In This Article

Summary

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Abstract

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest powszechny na całym świecie, odpowiada za 90% wszystkich przypadków raka przełyku każdego roku i jest najbardziej śmiertelnym ze wszystkich ludzkich raków płaskonabłonkowych. Pomimo niedawnych postępów w definiowaniu zmian molekularnych towarzyszących inicjacji i rozwojowi ESCC, rokowanie pacjentów pozostaje niekorzystne. Funkcjonalna adnotacja tych zmian molekularnych jest niezbędnym kolejnym krokiem i wymaga modeli, które zarówno rejestrują cechy molekularne ESCC, jak i mogą być łatwo i niedrogo manipulowane w celu adnotacji funkcjonalnej. Myszy leczone mimetycznym tlenkiem 4-nitrochinoliny (4NQO) dymu tytoniowego przewidywalnie tworzą ESCC i preneoplazję przełyku. Warto zauważyć, że zmiany 4NQO powstają również w jamie ustnej, najczęściej na języku, a także w przedżołądku, które mają wspólny warstwowy nabłonek płaskonabłonkowy. Jednak myszami tymi nie można po prostu manipulować w celu testowania hipotez funkcjonalnych, ponieważ generowanie izogenicznych modeli myszy jest czasochłonne i zasobożerne. W tym celu pokonujemy to ograniczenie, generując trójwymiarowe (3D) organoidy pochodzące z pojedynczych komórek od myszy leczonych 4NQO, aby scharakteryzować mysie komórki ESCC lub komórki przednowotworowe ex vivo. Organoidy te wychwytują istotne cechy ESCC i preneoplazji przełyku, mogą być tanio i szybko wykorzystane do tworzenia modeli izogenicznych i mogą być wykorzystane do eksperymentów transplantacji syngenicznych. Pokazujemy, jak generować organoidy 3D z normalnej, przednowotworowej i SCC mysiej tkanki przełyku oraz utrzymywać i kriokonserwować te organoidy. Zastosowania tych wszechstronnych organoidów są szerokie i obejmują wykorzystanie genetycznie modyfikowanych myszy i dalszą charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej lub immunohistochemii, generowanie izogenicznych linii organoidowych przy użyciu technologii CRISPR oraz badania przesiewowe leków lub przeszczepy syngeniczne. Wierzymy, że powszechne zastosowanie technik zademonstrowanych w tym protokole przyspieszy postęp w tej dziedzinie w walce z poważnym obciążeniem ESCC.

Introduction

Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC) jest najbardziej śmiertelnym z ludzkich raków płaskonabłonkowych, ze względu na późną diagnozę, oporność na terapię i przerzuty1,2. ESCC powstaje z warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, który wyściela powierzchnię światła przełyku. Nabłonek płaskonabłonkowy składa się z proliferacyjnych komórek podstawnych i zróżnicowanych komórek w warstwie komórek nadpodstawnych. W warunkach fizjologicznych komórki podstawne wyrażają markery, takie jak p63, Sox2 i cytokeratyna K5 i K14, podczas gdy komórki zróżnicowane wyrażają ekspresję K4, K13 i IVL. Same komórki podstawne są niejednorodne i zawierają domniemane komórki macierzyste zdefiniowane przez markery, takie jak K153 i CD734. W homeostazie komórki podstawne ulegają postmitotycznemu różnicowaniu końcowemu w warstwie komórek nadpodstawnych, podczas gdy zróżnicowane komórki migrują i złuszczają się do światła, aby zakończyć odnowę nabłonka. Przypominając komórki, z których pochodzą, ESCC wykazuje różnicowanie komórek płaskonabłonkowych w różnym stopniu. ESCC często towarzyszą wieloogniskowe histologiczne zmiany prekursorowe, znane jako neoplazja śródnabłonkowa (IEN) lub dysplazja, obejmująca atypowe komórki podstawne. Oprócz zmian nabłonkowych, ESCC wykazuje przebudowę tkanek w obrębie przedziału podnabłonkowego, gdzie następuje aktywacja fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i rekrutacja komórek immunologicznych/zapalnych w celu wspierania mikrośrodowiska sprzyjającego nowotworowi.

