3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

요약

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

초록

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 매년 모든 식도암 사례의 90%를 차지하며 모든 인간 편평 세포 암종 중에서 가장 치명적입니다. ESCC 시작 및 개발에 수반되는 분자 변화를 정의하는 최근의 진전에도 불구하고 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 이러한 분자 변화의 기능적 주석은 필요한 다음 단계이며 ESCC의 분자 특징을 포착하고 기능적 주석을 위해 쉽고 저렴하게 조작할 수 있는 모델이 필요합니다. 담배 연기 모방체 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4NQO)로 처리된 마우스는 예상대로 ESCC 및 식도 전종양을 형성합니다. 참고로, 4NQO 병변은 구강, 가장 일반적으로 혀와 전위에서도 발생하며, 모두 층화 편평 상피를 공유합니다. 그러나 이러한 마우스는 동종 마우스 모델을 생성하는 데 시간과 리소스가 많이 소요되기 때문에 기능 가설 테스트를 위해 간단히 조작할 수 없습니다. 여기에서 우리는 생체 외에서 쥐 ESCC 또는 전종양 세포를 특성화하기 위해 4NQO로 처리된 마우스에서 단일 세포 유래 3차원(3D) 오가노이드를 생성함으로써 이러한 한계를 극복합니다. 이러한 오가노이드는 ESCC와 식도 전종양의 두드러진 특징을 포착하고, 저렴하고 신속하게 활용하여 동종 모델을 형성할 수 있으며, 동종 이식 실험에 활용할 수 있습니다. 우리는 정상, 전종양 및 SCC 쥐 식도 조직에서 3D 오가노이드를 생성하고 이러한 오가노이드를 유지 및 냉동 보존하는 방법을 보여줍니다. 이러한 다용도 오가노이드의 응용 분야는 광범위하며 유전자 조작 마우스의 활용과 유세포 분석 또는 면역조직화학에 의한 추가 특성 분석, CRISPR 기술을 사용한 동종 오가노이드 라인 생성, 약물 스크리닝 또는 동유전자 이식을 포함합니다. 우리는 이 프로토콜에서 입증된 기술의 광범위한 채택이 ESCC의 심각한 부담을 해결하기 위해 이 분야의 발전을 가속화할 것이라고 믿습니다.

서문

식도 편평 세포 암종(ESCC)은 늦은 진단, 치료 저항성 및 전이로 인해 인간 편평 세포 암종 중 가장 치명적입니다 ^1,2. ESCC는 식도의 내강 표면을 감싸는 층화 편평 상피에서 발생합니다. 편평 상피는 증식성 기저 세포와 기저상 세포층 내의 분화된 세포로 구성됩니다. 생리학적 조건에서 기저 세포는 p63, Sox2, 사이토케라틴 K5 및 K14와 같은 마커를 발현하는 반면 분화된 세포는 K4, K13 및 IVL을 발현합니다. 기저 세포 자체는 이질적이며 K15³ 및 CD73⁴와 같은 마커에 의해 정의된 추정 줄기 세포를 포함합니다. 항상성에서 기저 세포는 기저 상부 세포층 내에서 유사분열 후 말단 분화를 겪는 반면, 분화된 세포는 내강으로 이동하여 박리되어 상피 재생을 완료합니다. 기원 세포를 연상시키는 ESCC는 다양한 정도로 편평 세포 분화를 나타냅니다. ESCC는 종종 비정형 기저 세포를 포함하는 상피내 종양(IEN) 또는 이형성증으로 알려진 다초점 조직학적 전구체 병변을 동반합니다. 상피 변화 외에도 ESCC는 암 관련 섬유아세포(CAF)의 활성화와 면역/염증 세포의 모집이 일어나 종양 촉....

프로토콜

쥐 실험은 규정 및 동물 프로토콜 #AABB1502에 따라 계획되고 수행되었으며 Columbia University의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 검토 및 승인했습니다. 마우스는 마우스의 인도적 치료를 보장하고 마우스에 대한 적절한 수의학적 치료와 실험실 직원을 위한 실험실 안전 교육을 제공하는 적절한 동물 관리 시설에 수용되었습니다.

