Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Resumo

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Resumo

O coração do rato é um modelo popular para estudos cardiovasculares, devido à existência de tecnologia de baixo custo para a engenharia genética nesta espécie. Fenotipagem fisiológicas cardiovasculares do coração do mouse pode ser feito facilmente usando imagens de fluorescência empregando várias sondas para potenciais transmembrana (V _m), transientes de cálcio (CAT), e outros parâmetros. Excitação-contração de acoplamento é caracterizado pela dinâmica do potencial de ação e intracelular de cálcio e, portanto, é extremamente importante para mapear tanto _m V e CAT simultaneamente a partir do mesmo local no coração ^1-4. Mapeamento óptica simultânea de Langendorff perfundidos corações do rato tem o potencial para elucidar os mecanismos subjacentes insuficiência cardíaca, arritmias, doença metabólica e outras doenças cardíacas. Visualização de ativação, velocidade de condução, a duração do potencial de ação, e outros parâmetros em uma infinidade de sites não pode ser alcançado a partir de investigação nível celular, mas é bem resolvido pelo mapeamento óptico ^1,5,6. Neste artigo apresentamos a configuração de instrumentação e das condições experimentais para o mapeamento de óptica simultânea de V _m e CAT nos corações do rato com a resolução espaço-temporal de alta usando state-of-the-art tecnologia de imagens CMOS. Consistente gravações ópticas obtidas com este método ilustrar que o mapeamento simultâneas óptico de corações de camundongos perfundidos Langendorff é viável e confiável.

Protocolo

1. Preparação prévia das soluções de reserva

1. Prepare duas soluções estoque de solução de Tyrode do (16x) de antecedência em água deionizada e armazená-los a 4 ° C:
   1. Ações I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl ₂ (2H ₂ O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH ₂ PO _4, 3,408 g / L MgCl ₂ (6H ₂ O), (Fisher Lawn, científico Fair, NJ));
   2. Estoque II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
2. Preparar soluções estoque de corantes fluorescentes. Para evitar congelamento e descongelamento repetidos, nós armazenamos 30 mL alíquotas de ambos os corantes a -20 ° C, o que é suficiente para uma experiência:
   1. Sensíveis à voltagem solução estoque de corante RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1,25 mg / mL em dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);
   2. Cálcio indicador Rhod-2:00 solução-mãe (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mg / ml de solução em DMSO.
3. Prepare excitação-contração desacoplador solução estoque blebbistatin (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / mL em solução de DMSO) de antecedência e guardar o blebbistatin dissolvida a 4 ° C.