Patogeneza ESCC obejmuje zmiany genetyczne i narażenie na środowiskowe czynniki ryzyka. Kluczowe zmiany genetyczne obejmują inaktywację genów supresorowych TP53 i CDKN2A (p16INK4A) oraz aktywację onkogenów CCND1 (cyklina D1) i EGFR, które prowadzą do upośledzenia funkcji punktu kontrolnego cyklu komórkowego, nieprawidłowej proliferacji i przeżycia w stresie genotoksycznym związanym z narażeniem na środowiskowe czynniki rakotwórcze. Rzeczywiście, zmiany genetyczne ściśle oddziałują na behawioralne i środowiskowe czynniki ryzyka, najczęściej palenie tytoniu i spożywanie alkoholu. Dym tytoniowy zawiera substancje rakotwórcze dla ludzi, takie jak aldehyd octowy, który jest również głównym metabolitem alkoholu. Aldehyd octowy indukuje addukty DNA i wiązania krzyżowe między niciami DNA, prowadząc do uszkodzenia DNA i akumulacji mutacji DNA oraz niestabilności chromosomalnej. Biorąc pod uwagę nadmierne bodźce mitogenne i nieprawidłową proliferację w wyniku aktywacji onkogenu, złośliwa transformacja komórek nabłonka przełyku jest ułatwiona przez mechanizmy radzenia sobie ze stresem genotoksycznym, w tym aktywację przeciwutleniaczy, autofagię i przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Co ciekawe, te funkcje cytoprotekcyjne są często aktywowane w rakowych komórkach macierzystych ESCC (CSC), które charakteryzują się wysoką ekspresją CD44 (CD44H) i mają zdolność inicjacji nowotworu, inwazji, przerzutów i oporności na terapię5,6,7.

ESCC został zamodelowany w hodowli komórkowej i na modelach gryzoni8,9. W ciągu ostatnich trzech dekad opracowano solidne, genetycznie modyfikowane mysie modele ESCC. Należą do nich myszy transgeniczne CCND1 i EGFR10,11 oraz myszy z nokautem p53 i p120Ctn12,13. Jednak pojedyncze zmiany genetyczne zazwyczaj nie powodują szybkiego początku ESCC. Wyzwanie to zostało przezwyciężone dzięki zastosowaniu czynników rakotwórczych przełyku, które dobrze podsumowują zmiany genetyczne człowieka w ESCC14. Na przykład tlenek 4-nitrochinolino-1 (4NQO) przyspiesza rozwój ESCC u transgenicznych myszy CCND115. W ostatnich latach domniemane komórki macierzyste nabłonka przełyku, komórki progenitorowe i ich odpowiednie losy były badane w modelach myszy śledzących linię komórkową3,4. Co więcej, te myszy śledzące linię komórkową zostały wykorzystane do zbadania komórek pochodzenia ESCC i tego, w jaki sposób takie komórki powodują powstawanie CSC CD44H za pomocą konwencjonalnej histologii i charakterystyki molekularnej opartej na omice7.

Jednym z pojawiających się obszarów związanych z tymi modelami myszy jest nowatorskie zastosowanie technik hodowli komórkowych do analizy żywych komórek ESCC i komórek prekursorowych w trójwymiarowym (3D) systemie organoidowym, w którym architektura oryginalnych tkanek jest rekapitulowana ex vivo7,8,9. Te organoidy 3D są szybko hodowane z zawiesiny jednokomórkowej wyizolowanej z tkanek myszy, w tym guzów pierwotnych i przerzutowych (np. Uszkodzenia węzłów chłonnych, płuc i wątroby). Komórki są zanurzone w ekstrakcie z błony podstawnej (BME) i karmione dobrze zdefiniowaną, wolną od surowicy pożywką do hodowli komórek. Organoidy 3D rosną w ciągu 7-10 dni, a powstałe kuliste struktury są podatne na subhodowlę, kriopkonserwację i testy do analizy różnych właściwości i funkcji komórkowych, w tym markerów CSC, EMT, autofagii, proliferacji, różnicowania i apoptotycznej śmierci komórki.

Te metody mogą być szeroko stosowane do kultur organoidowych 3D utworzonych z dowolnej warstwowej tkanki nabłonka płaskonabłonkowego, takiej jak błona śluzowa głowy i szyi (jama ustna, język, gardło i krtań), a nawet przedni żołądek. Błona śluzowa głowy i szyi przylega do przełyku, a obie tkanki mają podobną organizację, funkcję i podatność na choroby. Zarówno rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC), jak i ESCC mają wspólne zmiany genetyczne i środowiskowe czynniki ryzyka związane ze stylem życia, takie jak narażenie na palenie tytoniu i alkohol. Podkreślając to podobieństwo, myszy leczone mimetykiem dymu tytoniowego 4NQO łatwo rozwijają zarówno HNSCC, jak i ESCC. Biorąc pod uwagę łatwość, z jaką opisane poniżej protokoły można zastosować do modelowania HNSCC, dołączamy szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia kultur organoidów 3D z tych zmian.

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły generowania mysich organoidów 3D przełyku (MEO) reprezentujących normalne, przednowotworowe i ESCC zmiany rozwojowe u myszy leczonych 4NQO. Można wykorzystać różne szczepy myszy, w tym popularne szczepy laboratoryjne, takie jak C57BL/6 i identyfikowalne linie komórkowe oraz inne genetycznie modyfikowane pochodne. Kładziemy nacisk na kluczowe etapy, w tym izolację normalnego lub chorego mysiego nabłonka przełyku, przygotowanie zawiesin jednokomórkowych, hodowlę i monitorowanie rosnących organoidów 3D, subkulturę, krioprezerwację i przetwarzanie do kolejnych analiz, w tym morfologii i innych zastosowań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Eksperymenty na myszach zostały zaplanowane i przeprowadzone zgodnie z przepisami i zgodnie z protokołem na zwierzętach #AABB1502, sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Columbia. Myszy były trzymane w odpowiedniej placówce opieki nad zwierzętami, która zapewnia humanitarne traktowanie myszy i zapewnia odpowiednią opiekę weterynaryjną dla myszy oraz szkolenie w zakresie bezpieczeństwa laboratoryjnego dla personelu laboratorium.

