치과 플랫 생물막은 구강 상피에서 염증을 유발할 수 있는 수백 가지 미생물로 구성되어 있어 치은염과 같은 질병을 유발할 수 있습니다. 우리는 유기형 조직 모델을 사용하여 이러한 상호 작용을 더 잘 이해하고자 합니다. 이러한 시스템은 통제된 방식으로 대체 치료 방식을 평가하는 데 유용한 플랫폼을 제공합니다.
따라서 최근 몇 년 동안 염기서열분석 기술의 발전은 감염 생물학 분야를 변화시키고 있습니다. 이러한 기술을 통해 단백질체, 전사체 및 대사체 수준에서 숙주 및 미생물 시그니처 평가를 통해 여러 OMIC 기술을 사용하여 숙주 병원체 상호 작용을 진정으로 조사할 수 있습니다. 우리의 최근 연구는 생물막 관련 감염에서 왕국 간 및 다미생물 상호 작용의 중요성을 강조했습니다.
체외 모델 시스템을 사용하여 RAM 및 분광학과 같은 혁신적인 기술을 사용하여 숙주 생물막 상호 작용을 조사하고, 새로운 항생물막 치료제를 테스트하고, 미생물 군집을 프로파일링할 수 있었습니다. 이러한 조직형 조직 모델을 사용하는 향후 연구는 미생물과 숙주 조직 및 배양에 대한 다중 OMIC 시그니처 및 프로파일링을 함께 달성하는 것을 목표로 합니다. 우리는 생물막 모델에서 숙주와 특정 박테리아 및 곰팡이 종 사이의 복잡한 상호 작용을 밝히고 풀기를 희망합니다.
먼저 섭씨 80도에서 연쇄상구균 종을 포함하는 다공성 구슬의 얼어붙은 줄기를 제거합니다. 5%의 멸균 제세된 말 혈액을 포함하는 Columbia 혈액 오거 베이스 플레이트에서 연쇄상구균 종을 되살립니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.
다음 날, 플레이트에서 3-4개의 콜로니를 10ml의 트립톤 콩 육수 배지로 옮깁니다. 육수를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 16-18시간 동안 배양합니다. 외피 후에, 3, 20 섭씨 온도에 5 분 동안 000 G에 세포 현탁액을 원심 분리하십시오.
세포 펠릿을 10ml의 멸균 PBS로 세척합니다. 펠릿을 10ml의 PBS에 다시 현탁시키고 550나노미터로 설정된 분광 광도계를 사용하여 각 연쇄상 구균 종 현탁액을 개별적으로 표준화합니다. 표준화에 따라 각 연쇄상구균 현탁액을 1에서 10까지 희석하여 Todd Hewitt 육수와 Roswell Park Memorial Institute 배지의 일대일 혼합에서 밀리리터당 7개 세포의 1 곱하기 10의 농도에 도달합니다.
500마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 13mm 하이드록시아파타이트 디스크를 포함하는 24웰 마이크로타이터 플레이트에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양물을 배양하고 5%이산화탄소를 배양하여 생물막을 형성합니다. 유사한 방식으로, 5%의 멸균 제세된 말 혈액을 포함하는 까다로운 혐기성 오거 베이스에서 혐기성 미생물을 배양합니다.
각 혐기성 미생물을 특정 흡수도로 표준화하고 Todd Hewitt 육수와 Roswell Park Memorial Institute 배지의 일대일 혼합물로 희석합니다. 연쇄상구균 생물막 성숙 후, 웰에서 부착되지 않은 세포와 사용한 배지를 조심스럽게 제거합니다. 500마이크로리터의 표준화된 1 곱하기 10을 4개의 혐기성 미생물의 현탁액 밀리리터당 7개의 세포의 거듭제곱을 각 웰에 추가합니다.
섭씨 37도의 혐기성 조건에서 24시간 동안 생물막을 배양합니다. 다음 날, 웰에서 부착되지 않은 세포와 사용한 배지를 제거합니다. 500마이크로리터의 멸균 일대일 혼합물에 Todd Hewitt 육수와 Roswell Park Memorial Institute 배지를 추가합니다.
24시간 동안 혐기성 조건에서 생물막을 배양합니다. 7일째에는 공동 배양을 위해 500마이크로리터의 멸균 PBS로 생물막을 두 번 세척합니다. 먼저 포장을 풀고 인체 구강 상피 또는 HOE 조직 및 미디어를 클래스 2 안전 캐비닛으로 옮깁니다.
조직과 함께 제공된 유지 관리 매체 1ml를 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 영양 오거와 24웰 배송 플레이트에서 HOE 조직이 포함된 폴리카보네이트 삽입물을 제거합니다. 조직을 준비된 12웰 플레이트로 옮깁니다.
조직 모델을 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하고 이산화탄소를 5%씩 배양하여 실험실 조건에 순응시킵니다. 한편, 하이드록시아파타이트 디스크에서 생물막을 제거하려면 19게이지 바늘과 핀셋을 사용하여 24웰 플레이트의 바닥에서 디스크를 들어 올립니다. 디스크를 1ml의 멸균 DPBS가 들어 있는 옥수로 옮깁니다.
초음파 처리 수조에서 35 킬로헤르츠에서 10 분 동안 디스크를 초음파 처리합니다. 순응 후 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트에서 조직 삽입물을 제거합니다. 피펫 100 마이크로 리터의 생물막이 현탁액을 조직 모델에 직접 초음파 처리합니다.
인서트를 1ml의 새 유지보수 매체가 들어 있는 다른 12웰 플레이트로 옮깁니다. 조직 모델을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 조직 처리를 위해 2밀리리터 스크류 캡 O-링 튜브에 1%빔 메르캅토에탄올이 함유된 350마이크로리터의 RLT-용해 완충액을 준비합니다.
튜브에 약 100마이크로리터의 0.5mm 산성 세척 유리 구슬을 추가합니다. 핀셋을 사용하여 매체에서 조직을 포함하는 삽입물을 제거하고 삽입물에 남아 있는 미생물 현탁액을 모두 버립니다. 인서트를 눈높이에서 거꾸로 잡은 다음 19게이지 바늘을 사용하여 인서트 바닥에서 조직과 멤브레인을 조심스럽게 잘라냅니다.
조직과 멤브레인을 준비된 RLT 완충액으로 옮깁니다. 벤치탑 비드 비더 균질화기를 사용하여 30초 동안 조직을 균질화합니다. 제조업체의 지침에 따라 생성된 용해물에서 RNA를 추출합니다.
단백질체학 분석을 위해 저처리량 및 고처리량 방법론을 사용하여 남은 사용한 조직 배지를 수집합니다. HOE 조직에 있는 선동적인 biomarkers의 유전자 표정은 자극되지 않은 대조군과 비교된 biofilm sonicate에 노출 후에 현저하게 upregulated 되었습니다. CCL2, CXCL1 및 CSF3에서 가장 큰 폴드 변화가 관찰되었습니다.
HOE 조직에서 IL8 mRNA 발현은 대조 조직과 비교하여 생물막 초음파 처리로 자극한 후 8.67배 증가했습니다. 사용된 배지의 IL8 단백질 수준은 대조 조직의 밀리리터당 1.005나노그램에서 바이오필름 초음파 자극 조직의 밀리리터당 4.245나노그램으로 증가했습니다.