2. Preparar soluções de perfusão e configuração experimental ⁷

4. Recém preparar solução Tyrode 2L do (128.2mM NaCl, 1,3 mM CaCl ₂ (2H ₂ O), 4,7 mm KCl, 1,05 mm MgCl ₂ (6H ₂ O), 1.19mM NaH ₂ PO _4, NaHCO 20mM _3, 11,1 mM de glicose-D em água deionizada, pH = 7,35 ± 0,05). Se a solução de ações está sendo usado para fazer 2L de solução de Tyrode do (suficiente para um experimento) Tomar 1750 mL de água deionizada e misturar em 125 mL de Ações I, 125 mL de Ações II, e 4g de glicose.
5. Ligue as duas bombas dos sistemas de perfusão. Definir a bomba peristáltica (Peri-Star, WPI, Sarasota, EUA) que é usado para perfusão retrógrada a 40 mL / min. Definir a bomba peristáltica outros (Cole-Parmer Masterflex Bomba Peristalic L / S, empresa Instrumento Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois) que é usado para superfusão e devolver o perfusato de volta para o reservatório de exploração para 80 mL / min.
6. Lavar o sistema de perfusão com etanol 70% por 30 min e depois com água deionizada 2L.
7. Uma vez que toda a água deionizada é evacuada da câmara, circula a solução Tyrode e passá-lo através de um filtro 5 mícrons (Millipore, Billerica, MA, EUA). Aqueça o perfusato a 37 ° C com uma jaqueta de água e circulador (ThermoNESLAB EX7, Newtown, EUA) e do perfusato a oxigenar por borbulhamento O ₂ / CO ₂ (95% / 5%) de gás na solução. Monitorar o pH da solução com um medidor de pH (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) e ajustar a taxa de O ₂ / CO ₂ borbulhando para manter o pH em 7,35 ± 0,05. Continue pHmetria e temperatura durante o experimento.
8. O aparelho de mapeamento de dupla óptica consiste em duas Micam Ultima-L CMOS câmeras (SciMedia, Costa Mesa, CA), que têm alta espacial (100x100 pixels, 230 ± 20 mM por pixel) e resolução (1.000-3.000 frames / seg) temporal. Fixar um filtro passa-banda (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) na frente da câmera designada imagem de cálcio, enquanto que, um filtro passa-tempo (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) precisa ser posicionado na frente da câmera designada tensão de imagem. As câmeras são dispostos perpendicularmente uns aos outros por um titular, que contém um espelho dicróico (635 nm de corte, Omega Optical, Brattleboro, VT). Imediatamente abaixo do titular câmera dupla, há uma lente (Nikon Nikkor 55 milímetros 1:1.4 235.052), que concentra a emissão de luz que vem do coração para o espelho dicróico. A distância de trabalho é de aproximadamente três centímetros.
   A luz de excitação é gerada por uma lâmpada halógena (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) e é transmitida através de um filtro de calor, obturador, e filtro passa-banda (520 ± 45 nm). A guia de luz flexível direciona a luz passa-banda filtrada para a preparação, e um obturador é usada para garantir que a preparação é exposto à luz apenas durante a aquisição de imagem para evitar fotodegradação dos corantes.
9. Prepare Ag / AgCl ₂ eletrodos para estimulação e detecção antecipada e instalá-los na câmara antes de colocar o coração. Certifique-se que amplificadores e filtros são ajustados para níveis apropriados.

3. Colheita do coração mouse, canular e configurar perfusão Langendorff

10. Anestesiar o rato com cetamina / xilazina (cetamina, 80mg/kg de peso corporal; xilazina, 10 mg / kg) e heparina (100 unidades) por injeção intraperitoneal. Assegurar um nível adequado de anestesia com a falta de reflexo de dor.
11. Após uma incisão médio-esternal, remover rapidamente o coração e lave-o em oxigenada (95% O _2, 5% CO _2), a temperatura constante (37 ± 1 ° C) solução Tyrode é.
12. Usando um microscópio de dissecação, Identificar rapidamente a aorta e fazer um corte limpo em toda a aorta ascendente abaixo da artéria subclávia direita. Uma pequena secção de aorta é então ligado a uma custom made 21 calibre da cânula com uma ponta queimado. Fio de seda preto trançado 4-0 (Corporação especialidades cirúrgicas, Reading, PA) é usado para corrigir o coração para a cânula. Após canulação, o coração é perfundido retrogradamente e superfused com solução Tyrode é. A taxa de perfusão retrógrada é ajustado na faixa de 2-5 mL / min para manter a pressão aórtica entre 60 e 80 mmHg (transdutor de pressão, instrumentos de precisão Inc Mundial (WPI), Sarasota, EUA; Ponte Amplificador TBM4M, WPI, Sarasota, EUA).
13. Depois que o coração é canulada, pulmão, timo, tecido adiposo e são, então, dissecados e removidos.
14. O coração isolado é preso (Ferramentas Ciência Fine) no ápice para a parte inferior da câmara de perfusão (revestido Sylgard) para evitar fluxo induzido por movimento. Os apêndices atriais direito e esquerdo também são esticados e presos (Ferramentas Ciência Fine, Inc, Foster City, CA) para o fundo da câmara, que fornece superfície máxima para medidas ópticas dos átrios.
    Muito importante! Um pequeno tubo de silicone é inserida no ventrículo esquerdo através das veias pulmonares e fixado por fio de seda para o tecido conjuntivo nas proximidades. Isso evita que o congestionamento solução e acidificação do perfusato preso no ventrículo esquerdo, que é especialmente importante após a supressão das contracções ventriculares com um desacoplador excitação-contração (consulte a etapa Parte 4 19).
15. Um eletrodo feito sob medida é colocada sobre a superfície do coração para conduzir os estímulos ritmo, que é gerado pelo Mestre-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalém, Israel) ou 26T PowerLab (AD Instruments, Sydney, Austrália).
16. A tampa de vidro de pequeno porte é fixa na superfície da solução sobre o coração para reduzir artefatos de movimento a partir da solução de vibração.
17. O foco da luz de excitação sobre o coração. Além disso, ajustar a distância entre o aparelho de câmara dupla e do coração para que a resolução máxima será obtido.
18. Desligar todas as luzes na sala e iniciar as gravações elétrica usando PowerLab 26T.

