Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

Резюме

Эта статья подробно процедура вскрытия, инструментальная установка, и экспериментальных условиях при оптическом отображение трансмембранного потенциала (ВМ) и внутриклеточного кальция переходных (КПП) в интактных изолированных Langendorff перфузии мыши сердца.

Аннотация

Мышь сердце популярной моделью развития сердечно-сосудистых исследований из-за наличия недорогих технологий для генной инженерии у этого вида. Сердечно-сосудистые физиологических Фенотипирование мыши сердца можно легко сделать с помощью флуоресцентной визуализации с использованием различных зондов для трансмембранного потенциала (V _м), кальция переходных (КПП), и другие параметры. Возбуждение-сжатия связи характеризуется потенциала действия и внутриклеточной динамики кальций, поэтому крайне важно, чтобы обе карты V _м и кот одновременно с того же места на сердце ^1-4. Одновременное отображение из оптических Langendorff перфузии сердца мыши имеет потенциал для выяснения механизмов, лежащих сердечной недостаточности, аритмии, нарушение обмена веществ, и других сердечных заболеваний. Визуализация активации, скорости проведения, продолжительность потенциала действия и других параметров на множество сайтов не может быть достигнута из ячеистого расследования уровне, но хорошо решается оптическим отображением ^1,5,6. В этой статье мы представляем установку приборов и экспериментальных условий для одновременного оптического отображение V _м и КПП в мыши сердца с высоким пространственно-временным разрешением использования государством в самых современных КМОП-технологий визуализации. В соответствии оптических записей, полученных с помощью этого метода показывают, что одновременное отображение оптических Langendorff перфузии сердца мыши является возможным и надежным.

протокол

1. Расширенный подготовке исходных растворов

1. Приготовьте два растворы решения Тирода (16x) заранее в деионизованной воде и хранить их при температуре 4 ° C:
   1. Сток I (119,872 г / л NaCl, 3,056 г / л CaCl ₂ (2H ₂ O), 5,6 г / л KCl, 2,6274 г / л NaH ₂ PO _4, 3,408 г / л MgCl ₂ (6H ₂ O), (Fisher Научные, Fair Lawn, NJ));
   2. Со II (26,88 г / л NaHCO 3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
2. Подготовка растворы флуоресцентных красителей. Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, мы сохраняем 30 мкл аликвоты и красителей при температуре -20 ° С, что вполне достаточно для одного эксперимента:
   1. Напряжение чувствительных красителей RH237 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) маточного раствора, 1,25 мг / мл раствора в диметилсульфоксид (ДМСО, Sigma, Сент-Луис, Миссури);
   2. Кальций индикатор Rhod-2 утра (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) маточного раствора, 1 мг / мл раствора в ДМСО.
3. Подготовка возбуждение-сокращение разобщающий агент blebbistatin маточного раствора (Tocris Bioscience, Сент-Луис, Миссури, 2 мг / мл раствора в ДМСО) заранее и хранить растворенный blebbistatin при 4 ° C.

