HC11 및 EpH4 세포는 배양에서 분화할 수 있는 마우스 유방 상피 세포주입니다. 동시에, 이 세포는 다수의 종양 유전자에 의해 변형될 수 있다. 이 세포는 분화와 신생물 성 변환 사이의 상호 관계에 대한 연구에 이상적입니다.
이 기술은 암 치료를 위한 표적을 찾아내기 위하여 신호 변환 연구 결과에서 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 작은 GTPase Rac 및 기타 분자는 높은 수준으로 발현될 때 유방 상피 세포의 변환을 시작할 수 있지만, 놀랍게도 낮은 수준에서, 그들은 차별화를 유도할 수 있습니다. 다른 신호 변환기도 유사한 방식으로 작동할 수 있습니다.
원리는 세포 합류가 백분세포 또는 근구의 분화와 같은 중요한 역할을 하는 다른 유형의 분화에도 적용될 수 있습니다. 처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 이는 세포 간 접촉이 분화에 중요하기 때문입니다.
주의해야 할 또 다른 점은 매트릭스에서 EpH4 세포를 적절히 추출하는 것이 단백질 수량에 매우 중요하다는 것입니다. 이 메서드의 시각적 데모는 프로토콜의 일부 세부 사항을 종이에 설명하기 어렵기 때문에 유용합니다. 원고 방향에 따라 HC11 세포 배지의 50 밀리리터 병을 준비하는 것으로 시작합니다.
세포를 접시에 담기 위해, 5 6 센티미터 50 %의 컨물 페트리 접시에서 배지를 흡인하고 멸균 9 인치 면이 파전소 파이펫을 사용하여 트립신의 약 1.8 밀리리터로 세포를 세척합니다. 그런 다음 플레이트 당 트립신 200 마이크로 리터를 추가하고 부착 된 세포를 제거하기 위해 접시를 소용돌이. 그들이 빠지기 시작했는지 확인하기 위해 4X 목표를 가진 상 대비 현미경 검사법의 밑에 세포를 관찰하십시오.
그런 다음 멸균 된 9 인치 파스퇴르 파이펫으로 HC11 배지의 약 1.5 밀리리터를 흡인하고 접시를 회전시키면서 세포에 수직으로 분출하여 튀는 것을 방지합니다. 모든 셀을 HC11 배지로 병에 옮기고 소용돌이를 통해 병에 고르게 분산시십시오. 그런 다음 요리 당 세포의 두 밀리리터를 파이프하여 20 3 센티미터 페트리 접시에 세포 현탁액을 알리쿼팅합니다.
페트리 접시를 흔들어 세포를 퍼뜨리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날에 세포가 90 ~ 100 %의 컨실수인 다음 날에 매체를 흡인하고 FBS로 매체로 대체하지만 EGF없이 교체하십시오. 24시간 동안 EGF 없이 배지에서 세포를 성장한 후, 분화 매체를 10개의 접시에 추가하고 다른 10가지 요리를 대조군으로 유지하여 최대 10일 동안 세포를 성장시다.
HIP 처리 및 제어 셀로 2~3일마다 배지를 변경합니다. 분화를 모니터링하려면 위상 대비 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포가 녹색 형광 성 단백질을 표현하는 경우 형광 현미경 검사를 사용합니다.
또한, HIP 치료 및 대조세포로부터 단백질을 추출하고 하루에 한 번 조절하여 분화 정도를 정량화하고 서양 블롯 분석을 수행한다. EpH4 성장 매체, EHS 매트릭스 및 두 개의 원물 50 밀리리터 튜브를 얼음 위에 모으고 놓습니다. 영하 20도의 파이펫 팁으로 조직 배양 판을 미리 식히고 2개의 50밀리리터 원추형 튜브에 10 또는 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오.
영하 20도에서 미리 냉각된 조직 배양 판을 검색한 후, 파이펫으로 매트릭스를 퍼뜨리면 희석되지 않은 매트릭스 150 마이크로리터로 24웰 플레이트의 10개의 우물을 코팅합니다. 행렬을 퍼뜨릴 때 거품을 만들지 마십시오. 그런 다음 접시의 측면을 부드럽게 탭하고 매트릭스가 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.