1. Leczenie myszy 4NQO w celu wywołania zmian w przełyku IEN i ESCC (czas rozważania: do 28 tygodni)

UWAGA: Aby wygenerować MEO reprezentujące nowotworowe zmiany w przełyku, myszy są poddawane chemicznej kancerogenezie za pośrednictwem 4NQO, jak to wcześniej opisali Tang et al.14. Normalne/nienowotworowe MEO są generowane z nieleczonych myszy.

  1. Myszy
    1. Trzymaj od czterech do pięciu myszy w klatce i aklimatyzuj je w obiekcie dla zwierząt przez co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo, że zaburzenia związane z wiekiem spowodują przedwczesne zakończenie pełnego 28-tygodniowego eksperymentu, zacznij od myszy w wieku od 8 do 16 tygodni.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystano myszy C57BL/6 o wadze około 20-30 g. W przypadku krótszych eksperymentów można użyć starszych myszy. Dopuszczalne są samce lub samice myszy. Myszy z grupy kontrolnej (bez leczenia, patrz punkt 1.3.1) muszą być dopasowane pod względem wieku i płci.
  2. Przygotowanie wody pitnej zawierającej 4NQO
    1. Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego 4NQO w glikolu etylenowo-propylenowym (tabela materiałów). Rozpuścić 100 mg 4NQO w 100 ml 99,9% glikolu etylenowo-propylenowego w szklanej zlewce o pojemności 500 ml pokrytej folią uszczelniającą. Dokładnie wymieszać w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą mieszadła magnetycznego przy 800 obr./min przez 30 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 900 ml autoklalawowanej wody dejonizowanej do 100 ml 1 mg/ml roztworu podstawowego 4NQO i wymieszać przez odwrócenie w 2-litrowym plastikowym cylindrze z podziałką pokrytym folią uszczelniającą. Objętość 1 l 100 μg/ml 4NQO w 10% glikolu etylenowo-propylenowym wystarczy na dwie klatki dla myszy wyposażone w butelkę do picia o pojemności 500 ml.
      UWAGA: Warto zauważyć, że 4NQO jest syntetycznym chemicznym czynnikiem rakotwórczym, który może powodować raka. Trzymaj się rękawiczek nitrylowych i fartucha laboratoryjnego z długimi rękawami i noś buty z zakrytymi palcami. Zastanów się nad odpowiednią ochroną oczu, ochroną twarzy i nakryciem głowy. W celu utylizacji odpadów 4NQO należy umieścić w oznakowanym pojemniku zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi gospodarowania odpadami niebezpiecznymi przez środowisko zdrowia i bezpieczeństwa.
  3. Leczenie za pomocą 4NQO i monitorowanie
    1. Podłącz butelkę do picia i podawaj 4NQO za pośrednictwem wody pitnej ad libitum myszom przez 16 tygodni. Stosować 10% (w/v) glikol propylenowy jako nośnik (bez obróbki) kontrolny.
      UWAGA: Krótsze czasy leczenia 4NQO mogą być stosowane do indukcji IEN.
    2. Uzupełniaj wodę raz w tygodniu.
    3. Waż każdą mysz co tydzień, umieszczając ją w plastikowym pojemniku na wadze laboratoryjnej.
    4. Pod koniec 16-tygodniowego okresu leczenia 4NQO, zacznij podawać myszom regularną wodę pitną w okresie obserwacji po 4NQO przez okres do 12 tygodni (Ryc. 1).
    5. Codziennie monitoruj myszy pod kątem oznak niepokoju (np. upośledzenia mobilności, zgarbionego habitusu i wycofanego zachowania), dysfagii i odwodnienia. Dodatkowo co tydzień oceniaj myszy pod kątem zmian w masie ciała lub spożyciu pokarmu i płynów. Jeśli masa ciała spadnie o więcej niż 10% w stosunku do początkowej masy ciała, nakarm myszy płynnym suplementem diety.
      UWAGA: Utrata masy ciała oporna na płynne suplementy diety może wskazywać na ESCC, a myszy, które tracą więcej niż 20% masy ciała, powinny zostać poddane eutanazji. Co ważne, MEO mogą być generowane z myszy poddanych przedwczesnej eutanazji. Należy zauważyć, że myszy C57BL/6 bez modyfikacji genetycznych zazwyczaj nie wykazują oznak zachorowalności ani nie mają widocznych zmian ESCC do końca okresu obserwacji po 4NQO.
  4. Przygotowanie zwierząt