2. Подготовка перфузии решений и экспериментальной установки ⁷

4. Недавно подготовить решение 2L Тирода (128.2mM NaCl, 1,3 мм CaCl ₂ (2H ₂ O), 4.7mM KCl, 1,05 мм MgCl ₂ (6H ₂ O), 1.19mM NaH ₂ PO _4, 20 мМ NaHCO _3, 11.1mM D-глюкозы в деионизованной воде, рН = 7,35 ± 0,05). Если исходный раствор, который используется, чтобы сделать 2L решения Тирода (достаточно для одного эксперимента) принимать 1750 мл деионизированной воды и перемешать в 125 мл на месте я, 125 мл фондового II, и 4 г глюкозы.
5. Включите двух насосов перфузии систем. Установить перистальтического насоса (Peri-Star, WPI, Сарасота, США), который используется для ретроградной перфузии до 40 мл / мин. Установите другие перистальтического насоса (Cole-Parmer Masterflex Peristalic насоса L / S, Коул-Parmer Instrument Company, Вернон Хиллс, штат Иллинойс), которая используется для superfusion и вернуться обратно в перфузат проведения водохранилища до 80 мл / мин.
6. Вымойте перфузии системе с 70% этанолом в течение 30 минут, а затем с 2 л деионизированной воды.
7. После того как все деионизированной воды из камеры откачивается, распространить решение Тирода и передать его через 5-мкм фильтр (Millipore, Billerica, штат Массачусетс, США). Теплый перфузат до +37 ° С с водяной рубашкой и циркулятор (ThermoNESLAB EX7, Newtown, США) и кислородом перфузат барботированием O ₂ / CO ₂ (95% / 5%) газа в раствор. Монитор рН раствора с рН-метра (Oakton Instruments, Вернон Хиллс, штат Иллинойс) и настроить скорость O ₂ / CO ₂ пузырящийся держать рН 7,35 ± 0,05. Продолжить мониторинг рН и температуры в ходе эксперимента.
8. Двойной оптической аппаратуры отображения состоит из двух MICAM Ultima-L CMOS-камер (SciMedia, Коста Меса, Калифорния), которые имеют высокое пространственное (100x100 пикселей, 230 ± 20 мкм на пиксель) и временные (1000-3000 кадров / сек) разрешением. Fix полосовой фильтр (590 ± 15 нм, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) перед назначенным камера кальция, в то время, долго фильтр (> 700 нм, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) должен быть расположен в Перед назначенным камера напряжения. Камеры расположены перпендикулярно друг с другом держателе, который содержит дихроичных зеркал (635 нм отсечки, Омега Оптические, Brattleboro, VT). Непосредственно под двойной держатель камеры есть объектив (Nikon NIKKOR 55 мм 1:1,4 235052), которая фокусируется излучение света, идущего от сердца на дихроичных зеркал. Рабочее расстояние около 3 см.
   Возбуждающего света генерируется галогенная лампа (Newport Oriel Instruments, Стратфорде, штат Коннектикут; SciMedia, Коста Меса, Калифорния) и пропускается через фильтр тепла, затвор, и полосовой фильтр (520 ± 45 нм). Гибкий световод направляет полосовой фильтр свет на подготовку, а затвора используется, чтобы гарантировать, что препарат подвергается воздействию света только во время получения изображения, чтобы избежать фотообесцвечивания красителей.
9. Подготовка Ag / AgCl ₂ электродов для стимуляции и зондирования заранее и установить их в камере до размещения сердце. Убедитесь, что усилители и фильтры настроены на соответствующих уровнях.

3. Урожай мыши сердце, иглу, а также создать Langendorff перфузии

10. Обезболить мышь с кетамином / ксилазина (кетамин, 80mg/kg массы тела; ксилазина, 10 мг / кг массы тела) и гепарин (100 единиц) по внутрибрюшинного введения. Обеспечение необходимого уровня анестезии из-за отсутствия боли рефлекс.
11. После середины грудины разрез, быстро удалить сердца и промыть его в кислород (95% O _2, 5% СО _2), с постоянной температурой (37 ± 1 ° C) раствор Тирода.
12. Использование рассекает микроскопом, Быстро идентифицировать аорты и сделать чистый срез по восходящей аорты ниже правой подключичной артерии. Короткий участок аорты затем прикрепляется к заказу 21 калибра канюли с вспыхнул чаевые. 4-0 черный плетеный шелк для наложения швов (Хирургическое Корпорация Специальности, Reading, PA) используется для исправления сердца на канюлю. После катетеризации, сердце ретроградно перфузии и superfused с решением Тирода. Ретроградной перфузии скорость регулируется в диапазоне от 2-5 мл / мин держать аортального давления между 60 и 80 мм рт.ст. (Датчики давления, Всемирный точных приборов Inc (WPI), Сарасота, США; моста Усилитель TBM4M, WPI, Sarasota, США).
13. После сердце канюлированные, легких, вилочковой железы, а жировая ткань, затем расчленены и удалены.
14. Изолированного сердца закреплен (Fine Инструменты наук) на вершине на дно камеры перфузии (Sylgard покрытием), чтобы предотвратить поток вызванных движением. Правое и левое предсердия придатков также растягивается и возлагали (Fine инструменты Наука, Inc, Foster City, CA) в нижней части камеры, что обеспечивает максимальную площадь поверхности для оптических измерений предсердий.
    Очень важно! Трубочку кремния вставляется в левый желудочек через легочные вены и фиксируется шелковых шва на близлежащие соединительной ткани. Это предотвращает перегрузку решение и подкисление перфузат в ловушке левого желудочка, что особенно важно после подавления желудочковых сокращений с возбуждением-сжатия разобщающий агент (см. часть 4 шаг 19).
15. Заказ электрод помещается на поверхности сердца для проведения стимуляции стимуляции, который генерируется мастер-8 (AMP Ltd инструменты, Иерусалим, Израиль) или PowerLab 26Т (AD инструменты, Сидней, Австралия).
16. Небольшая стеклянная крышка фиксируется на поверхности раствора через сердце, чтобы уменьшить движение артефакт из вибрирующих решение.
17. Фокус возбуждающего света на сердце. Кроме того, настроить расстояние между аппаратом двойного камеры и сердце, чтобы максимальное разрешение будет получено.
18. Выключите все освещение в комнате и начать электрической записи на основе PowerLab 26Т.