한편, 이전에 설명된 바와 같이 EpH4 세포를 시험화하고 트립시화 세포의 재발 후 단일 세포 현탁액을 보장함으로써 분화를 준비한다. 다음으로, 혈전계로 현탁액의 세포를 계산합니다. 잘 1.5 밀리리터 멸균 원심분리기 튜브로 잘 10개 세포로 5회 10번 옮기고 5분 동안 250배 g로 회전한다.
조심스럽게 슈퍼 나탄 매체를 흡인하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 1 밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 20% 매트릭스로 보충된 EpH4 성장 매체의 350 마이크로리터에서 세포를 재보습하는 동시에 얼음에 튜브를 유지하여 거품을 피하십시오. 바닥층이 고화되면, 잘 코팅된 각 세포 현탁액에 350 마이크로리터를 추가하고 20% 매트릭스 층이 고화될 수 있도록 1시간 동안 섭씨 37도의 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.
단 하나 세포가 보이는지 확인하기 위하여 상 대비 현미경 검사법을 가진 세포를 관찰하십시오. 그런 다음 상단에 10 %의 매트릭스와 EpH4 매체의 200 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 매트릭스에서 세포를 도금 한 후 하루 분화 유도를 시작합니다.
상위 10% 매트릭스 매체의 150 마이크로리터를 조심스럽게 제거하고 HIP및 10% 매트릭스를 포함하는 EpH4 배지 200 마이크로리터를 추가하고 HIP 없이 10% 매트릭스 매체를 추가합니다. 유방 구체 형성을 위상 대비 현미경으로 최대 10 일 동안 매질을 2 일마다 교체하십시오. 차별화를 정량화하기 위해 우물에서 10% 매트릭스 HIP 배지를 조심스럽게 피펫하고 얼음 차가운 PBS 350 마이크로리터로 20%매트릭스 층을 헹구는 다.
그런 다음 70~100마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 1밀리머 EDTA를 우물에 직접 넣고 파이펫 팁으로 100% 매트릭스의 바닥층을 부드럽게 분리합니다. 접시를 섭씨 4도에서 30분간 부드럽게 흔들어 줍니다. 스페로이드 서스펜션을 원피스 튜브로 조심스럽게 옮기고 500마이크로리터의 PBS EDTA로 우물을 헹구어 남은 스페로이드를 회수합니다.
매트릭스가 완전히 용해되도록 추가로 30 분 동안 얼음에 튜브를 바위. 보이는 매트릭스 덩어리가 표시되면 PBS EDTA를 더 추가하거나 더 길게 흔들어 줍니다. 350배 g의 원심분리제로 스페로이드를 펠릿합니다.
그런 다음 슈퍼나탄을 흡인시키고, 스페로이드를 용해시키고, 서양 블로팅에 의해 베타 카제인, 사이클린 D1 및 p120RasGAP세포를 조사한다. HC11 세포에서 Rac 신호의 강도에 대한 분화의 눈에 띄는 의존도가 있습니다. 내인성 CRAC1은 분화에 필요하고 돌연변이 활성화 된 RacV12의 낮은 수준은 분화 능력의 증가를 야기하지만, 높은 RacV12 수준은 분화의 블록을 트리거하고 신동을 유도한다.
EpH4 세포의 분화 특성이 3D 매트릭스 배양에서 탐구되었을 때, 베타 카제인 생성이 8~10일에서 정점에 이르렀고 사이클린 D1 발현은 HIP 자극 후 4~6일 에서 최대화된 것으로 나타났다. 개별 세포의 위치를 결정하기 위하여는, 그(것)들은 DAPI로 염색되고 공초점 현미경으로 심화되었습니다. HGF를 첨가하면서 유방스피어에서 중공 루멘의 내부 세포 사멸 및 형성이 관찰되어 관 구조의 형성을 초래하였다.
처음으로이 기술을 수행하는 사람은 HC11 세포의 도금이 중요하다는 것을 명심해야합니다. 또한 매트릭스에서 EpH4 세포의 적절한 추출은 어떤 잔류물이 단백질 결정에 영향을 미치기 때문에 단백질 수량에 매우 중요합니다. 이 기술은 유사한 방식으로 동작할 수 있는 다른 신호 변환기를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
암에 있는 드라이버 돌연변이가 있는 경우에, 그 때 그들의 완전한 억제는 낮은 수준이 실제로 분화를 유도할 것이기 때문에 필요하지 않을 것입니다.
