이 방법은 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 일차 인간 색소 상피 세포의 전기 천공 기반 형질 감염을 입증하며, 이는 전이 유전자 발현 및 단백질 분비에 대한 증거입니다. 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템과 전기천공의 조합은 일차 인간 색소 상피 세포의 효율적인 형질감염뿐만 아니라 안정적이고 지속적인 전이유전자 발현 및 단백질 분비를 가능하게 합니다. 전반적인 목표는 치료 활성 단백질의 안정적이고 지속적인 분비를 필요로 하는 망막 퇴행성 질환의 치료를 위한 세포 기반 유전자 부가 요법을 확립하는 것입니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실의 의료 기술 보조원 인 Anne Freialdenhoven과 Antje Schiefer입니다. 1차 인간 RPE 세포 전기천공을 위한 플라스미드 DNA를 준비하려면 마이크로볼륨 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 함량을 정량화하고 10밀리몰 Tris-HCL에서 마이크로리터당 250나노그램으로 농도를 조정합니다. SB100X 트랜스포자제 플라스미드 DNA의 마이크로리터당 250나노그램 부피 16개와 색소 상피 유래 인자 트랜스포존 플라스미드 DNA 마이크로리터당 250나노그램 16부피를 혼합합니다.
생성 된 혈장 혼합물 2 마이크로 리터를 얼음 위의 멸균 1.5 밀리리터 안전 잠금 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 버퍼 튜브에 3 밀리리터의 버퍼 E를 채 웁니다. 그런 다음 딸깍 소리가 들릴 때까지 튜브를 피펫 스테이션에 삽입하고 형질 주입 장치를 1, 100 볼트, 20 밀리 초 펄스 폭 및 2 펄스로 설정하십시오. 전기 천공을 위해 세포를 준비합니다. 먼저, 위상차 현미경을 통해 1차 RPE 세포 배양의 형태를 확인하여 성장과 컨플루언스를 평가합니다.
세포를 세포 배양 인큐베이터에서 7 내지 15분 동안 웰당 500 마이크로리터의 0.05% 트립신 EDTA로 처리한다. 세포가 분리되면 원심분리에 의해 세포를 모으고, 세포를 PBS 1 밀리리터에 재현탁시키고 형질주입 당 4개의 세포 분취량을 1 내지 10회 원심분리하여 반응시킨다. 펠릿을 튜브당 11마이크로리터의 완충액 R에 재현탁시키고 준비된 플라스미드 혼합물 2마이크로리터를 각 튜브에 첨가합니다.
클램프가 피스톤의 장착 스템을 완전히 집어 올릴 때까지 형질주입 피펫의 헤드를 10 마이크로리터 형질주입 팁에 삽입하고 세포와 플라스미드 용액을 형질주입 팁에 로드합니다. 딸깍 소리가 날 때까지 피펫 스테이션 내에 배치된 버퍼 튜브에 형질주입 피펫을 삽입하고 시작을 눌러 전기천공 과정을 시작합니다. 형질주입 후 피펫 스테이션으로부터 형질주입 피펫을 조심스럽게 제거하고, 즉시 세포 및 플라스미드 용액을 세포 배양 플레이트의 준비된 웰 내로 피펫팅한다.
RPE 세포 배양 상청액으로부터 그의 태그된 색소 상피 유래 인자 융합 단백질을 정제하였다. 먼저 베벨 컷 팁을 사용하여 샘플 당 30 마이크로 리터의 니켈 NTA 슬러리 분취액을 수집하고 원심 분리로 니켈 NTA 수지를 펠릿합니다. 니켈 NTA 수지를 200 마이크로리터의 One X 인큐베이션 완충액으로 조심스럽게 재현탁하고 추가 원심분리로 용액을 2회 펠릿화합니다.
두 번째 원심분리 후, 니켈 NTA 수지 펠릿을 샘플당 40마이크로리터의 Four X 인큐베이션 완충액으로 조심스럽게 재현탁시킨다. 다음으로 55 마이크로리터의 전처리된 니켈 NTA 슬러리를 260 마이크로리터의 Four X 인큐베이션 완충액 및 900 마이크로리터의 각 형질감염된 RPE 세포 배양 상청액과 혼합한다. 혼합물을 실온에서 60분 동안 진탕기 진탕기에서 인큐베이션하고, 니켈 NTA 수지 혼합물을 다시 펠렛화한다.
175 마이크로 리터의 One X 배양 완충액에 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고 혼합물을 두 번 더 원심 분리합니다. 2차 원심분리 후 니켈 NTA 수지 펠렛을 30 마이크로리터의 용출 완충액에 조심스럽게 재현탁시킨 후 샘플을 다시 원심분리하면서 실온에서 20분간 배양하였다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 수집하고 정제된 단백질의 웨스턴 혈액 분석을 위해 Two X SDS 샘플 버퍼와 혼합합니다.
인간 공여자의 눈으로부터 분리된 배양된 1차 RPE 세포는 기증자의 연령, 분리 후 시간 또는 배양 시간에 관계없이 전형적인 조약돌 형태를 나타낸다. 일차 인간 RPE 세포에 단기 전기 펄스 적용. 모세관 형질주입 시스템을 사용하는 것은 상피 형태에 악영향을 미치지 않는다.
형질감염된 1차 인간 RPE 세포 배양 상청액의 웨스턴 혈액 분석은 500일 이상 동안 전이유전자 침묵 없이 일관된 수준에서 색소 상피 유래 인자 분비를 입증합니다. 연속적으로 수행된 형질주입으로부터의 세포 배양 배지의 대표적인 웨스턴 혈액 분석에서 관찰된 바와 같이, 형질감염 후 21일째에 보편적으로 더 높은 색소 상피 유래 인자 분비 속도가 관찰된다. 추구 된 배양에서 장기간 상승 된 PEDF 분비는 최소 165 일 동안 지속됩니다.
또한 ELISA 기반 정량화는 각각의 비형질감염된 대조군 세포에 비해 형질감염된 1차 인간 RPE 세포에서 총 색소 상피 유래 인자 분비의 20배 증가를 보여줍니다. 이러한 증가는 또한 전체 PEDF 발현이 30배 이상 상승시킨 유전자 발현 수준에서도 확인되었다. 이 프로토콜을 시도 할 때 형태가 In Vivo 상태에 해당하는 색소 상피 세포를 사용하는 것이 중요합니다.
또한 기포 없이 형질주입 팁에 세포 용액을 끌어올리는 것을 잊지 마십시오. 안정적으로 형질감염된 세포는 이러한 세포 기반 유전자 추가 요법의 기능을 검증하기 위해 다양한 Ex Vivo 또는 in vivo 모델에서 사용될 수 있습니다.