    1. Poddaj myszy eutanazji w komorze CO2 wypełnionej CO2 przy natężeniu przepływu, które przemieszcza 30%-70% objętości komory na minutę. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Przypnij kończyny i nos myszy w pozycji leżącej na plecach do platformy preparacyjnej za pomocą igieł 21 G.
    3. Zdezynfekuj brzuszną powierzchnię myszy 70% etanolem.
  5. Preparacja (czas uwzględnienia: 0,5 h)
    1. Otwórz skórę, szczypiąc sierść i skórę w środkowej części brzucha, aby upewnić się, że została uwolniona z wnętrzności poniżej. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać czaszkowo-ogonowe, brzuszne nacięcie linii środkowej od dolnej części brzucha do podbródka.
    2. Zaczynając od nacięcia w linii środkowej, użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać promieniste nacięcia rozciągające się na kończyny po obu stronach myszy. Otwórz płaty skóry.
    3. Aby odsłonić tchawicę szyjną, użyj nożyczek preparacyjnych, aby podzielić gruczoły ślinowe w linii środkowej. Tchawica leży głęboko w gruczołach.
    4. Aby odsłonić tchawicę piersiową, usuń mostek.
      1. Delikatnie uszczypnij i unieś otrzewną kleszczami, a następnie nożyczkami podziel otrzewną czaszkowo-ogonowo i bocznie wzdłuż klatki piersiowej.
      2. Delikatnie cofnij wątrobę od ogonowej powierzchni przepony i za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w przeponie w wcięciu mostka, a konkretnie na grzbietowej powierzchni wyrostka mieczykowatego. To uwalnia płuca i serce z opłucnej trzewnej.
      3. Oddziel klatkę piersiową od zawartości klatki piersiowej. Włóż nożyczki do nacięcia w przeponie i wypreparuj czaszkę do obręczy szyjnej. Podczas tego rozwarstwienia ściśle przylegaj do grzbietowej powierzchni mostka, aby uniknąć uszkodzenia narządów poniżej. Upewnij się, że płaszczyzna rozwarstwienia znajduje się przed tchawicą.
      4. Odetnij żebra po obu stronach mostka za pomocą nożyczek i usuń mostek. Upewnij się, że zawartość klatki piersiowej jest odsłonięta.
    5. Odsłoń przełyk brzuszny. Delikatnie unieś brzuch do przodu, przytrzymując antrum kleszczami. Wypreparuj śledzionę, trzustkę i krezkę z żołądka i przełyku nożyczkami.
    6. Odsłoń przełyk piersiowy (Rysunek 2).
      1. Delikatnie unieś tchawicę natychmiast doogonowo do chrząstki tarczycy i wypreparuj przełyk po grzbietowej stronie tchawicy za pomocą nożyczek do tęczówki.
      2. Podziel tchawicę na chrząstce tarczycy nożyczkami do tęczówki.
      3. Oderwij tchawicę od pozostałej części przełyku poprzez staranne rozwarstwienie w kierunku ogonowym.
      4. Usuń płuco, serce i grasicę masowo z tchawicą. Uważaj, aby uniknąć uszkodzenia przełyku podczas preparowania i dzielenia aorty i żyły głównej.
    7. Podziel żołądek na odźwierniku nożyczkami.
    8. Oddziel przełyk od kręgu, przytrzymując antrum kleszczami i preparując czaszkę.
    9. Podziel przełyk na poziomie chrząstki tarczycy i masowo zbierz przełyk i żołądek (Rysunek 3).
    10. Oddziel żołądek i przełyk, dzieląc przełyk na wpust (Rysunek 4, górny panel, czerwona linia).
    11. Odetnij wszelkie powięzi na zewnętrznej powierzchni przełyku. Aby zarezerwować próbkę do badania histologicznego (opcjonalnie), usuń połowę przełyku i rozłup wzdłużnie nożyczkami. Umieść pozostały nienaruszony przełyk w zimnym PBS na lodzie.
    12. Otwórz żołądek wzdłuż większej krzywizny i wystarczająco umyj PBS. Oddziel przedni brzuch i umyj zimnym PBS. Umieść przedni żołądek w zimnym PBS na lodzie.
    13. Aby zebrać język, wyjmij igłę 21 G z nosa i wyciągnij język pęsetą. Obetnij język tak długo, jak to możliwe. Umieść język w zimnym PBS na lodzie.

2. Założenie hodowli mysich organoidów przełykowych (MEO)

UWAGA: Ten protokół może być również wykorzystany do stworzenia hodowli organoidów języka mysiego z dodatkiem etapu, w którym tkanka języka jest mielona przed trypsynizacją. Patrz uwaga w kroku 2.2.3.