1. 생쥐를 4NQO로 처리하여 식도 IEN 및 ESCC 병변을 유도 (시간 고려 : 최대 28 주)

참고: 신생물성 식도 병변을 나타내는 MEO를 생성하기 위해 마우스는 이전에 Tang et ^al.14에 의해 설명된 바와 같이 4NQO 매개 화학 발암에 노출됩니다. 정상/비종양성 MEO는 처리되지 않은 마우스에서 생성됩니다.

1. 마우스
   1. 케이지 당 4-5 마리의 마우스를 수용하고 실험을 시작하기 전에 최소 1 주일 동안 동물 시설에 적응시킵니다. 노화 관련 장애로 인해 전체 28 주 실험이 조기 종료 될 가능성을 줄이려면 8 주령에서 16 주령의 마우스로 시작하십시오.
      참고: 무게가 약 20-30g인 C5....

결과

이 프로토콜은 음용수로 투여된 16주간의 4NQO와 10주에서 12주간의 관찰 기간으로 구성된 특정 치료 요법에 따라 4NQO 처리된 마우스의 정상 식도 조직 또는 ESCC 종양 조직에서 쥐 식도 오가노이드(MEO)를 생성하는 과정을 설명합니다(그림 1). 그런 다음 마우스는 혀 또는 식도 조직의 해부를 위해 안락사됩니다(그림 2 및 그림 3). 우리?.......

토론

여기에 설명된 프로토콜에서 MEO의 생성 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 단계와 고려 사항이 있습니다. MEO 실험에서 재현성과 엄격함을 보장하려면 생물학적 및 기술적 복제가 모두 중요합니다. 생물학적 복제물의 경우, ESCC를 보유하는 2-3개의 독립적인 마우스는 일반적으로 실험 조건당 충분합니다. 그러나 적절한 생물학적 복제 횟수는 개별 연구에서 테스트할 매개변수에 따라 달라질 수 있습니.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25-300-120
0.25% trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25-200-114
0.4% Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
1 mL tuberculin syringe without needle	BD	309659
1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
100 µm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	22363549
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-53A
200 µL wide bore micropipette tips	Thermo Fisher Scientific	212361A
21 G needles	BD	305167
24 well plate	Thermo Fisher Scientific	12-556-006
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)	Tokyo Chemical Industry	NO250
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	12-565-270
6 well plate	Thermo Fisher Scientific	12556004
70 µm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	22363548
99.9% ethylene propylene glycol	SK picglobal
Advanced DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028
Amphotericin B	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15290018	Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	Stock concentration 100x, final concentration 1x
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Stock concentration 50x, final concentration 1x
Bacto agar	BD	214010
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i	Thermo Fisher Scientific	51026406	or equivalent
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	or equivalent
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	03-337-7D
DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	MilliporeSigma	D4540
Dispase	Corning	354235	Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL
Dissecting scissors	VWR	25870-002
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190250	Stock concentration 1x
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH30071.03
Forceps	VWR	82027-386
Freezing container	Corning	432002	or equivalent
Gelatin	Thermo Fisher Scientific	G7-500
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stock concentration 100x, final concentration 1x
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080	Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
Hot plate/stirrer	Corning	PC-420D	or equivalent
Lab Armor bead bath (or water bath)	VWR	89409-222	or equivalent
Laboratory balance	Ohaus	71142841	or equivalent
Matrigel basement membrane extract (BME)	Corning	354234
Microcentrifuge Minispin	Eppendorf	22620100	or equivalent
Microcentrifuge tube rack	Southern Labware	0061
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Stock concentration 100x, final concentration 1x
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma-Aldrich	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Parafilm M wrap	Thermo Fisher Scientific	S37440
Paraformaldehyde (PFA)	MilliporeSigma	158127-500G
Pathology cassette	Thermo Fisher Scientific	22-272416
Phase-contrast microscope	Nikon		or equivalent
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)	Peprotech	315-09-1mg	Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)	N/A	N/A	Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%
Sorval ST 16R centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004380	or equivalent
Soybean trypsin inhibitor (STI)	MilliporeSigma	T9128	Stock concentration 250 µg/mL
ThermoMixer C	Thermo Fisher Scientific	14-285-562 PM	or equivalent
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM