겔, 전기영동 시스템을 위한 미니 TAU 겔을 준비하는 것으로 시작합니다. 이렇게하려면 15 % 아크릴 아미드 비스 아크릴 아미드 용액에 6 몰 요소와 초순수 1 밀리리터를 실온에서 부드럽게 교반하여 용해시킵니다.
그런 다음 다른 구성 요소를 추가하고 볼륨을 조정합니다. 사전 설정된 젤 플레이트를 이 용액으로 채우고 기포가 형성되지 않도록 하고 상단에서 1.5cm 떨어진 곳에 둡니다. 젤의 수평을 맞추기 위해 위에 1ml의 이소프로판올을 추가합니다.
스태킹 겔 용해를 준비하려면 요소를 6% 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드에 초순수 1밀리리터와 함께 용해합니다. 다른 구성 요소를 추가한 후 이 용액으로 젤 플레이트를 채우고 용액이 빗의 치아 중간에 도달할 때까지 플레이트 사이에 10웰 빗을 삽입합니다. 다음으로 6개의 몰 요소, 5% 빙초산 및 이중 증류수를 용해시켜 100마이크로리터의 TAU 샘플 버퍼를 준비합니다.
그런 다음 동결건조된 히스톤 샘플을 30마이크로리터의 TAU 샘플 버퍼에 용해시킵니다. 미니 카세트에 최종 농도 5%아세트산의 TAU 러닝 버퍼를 채웁니다. 주사기를 사용하여 러닝 버퍼로 겔의 웰을 헹구고 마이크로 피펫으로 샘플을 웰에 로드합니다.
그런 다음 전기 영동 챔버를 전원 공급 장치에 연결하고 양극을 바닥에 놓습니다. 때때로 전원 공급 장치를 끄고 주사기로 젤 웰을 헹구어 젤 바닥 표면의 기포를 제거합니다. 젤 플레이트에서 젤을 제거한 후 깨끗한 메스를 사용하여 관심 레인을 자릅니다.
이제 15 분 동안 0.5 M 트리스 염산염, pH 8.8의 젤 레인을 세척합니다. 여기에 표시된 성분을 사용하여 15ml의 평형 버퍼 1과 2를 준비합니다. 그런 다음 평형 버퍼 2를 어두운 곳에 보관하십시오.
이제 겔 레인을 10ml의 평형 완충액으로 배양하고 15분 동안 부드럽게 교반한 다음 디캔팅합니다. 그 후, 겔 레인을 10 밀리리터의 평형 완충액 2에 배양하기 전에 어둠 속에서 15 분 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다. 다음으로, 여기에 표시된 조성물을 사용하여 15% 아크릴아미드 분해 겔을 준비합니다.
겔 플레이트를 설정하고 긴 겔 플레이트 끝에서 1.5cm를 남겨두고 분해 겔 용액으로 채웁니다. 그 위에 이소프로판올 1ml를 추가하여 젤의 수평을 맞추고 중합되도록 합니다. 겔이 중합되면 이소프로판올을 디캔팅하고 3mm 셀룰로오스 크로마토그래피 종이를 사용하여 잘 건조시킵니다.
기포를 방지하기 위해 핀셋을 사용하여 절단 젤 레인을 분해 젤 웰에 삽입한 다음 트리스 글리신 및 SDS 완충액에 0.5% 낮은 융점 아가로스를 사용하여 0.003% 브로모페놀 블루의 5마이크로리터로 젤 레인을 분해 젤에 밀봉합니다. 겔 플레이트를 카세트에 넣고 트리스 글리신과 SDS 버퍼로 채웁니다. 브로모페놀 블루 염료가 바닥에 도달할 때까지 120볼트에서 젤을 실행합니다.
실행 후에는 플레이트에서 젤을 부드럽게 제거하고 여분의 아가로스를 버립니다. 시작하려면 히스톤 샘플에 대해 미니 2D 겔 트리톤산 요소 또는 TAU 전기영동을 수행한 다음 은 염색을 수행합니다. 그런 다음 여기에 표시된 시약을 준비합니다.
깨끗한 메스를 사용하여 염색된 젤에서 관심 히스톤 반점을 제거하고 각 반점을 1.5밀리리터의 새로운 실리콘 튜브에 넣어 동형 교차 오염을 방지합니다. 각 겔 스폿에 250마이크로리터의 50밀리몰라 중탄산암모늄 또는 50%아세톤 니트로를 추가하고 실온의 열 혼합기에서 부드럽게 교반하여 배양합니다. 용액을 디캔팅하고 젤 조각이 투명하게 나타날 때까지 이 과정을 세 번 반복합니다.
젤 반점을 탈수시키려면 200마이크로리터의 아세톤 니트로를 첨가하십시오. 이 단계에서 젤 조각은 불투명한 흰색으로 변합니다. 아세톤 니트릴을 디캔팅하고 젤 반점을 10분 동안 자연 건조시킵니다.
젤 조각은 튜브에서 건조한 것처럼 보입니다. 다음으로, 20마이크로리터의 트립신 용액 또는 젤 조각을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피를 추가하여 젤 반점을 재수화합니다. 섭씨 37도의 온도 혼합기에서 최소 4시간에서 최대 16시간 동안 부드럽게 교반하여 튜브를 배양합니다.
삼부작 펩타이드를 함유한 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 젤 조각에 50마이크로리터의 추출 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 초음파 수조에서 두 번 초음파 처리합니다. 추가 삼부작 펩티드를 포함하는 상등액을 동일한 새 튜브로 옮깁니다.
동결 건조기를 사용하여 풀링된 추출된 펩타이드를 섭씨 30도에서 건조시킵니다. 동결건조된 펠릿이 튜브에 형성됩니다. 이제 각 튜브에 15마이크로리터의 0.1%트리플루오로아세트산을 추가하고 섭씨 25도의 온도 믹서에서 부드럽게 배양합니다.
액체 크로마토그래피 탠덤, 질량 분석 분석을 위해 상등액을 바이알로 옮깁니다.