  1. Przygotowanie odczynników
    UWAGA: Lista odczynników znajduje się w Tabeli materiałów. Roztwory podstawowe należy przygotować i przechowywać zgodnie z instrukcjami producenta, chyba że wskazano inaczej.
    1. Należy zapewnić, że jednorazowe podwielokrotności matrycy błony podstawnej (BME) stosowane w niniejszym protokole są przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia użycia, a następnie rozmrażane na lodzie lub w temperaturze 2-8 °C i przechowywane na lodzie przez cały czas, gdy nie są używane.
    2. Rozpuść 250 mg inhibitora trypsyny sojowej (STI) w 1,000 ml PBS (stężenie podstawowe 250 mg/mL) i wysterylizuj go filtrem (0,22 μm). Dozować 50 ml porcji do stożkowych probówek i przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj pożywkę organoidową dla myszy (MOM): Uzupełnij zaawansowany DMEM/F12 o 1 mM N-acetylo-L-cysteinę (NAC), 2% pożywkę kondycjonowaną R-Spondyną i Noggin (RN CM), 1x suplement N-2, 1x suplement B-27, 10 mM HEPES, 1x antybiotyk-antybiotyk, 1x suplement GlutaMAX i 100 ng / ml mysiego naskórkowego czynnika wzrostu (mEGF). Przygotuj jednorazowo MOM 500 ml, podziel go na porcje po 50 ml i przechowuj w temperaturze 2-8 °C, aż będzie gotowy do użycia. Dodać 0,5 μg/ml amfoterycyny B i 10 μM Y-27632 tuż przed użyciem.
    4. Przed użyciem podgrzej MOM, 0,25% trypsynę i inhibitor trypsyny sojowej (STI) do 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej.
  2. Izolacja keratynocytów z wypreparowanej tkanki myszy (czas obserwacji: 2 h)
    1. Przenieść tkankę przełyku do 500 μl dypazy w PBS (łącznie 2,5-5 jednostek) i inkubować w termomikserze przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 800 obr./min.
    2. Przenieś tkankę do naczynia hodowlanego i ostrożnie usuń warstwę mięśniową z nabłonka za pomocą kleszczy (Rysunek 4).
      UWAGA: Ten krok może być również wykonany przez doświadczonego badacza przed inkubacją z dypazą.
    3. Przenieść nabłonek do probówki mikrowirówkowej zawierającej 500 μl 0,25% trypsyny i inkubować w termomikserze przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 800 obr./min.
      UWAGA: Jeśli materiałem wyjściowym jest tkanka języka, przed dodaniem trypsyny zmiel tkankę sterylnym skalpelem na mniejsze kawałki, o wielkości około 1-2mm2.
    4. Krótko wirować przez 5-10 s przy 2,000 x g, aby osadzać tkankę. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek o pojemności 100 μm. Przenieś zawiesinę tkankową/komórkową przez sitko z końcówką o szerokim otworze, wykonując ruchy okrężne.
    5. Dodaj 3 ml STI przez sitko, wykonując okrężne ruchy do umycia.
    6. Wyszoruj sitko z podstawą tłoka strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml, aby przepchnąć komórki.
    7. Umyj sitko 3 ml PBS 3-5 razy, szorując sitko z podstawą strzykawki między płukaniami.
    8. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    9. Usunąć sklarowany osad, pozostawiając 1 ml roztworu w probówce.
    10. Zawiesić osad w pozostałym 1 ml i przenieść zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    11. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    12. Zawiesić osad w 100 μl MOM; w razie potrzeby dostosować objętość. Wykonaj automatyczne zliczanie komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
  3. Wysiew początkowej zawiesiny komórkowej (uwzględnienie czasu: <1 h)
    1. Podgrzej 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Płytka 5,000 żywotnych komórek w 75% (v/v) BME/MOM o całkowitej objętości 50 μl na studzienkę. Zmaksymalizuj liczbę dołków posianych i przygotuj wystarczającą liczbę komórek w BME na jedną dodatkową studzienkę zgodnie z poniższymi przykładowymi obliczeniami.
      UWAGA: Kriokonserwować nadmiar komórek w pożywce do kriokonserwacji (10% DMSO w FBS) w maksymalnym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Przechowywać kriowiale w pojemniku do zamrażania przez noc w temperaturze -80 °C. Przenieść je do ciekłego azotu w fazie gazowej w celu długotrwałego przechowywania.
    3. W probówce do mikrowirówek należy najpierw przygotować odpowiednie rozcieńczenie komórek w MOM, a następnie dodać BME za pomocą końcówki o szerokim otworze tuż przed posiewem.
    4. Używając końcówki o szerokim otworze o pojemności 200 μl, powoli dodaj kroplę o pojemności 50 μl do środka studzienki, unikając kontaktu między końcówką a dnem lub bokami studzienki (Rysunek 5). Uważaj, aby nie używać zbyt dużej siły do wyrzucenia płynu z końcówki, w przeciwnym razie kopuła się spłaszczy.
    5. Pozostawić BME do zestalenia się przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności względnej (RH) 95%.