4. Напряжение нагрузки и кальций чувствительной красителей и возбуждение-сокращение разобщающий агент

19. Разминка 0,6 мл blebbistatin. Смешать 0,5 мл blebbistatin с перфузат в проведении водохранилище. Развести оставшиеся 0,1 мл blebbistatin в 1 мл раствора Тирода и медленно вводить его (в течение 20-минутного периода) с помощью наркотиков порт расположен вблизи канюли. Соблюдайте, как blebbistatin постепенно уменьшает движение артефакт.
20. Развести 30 мкл напряжения чувствительного красителя RH237 маточного раствора в растворе 1 мл Тирода и медленно вводят в течение 5-7 минут в тот же порт, как инъекции blebbistatin.
21. 30 мкл индикатора кальция Rhod-2 АМ 1:01 смешивается с Pluronic F127 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, 20% раствор в ДМСО), а затем разводят в 1 мл раствора Тирода и медленно применяться в течение 5-10 мин через тот же порт инъекции .
22. Подождите 5-10 минут для blebbistatin и красителей для достижения клеточной мембране и цитозоле. Продолжить с протоколом, когда движение полностью подавлены.
23. Непрерывный мониторинг ЭКГ в течение всей процедуры для обеспечения нормальной электрической функции сердца.
24. Приступить к записи флуоресцентный сигнал, используя SciMedia заказного программного обеспечения (SciMedia, Коста Меса, Калифорния).

5. Представитель результаты:

Рисунок 1. Экспериментальная установка для перфузии, электрические и оптические записи карт.
EM = выбросов; Lp = longpass

Рисунок 2. Экспериментальная подготовка и сигнал примеры записаны во время стимуляции желудочков. Слева: ЭКГ сигналы собираются из Ag / AgCl электродов ₂ диска (вверху) и пример S1S1 стимуляции протокол показано на рисунке (внизу). Центр: Langendorff мыши сердце подготовки. Справа: представитель оптических потенциалов действия и кальция переходные сигналы от предсердий (вверху) и желудочков (внизу) показаны. Желтая стрелка (Топ) указывает на флуоресцентные рассеяния сигнала, поступающего от желудочков, которая проявляется в предсердии записей.
LV = левого желудочка; RV = Правый желудочек; LA = левое предсердие; RA = правого предсердия

Рисунок 3. Представителю оптические записи V _м и кот из желудочков сердца мышей дикого типа. А. экспериментального препарата с массивом равномерно расположенных местах отмечены черными точками, оптические записи можно увидеть на (С). Б. Пример отслеживания V _м и Кэт центре города, на массив (см. вставку яП (С)). С. V _м (синий) и CAT (красный) из массива равномерно распределенных точках. Сигналы были binned 3x3.

Рисунок 4. Карту активации и проводимости. А. карте пример активации от диких сердцем мыши типа с поперечной (Т) и продольных (L) направлениях, указанных белыми стрелками. Б. В. _м сигналов (вверху) и DV / DT (нижняя), соответствующие трем точкам видно (T1, T2, T3, L1, L2, L3).