4. Tensão de carga de cálcio e corantes sensíveis e excitação-contração desacoplador

19. Warm-up de 0,6 mL blebbistatin. Misture 0,5 mL da blebbistatin com o perfusato no reservatório de retenção. Diluir a 0,1 mL restantes de blebbistatin em 1 mL de solução de Tyrode e injetá-la lentamente (ao longo de um período de 20 minutos) através de uma porta de drogas localizado perto da cânula. Observe como blebbistatin reduz gradualmente o artefato de movimento.
20. Diluir 30 mL da solução estoque de tensão sensíveis corante RH237 em solução 1 mL Tyrode e injectar lentamente ao longo de 5-7 minutos na porta de injeção mesma blebbistatin.
21. 30 mL de cálcio indicador Rhod-02:00 01:01 é misturado com PLURONIC F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, solução a 20% em DMSO) e, em seguida, diluídas em 1 ml de solução Tyrode e lentamente aplicado sobre min 10/05, através da porta de injeção mesmo .
22. Aguarde 5-10 minutos para blebbistatin e corantes para alcançar a membrana celular e citoplasma. Continue com o protocolo quando o movimento é completamente suprimida.
23. Continuamente gravações monitor ECG sobre todo o procedimento para garantir a função elétrica normal do coração.
24. Iniciar as gravações usando o sinal fluorescente SciMedia custom software (SciMedia, Costa Mesa, CA).

5. Resultados representativos:

Figura 1. Instalação experimental para a perfusão, gravações elétricas e mapeamento óptico.
EM = emissões; Lp = longpass

Figura 2. Preparação Experimental e exemplos sinal gravado durante a estimulação ventricular. Esquerda: Os sinais de ECG são coletados de Ag / AgCl _dois eletrodos de disco (Top) e um exemplo de S1S1 protocolo de estimulação é mostrado (Bottom). Center: Langendorff preparação do coração mouse. Direita: Representante potenciais de ação óptica e sinais de cálcio transiente de átrios (Top) e ventrículos (Bottom) são mostrados. A seta amarela (Top) aponta para a dispersão de sinal fluorescente vinda dos ventrículos, que é visto nas gravações atrial.
LV = ventrículo esquerdo, VD = ventrículo direito; LA = átrio esquerdo; RA = átrio direito

Figura 3. Representante gravações ópticas de V _m e CAT dos ventrículos do coração selvagem do tipo de mouse. A. A preparação experimental com uma série de pontos espaçados marcada por pontos pretos, cuja óptica gravações pode ser visto em (C). Exemplo B. rastreamento de V _m eo gato de uma localização central na matriz (ver caixa in (C)). C. V _m (azul) e CAT (vermelho) da série de pontos espaçados. Sinais foram binned 3x3.

Figura 4. Mapa de ativação e de condução. A. Um mapa de ativação exemplo de um coração selvagem do tipo de mouse com transversal (T) e (L) longitudinal direções indicadas pelas setas brancas. Sinais B. V _m (Top) e dV / dt (Bottom), correspondentes aos três pontos de vista em A (T1, T2, T3, L1, L2, L3).

Figura 5. Potencial de ação e de cálcio análise de duração transitória. A. duração Ação potencial de 80% repolarização (APD80) e duração de cálcio transiente menos 80% de relaxamento (CaD80) mapas são mostrados de um coração em condições controle (esquerda) e depois de 30 nM isoproterenol aplicação (Direito). A cor amarela / verde nos ventrículos (direito) indica isoproterenol encurtado APD80 e CaD80. Exemplo B. traçados de APD80 e CaD80 dos ventrículos do tipo selvagem mouse (Top) e átrios (Bottom).