    6. Ostrożnie dodać 500 μL MOM na studzienkę uzupełnioną 0,5 μg/ml amfoterycyny B i 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Dodaj amfoterycynę do całego MOM podczas początkowej hodowli podstawowej. Dodać Y-27632 tylko w dniu przejścia (dzień 0) dla wszystkich przejść.
    7. Zmieniaj MOM w dniach 3-4, a następnie co 2-3 dni, aż będzie gotowy do przejścia.
    8. W dniach 7-10 zobrazuj organoidy i zmierz szybkość tworzenia organoidów (OFR), dzieląc liczbę utworzonych organoidów przez liczbę początkowo wysianych komórek.
      Przykładowe obliczenia:
      figure-protocol-1
  4. Pasażowanie i kriokonserwacja mysich organoidów przełyku (MEO) (czas uwzględnienia: <1,5 h)
    1. Rozmrozić i utrzymać BME na lodzie. Przed użyciem podgrzej MOM, 0,05% trypsyny i STI do 37 °C w kąpieli wodnej lub perełkowej. Podgrzej 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Używając końcówki do mikropipet o szerokim otworze, zebrać organoidy w kopule BME wraz z supernatantem. Zakłóć BME, pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Połącz studzienki zawierające identyczne próbki w jedną probówkę do mikrowirówki.
    3. Krótko wirować przez 10-15 s przy 2 000 x g w celu osadzenia organoidów. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    4. Delikatnie usuń osad i ponownie zawieś go w 500 μl 0,05% trypsyny.
    5. Inkubować probówkę (probówki) w termomikserze w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 800 obr./min przez 10 minut.
    6. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 600 μl STI.
    7. Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
    8. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl MOM. Wykonaj automatyczne zliczanie komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
      UWAGA: Głośność można regulować w razie potrzeby.
    9. Płytka 2,000-5,000 żywotnych komórek w 75% (v/v) BME/MOM o całkowitej objętości 50 μl na studzienkę. Zmaksymalizuj liczbę dołków posianych i przygotuj wystarczającą liczbę komórek w BME na jedną dodatkową studzienkę, zgodnie z przykładowymi obliczeniami wspomnianymi wcześniej.
      UWAGA: Kriokonserwować nadmiar komórek w pożywce do kriokonserwacji (10% DMSO w FBS) w maksymalnym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Przechowywać kriowiale w pojemniku do zamrażania przez noc w temperaturze -80 °C. Przenieść je do ciekłego azotu w fazie gazowej w celu długotrwałego przechowywania.
    10. W probówce do mikrowirówek należy najpierw przygotować odpowiednie rozcieńczenie komórek w MOM, a następnie dodać BME za pomocą końcówki o szerokim otworze tuż przed posiewem.
    11. Używając końcówki o szerokim otworze o pojemności 200 μl, powoli dodaj kroplę o pojemności 50 μl do środka studzienki, unikając kontaktu między końcówką a dnem lub bokami studzienki. Uważaj, aby nie używać zbyt dużej siły do wyrzucenia płynu z końcówki, w przeciwnym razie kopuła się spłaszczy.
    12. Inkubować płytkę przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO 2,95% wilgotności względnej.
    13. Ostrożnie dodać 500 μL MOM na studzienkę uzupełnioną 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Dodać Y-27632 tylko w dniu pasażu (dzień 0). Nie ma potrzeby dodawania go podczas zmiany nośników. Dodawanie amfoterycyny B nie jest już konieczne.
    14. Zmieniaj MOM w dniach 3-4, a następnie co 2-3 dni, aż będzie gotowy do przejścia.
    15. W dniach 7-10 zobrazuj organoidy i zmierz OFR.
  5. Rozmrażanie i odzyskiwanie mysich organoidów przełyku (MEO) (czas uwzględnienia: <1 h)
    1. Rozmrozić i utrzymać BME na lodzie. Podgrzej 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj 10 ml zimnego lub RT MOM lub PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    3. Rozmrażać kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub kąpieli perełkowej przez około 30 s do 1 minuty lub do momentu, gdy pozostanie niewielka osadka lodu.
    4. Za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki pipety powoli przenieść zawiesinę komórek do probówki zawierającej MOM lub PBS w sposób kroplowy.
    5. Odwirować probówkę o masie 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby uzyskać granulki komórek.
    6. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl MOM; W razie potrzeby dostosuj głośność. Wykonaj automatyczne zliczanie komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
    7. Płytka 5 000-10 000 żywotnych komórek w 75% (v/v) BME/MOM o całkowitej objętości 50 μl na studzienkę. Zmaksymalizuj liczbę dołków posianych i przygotuj wystarczającą liczbę komórek w BME na jeden dodatkowy dołek, zgodnie z przykładowymi obliczeniami wspomnianymi wcześniej.
    8. Kontynuuj pozostałe etapy protokołu pasażowania i kriokonserwacji mysich organoidów przełyku (MEO) (patrz krok 2.4.11).