Рисунок 5. Потенциальных действий и кальция анализа переходных процессов длительностью. А. Меры потенциальную продолжительность на уровне 80% реполяризации (APD80) и кальция переходных длительности на 80% релаксации (CaD80) карты показаны со сердца под контролем условиях (слева) и после 30 нМ изопротеренол приложения (справа). Желтый / зеленый цвет в желудочки (правый) означает, изопротеренол сокращен APD80 и CaD80. Б. Пример начертаний APD80 и CaD80 от дикого типа мышь желудочков (вверху) и предсердий (внизу).

Обсуждение

В этом эксперименте мы изменили метод Langendorff перфузии, добавив небольшую трубку кремния, что особенно важно после подавления желудочковых сокращений с возбуждением-сжатия разобщающий агент. Трубки кремния используется для предотвращения заторов решение, подкисление перфузии раствора и развития ишемии в левый желудочек. Мышь сердце очень чувствительны к гипотермии, таким образом, колебания температуры через сердце приведет искусственного различия в длительности потенциала действия. Следовательно, система отопления была реализована в перфузионной камере, чтобы поддерживать постоянную температуру 37 ° С в течение полноту эксперимента ^8. Так как модель Langendorff не сохраняет иннервации сердца, необходимо рассмотреть вопрос о включении нейротрансмиттеров в перфузат с целью изучения физиологических симпатической и парасимпатической тон ^9. Кроме того ретроградной перфузии, добавление superfusion сердца помогает поддерживать подходящие параметры окружающей среды, таких как рН и температура. В этом методе, Langendorff перфузии сердце горизонтально расположенные. Вертикальной установки перфузии Langendorff также может быть использован ^10, но может привести к несколько иной сердечной механике ^11. В дополнение к CMOS-камер, альтернативных детекторов, также доступны и могут быть применены к карте V _м и кот одновременно ^12.

Применение камер CMOS высокой пространственно-временное разрешение обеспечивает точность записей, однако оптические сигналы отображение не из одной ячейки. Скорее, каждый флуоресцентный сигнал поступает из сотен или тысяч клеток, в зависимости от оптического увеличения. Гораздо больше желудочка флуоресценции может исказить предсердий сигналов оптического рассеяния, поэтому осторожной интерпретации оптически регистрируемых сигналов не требуется. Другим ограничением мыши препарата искажения сигнала и шума индуцированных кривизна поверхности из-за небольшого размера сердца ^13. Измерения скорости проведения могут быть изменены не только от кривизны мыши сердца, но и от полярности электрода и виртуальных электродов. Для достижения точности для скорости проведения, активизации анизотропии и реполяризации карт, правильная фокусировка камеры на поверхности сердца имеет важное значение.

В этом методе реального времени записи ЭКГ может дополнить оптического исследования сердечной электрофизиологии. Напряжение чувствительных красителя (RH237) и кальция индикатор (Rhod-2 утра) используются в протокол из-за их быстрой реакции, подобные возбуждения, и различные спектры излучения ^3,7. Существуют альтернативные комбинации красителей, которые могут быть использованы для измерения V _м и CaT кроме RH237 и Rhod-2 утра ^3. Роман напряжения чувствительной краситель, PGHI, с большим сдвигом Стокса (> 200 нм) был найден, чтобы лучше V _м и CaT сигналы из-за большего разделения длин волн излучения между PGHI и Rhod-2 утра ^14. Дальнейшее совершенствование может сосредоточиться на изучении новых флуоресцентных зондов, разработка новых детекторов изображений, а также усовершенствованное программное обеспечение для обработки изображений. Более высокое разрешение и новых оптических условий для 3D визуализации оптических отображение также важны будущие направления оптических отображение ^5.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Химический	Компания	Номер в каталоге
NaCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S271-1
CaCl 2 (2H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	C79-500
KCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S217-500
MgCl 2 (6H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	M33-500
NaH 2 PO 4 (H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S369-500
NaHCO 3	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S233-3
D-глюкозы	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	D16-1
Blebbistatin	Tocris Bioscience, Ellisville, MO	1760
RH237	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	S1109
Rhod-2 утра	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	R1244
Pluronic F127	Invitrogen, Карлсбад, Калифорния	P3000MP
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma, Сент-Луис, Миссури	D2650