Discussão

Neste experimento nós modificamos o método de perfusão Langendorff adicionando um pequeno tubo de silicone, que é especialmente crucial depois da supressão das contracções ventriculares com um desacoplador excitação-contração. O tubo de silicone é usado para evitar o congestionamento solução, a acidificação da solução de perfusão, e desenvolvimento de isquemia do ventrículo esquerdo. O coração do mouse é muito sensível à hipotermia, assim, variações de temperatura em todo o coração vai causar diferenças artificial em durações potencial de ação. Conseqüentemente, um sistema de aquecimento foi implementado na câmara de perfusão, a fim de manter uma temperatura constante de 37 ° C durante a totalidade do experimento ^8. Uma vez que um modelo Langendorff não retém a inervação do coração, é preciso considerar a adição de neurotransmissores para o perfusato, a fim de investigar o tônus ​​simpático e parassimpático fisiológicas ^9. Além de perfusão retrógrada, a adição de superfusão do coração ajuda a manter adequados parâmetros ambientais tais como pH e temperatura. Neste método, o coração foi perfundido Langendorff horizontalmente colocado. Uma configuração de perfusão verticais Langendorff também pode ser usado ^10, mas pode resultar em um pouco diferente mecânica cardíaca ^11. Além de câmeras CMOS, detectores de alternativas também estão disponíveis e podem ser aplicados para mapear V _m e CAT simultaneamente ^12.

Aplicação de câmeras CMOS de resolução espaço-temporal de alta garante a precisão das gravações, no entanto, sinais de mapeamento óptico não são de uma única célula. Ao contrário, cada sinal fluorescente vem de centenas ou milhares de células, dependendo de ampliação ótica. A fluorescência ventricular muito maior pode distorcer os sinais atrial pelo espalhamento óptico e, portanto, a interpretação cuidadosa dos sinais gravados oticamente é necessária. Outra limitação da preparação do mouse é a distorção de sinal e ruído induzido pela curvatura da superfície, devido ao pequeno tamanho do coração ^13. Medições de velocidade de condução pode ser alterado não só a partir da curvatura do coração de rato, mas também da polaridade do eletrodo e eletrodos virtual. Para alcançar a precisão de velocidade de condução, anisotropia, ativação e repolarização mapas, correto foco da câmera na superfície do coração é essencial.

Neste método, as gravações em tempo real ECG pode complementar a investigação óptica de eletrofisiologia cardíaca. Sensíveis à voltagem corante (RH237) e indicador de cálcio (Rhod-2:00) são utilizados no protocolo por causa de sua rápida resposta, excitação semelhante, e espectros de emissão de ^3,7. Existem combinações alternativas de corantes que podem ser usados ​​para medir V _m e CAT que não RH237 e-Rhod 02:00 ^3. Um corante sensíveis à voltagem romance, PGHI, com uma grande mudança do Stoke (> 200 nm) foi encontrada para permitir uma melhor _m V e sinais de CaT, devido à maior separação entre os comprimentos de onda de emissão entre PGHI e Rhod-2:00 ^14. Melhoramentos futuros podem se concentrar em explorar novas sondas fluorescentes, o desenvolvimento de detectores de novas imagens, e software de processamento melhorado a imagem. Maior resolução e novas modalidades de imagem óptico para o mapeamento óptico 3D também são importantes direções futuras de mapeamento óptico ^5.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Químico	Companhia	Número de catálogo
NaCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S271-1
CaCl 2 (2H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	C79-500
KCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	Técnica S217-500
MgCl 2 (6H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	M33-500
NaH 2 PO 4 (H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S369-500
NaHCO 3	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S233-3
D-Glicose	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	1760
RH237	Invitrogen, Carlsbad, CA	S1109
Rhod-02:00	Invitrogen, Carlsbad, CA	R1244
PLURONIC F127	Invitrogen, Carlsbad, CA	P3000MP
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma, St. Louis, MO	D2650