3. Przygotowanie organoidów do zatapiania parafiny (czas uwzględnienia: <1 h [plus 1,5 h na przygotowanie odczynnika])

  1. Używając końcówki do mikropipet o szerokim otworze, zbierz trzy studzienki na probówkę do mikrowirówki. Zebrać organoidy w kopule BME wraz z supernatantem. Zakłóć BME, pipetując w górę i w dół.
  2. Krótko wirować przez 10-15 s przy 2 000 x g w celu osadzenia organoidów. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
  3. Delikatnie usuń osad i ponownie zawieś go w 300 μl 4% paraformaldehydu (PFA).
  4. Utrwalić organoidy przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Krótko wirować przez 10-15 s przy 2 000 x g w celu osadzenia organoidów. Usuń i wyrzuć jak najwięcej PFA.
  6. Delikatnie usunąć osad i ponownie zawiesić go w 500 μl PBS.
    UWAGA: Utrwalone organoidy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni przed przejściem do następnego etapu.
  7. Przygotuj 50 ml zapasu żelu agarowego (2% agaru plus 2,5% żelatyny).
    UWAGA: Ze względu na czas inkubacji należy przygotować wywar z żelu agarowego z wyprzedzeniem, a następnie przeprowadzić cykl autoklawu.
    1. Zawiesić ponownie 1 g bakto-agaru i 1,25 g żelatyny w 50 ml wody w szklanej zlewce o pojemności 150 ml nadającej się do sterylizacji w autoklawie.
    2. Zakręć zawieszeniem i pozostaw je na 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 °C.
    4. Lekko ostudzić i dozować 5 ml porcji do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    5. Przechowywać do 6 miesięcy w sklepie RT.
  8. Przygotować powierzchnię do zatapiania, odwracając stojak na probówki do mikrowirówek i przykrywając powierzchnię arkuszem folii uszczelniającej. Etykieta z odpowiednim identyfikatorem(-ami) organoidu.
  9. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut, aby otopić organoidy. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
  10. W międzyczasie upłynnij żel agarowy, umieszczając stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą żel agarowy w szklanej zlewce o pojemności 150 ml zawierającej 100 ml wody i podgrzewając w kuchence mikrofalowej na najwyższym ustawieniu mocy przez 1-2 minuty lub do momentu, gdy woda zacznie wrzeć, a żel agarowy będzie w stanie płynnym.
    UWAGA: Poluzuj nakrętkę stożkowej probówki zawierającej żel agarowy przed podgrzewaniem w kuchence mikrofalowej.
  11. Częściowo zanurzyć probówkę mikrowirówki zawierającą osad organoidowy w ciepłej wodzie, nie wprowadzając wody do probówki do mikrowirówki.
  12. Ostrożnie nałożyć na osad organoidowy, dodając 50 μl agaru z boku probówki.
  13. Nie naruszając osadu (nie zawieszać ponownie, utrzymuj osad w stanie nienaruszonym), przenieś osad w kropelce żelu agarowego na folię uszczelniającą na powierzchni zatapiania.
  14. Powtórzyć kroki 3.12 i 3.13 z dodatkowymi 50 μl płynnego żelu agarowego, aby zebrać pozostałe osadki organoidów i ostrożnie dodać do tej samej kropli żelu.
  15. Inkubować kroplę zawierającą osad organoidowy przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś kropelkę zawierającą osad organoidowy do oznakowanej kasety patologicznej.
  17. Kasetę należy przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  18. Kontynuuj zatapianie parafiny poprzez rutynową obróbkę histologiczną w celu przygotowania bloków parafiny.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Ten protokół opisuje proces generowania mysich organoidów przełyku (MEO) z normalnej tkanki przełyku lub tkanki nowotworowej ESCC od myszy leczonych 4NQO, zgodnie ze specyficznym schematem leczenia składającym się z 16 tygodni 4NQO podawanego w wodzie pitnej, po którym następuje okres obserwacji od 10 tygodni do 12 tygodni (Rysunek 1). Myszy są następnie poddawane eutanazji w celu wycięcia języka lub tkanki przełyku (Rysunek 2 i

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

W opisanych tutaj protokołach istnieje kilka kluczowych etapów i kwestii związanych z generowaniem i analizą prywatnego inwestora. Aby zapewnić odtwarzalność i rygor w eksperymentach w ramach prywatnego inwestora, ważne są zarówno kontrpróby biologiczne, jak i techniczne. W przypadku kontrprób biologicznych na ogół wystarczają dwie do trzech niezależnych myszy z ESCC na warunki doświadczalne. Jednak odpowiednia liczba kontrprób biologicznych może się różnić w zależności od parametrów, które maj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

Dziękujemy Wspólnemu Zasobowi (Cytometria Przepływowa, Patologia Molekularna oraz Mikroskopia Konfokalna i Specjalistyczna) w Herbert Irving Comprehensive Cancer Center na Uniwersytecie Columbia za wsparcie techniczne. Dziękujemy doktorom Alanowi Diehlowi, Adamowi J. Bassowi i Kwok-Kin Wongowi (NCI P01 Mechanizmy Karcynogenezy Przełyku) oraz członkom laboratoriów Rustgi i Nakagawa za pomocne dyskusje. Badanie to było wspierane przez następujące granty NIH: P01CA098101 (H.N. i A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. i H.N.) oraz P30CA013696 (A.K.R.). H.N. i C.L. są laureatami nagrody Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. jest laureatem nagrody Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. jest laureatem nagrody The Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) oraz nagrody American Association for Cancer Research Award. J.G. jest laureatem nagrody Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego (AGA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05% trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25-300-120
0,25% trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25-200-114
0,4% Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
1 ml strzykawka tuberkulinowa bez igłyBD309659
1,5 ml probówka do mikrowirówekThermo Fisher Scientific05-408-129
100 &mikro; m Sitko do komórekThermo Fisher Scientific22363549
15 mL rurki stożkoweThermo Fisher Scientific14-959-53A
200 µ Końcówki do mikropipet L o szerokim otworzeThermo Fisher Scientific212361A
21 G igłyBD305167
24-dołkowa płytkaThermo Fisher Scientific12-556-006
4-tlenek nitrochinolino-1 (4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50 ml rurki stożkoweThermo Fisher Scientific12-565-270
6 dołków talerzThermo Fisher Scientific12556004
70 µ m sitko komórkoweThermo Fisher Scientific22363548
99,9% glikol etylenowo-propylenowySK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
Amfoterycyna BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018Stężenie magazynowe 250 &mikro; g/ml, stężenie końcowe 0,5 &mikro; g/ml
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyThermo Fisher Scientific15240062Stężenie zapasowe 100x, stężenie końcowe 1x
suplement B-27Thermo Fisher Scientific17504044Stężenie zapasowe 50x, stężenie końcowe 1x
Inkubator Bactoagar BD214010
CO2 inkubator, np. Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406lub równoważny
Countess II FL Automatyczny licznik komórek ThermoFisher ScientificAMQAX1000lub równoważny
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Dimetylosulfotlenek (DMSO)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning354235Stężenie podstawowe 50 U/ml, stężenie końcowe 2,5– Nożyczki preparacyjne 5 U/ml
VWR25870-002
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy DulbeccoThermoFisher Scientific14190250Stężenie zapasów 1x
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30071.03
KleszczeVWR82027-386
Pojemnik do zamrażaniaCorning432002lub odpowiednik
ŻelatynaThermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Stężenie wyjściowe 100x, stężenie końcowe 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Stężenie materiału 1 M, stężenie końcowe 10 mM
Płyta grzejna/mieszadłoCorningPC-420Dlub równoważne
Lab Kąpiel z kulkami pancernymi (lub kąpiel wodna)VWR89409-222lub równoważny
Waga laboratoryjnaOhaus71142841lub równoważna
Ekstrakt z błony podstawnej Matrigel (BME)Corning354234
Mikrowirówka MinispinEppendorf22620100lub równoważny
Stojak na probówki do mikrowirówekSouthern Labware0061
Suplement N-2Thermo Fisher Scientific17502048Stężenie magazynowe 100x, stężenie końcowe 1x
N-acetylocysteina (NAC)Sigma-AldrichA9165Stężenie wyjściowe 0,5 M, stężenie końcowe 1
mM Folia Parafilm MThermo Fisher ScientificS37440
Paraformaldehyd (PFA)MiliporeSigma158127-500G
Kaseta patologicznaThermo Fisher Scientific22-272416
Mikroskop z kontrastem fazowymNikonlub równoważny
Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (mEGF)Peprotech315-09-1mgStężenie standardowe 500 ng / &mikro; L, stężenie końcowe 100 ng / ml
RN kondycjonowane komórkowo podłoże eksprymujące R-Spondin1 i Noggin (RN CM)N/AN/ADostępne za pośrednictwem rdzenia organoidów i hodowli komórkowych na żądanie, stężenie końcowe 2%
Wirówka Sorval ST 16RThermo Fisher Scientific75004380lub równoważny
inhibitor trypsyny sojowej (STI)MilliporeSigmaT9128Stężenie zapasowe 250 i mikro; g/ml
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMlub odpowiednik
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Stężenie zapasowe 10 mM, stężenie końcowe 10 i mikro; M

References

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
  4. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  5. Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
  6. Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
  7. Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).
  8. Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
  9. Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
  10. Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
  11. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  12. Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
  13. Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
  14. Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
  15. Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
  16. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  17. Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224(2013).
  18. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  19. Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
  20. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
  21. Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
  22. Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  23. Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).
  24. Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).
  25. Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

rak p askonab onkowy prze ykuESCCorganoidy 3Dheterogeniczno genetycznanowotwotworzeniestrategie terapeutyczneadnotacja funkcjonalnanowotwory wywo ane mutagenemprzygotowanie organoid wprocedura zatapiania parafinytchawica szyjki macicytchawica piersiowaprze yk brzusznyprocedury preparacyjnetechniki chirurgiczne