Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Özet

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Özet

Fare kalbi, bu türün genetik mühendisliği için düşük maliyetli teknoloji varlığı nedeniyle kardiyovasküler çalışmalar için popüler bir model. Fare kalp Kardiyovasküler fizyolojik fenotipleme transmembran potansiyeli için çeşitli sondalar (V _m), kalsiyum transientler (CAT) ve diğer parametreler istihdam floresan görüntüleme kullanarak kolayca yapılabilir. Tahrik olma-daralma kaplin, aksiyon potansiyeli ve hücre içi kalsiyum dinamikleri ile karakterize edilir; bu ^nedenle, kalp 1-4 aynı yerden aynı _{anda V} m ve kedi Her iki harita derece önemli. Langendorff eş zamanlı optik haritalama perfüze fare kalpleri, kalp yetmezliği, aritmiler, metabolik hastalık ve diğer kalp hastalıklarının altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için bir potansiyele sahiptir. Aktivasyon Görselleştirme, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve sitelerin sayısız diğer parametreler hücresel düzeyde soruşturma elde edemez ama iyi optik haritalama ^1,5,6 tarafından çözüldü. Bu yazıda, state-of-the-art CMOS görüntüleme teknolojisi kullanarak yüksek alansal ve zamansal çözünürlüğe sahip fare kalplerinde V _m ve kedi aynı anda optik haritalama için enstrümantasyon kurulum ve deneysel koşullar mevcut Bu yöntem ile elde edilen tutarlı optik kayıtları Langendorff perfüze fare kalpleri eşzamanlı optik haritalama uygulanabilir ve güvenilir hem de göstermektedir.

Protokol

1. Gelişmiş stok çözümler hazırlanması

1. Tyrode çözümü (16x) iki stok çözelti deiyonize su önceden hazırlayın ve 4 saklayın ° C:
   1. Menkul Kıymetler (119,872 g / L NaCl, 3.056 g / L _CaCl 2 _{(2H 2} O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L _NaH 2 _PO 4, 3,408 g / L _MgCl 2 _{(6H 2} O), ( Fisher Bilimsel, Fair Lawn, NJ));
   2. Stok II (26,88 gr / L NaHCO3 (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
2. Floresan boyalar stok çözümleri hazırlayın. Tekrarlanan dondurma ve çözme önlemek için, -20 ° C, bir deney için yeterli hem de boyaların 30 ul alikotları depolamak:
   1. Gerilim duyarlı boya RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stok solüsyonu, 1.25 mg / ml dimetil sülfoksit (DMSO, Sigma, St Louis, MO);
   2. Kalsiyum göstergesi Rhod 02:00 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stok solüsyonu, DMSO içinde 1 mg / ml.
3. Önceden eksitasyon-kasılma uncoupler blebbistatin stok solüsyonu hazırlayın (Bioscience Tocris, St Louis, MO, DMSO içinde 2 mg / ml) ve 4 çözünmüş blebbistatin saklamak ° C

2. Perfüzyon çözümleri ve deney düzeneği ⁷ hazırlayın

4. Taze 2L Tyrode çözüm hazırlamak (128.2mM NaCl, 1.3mm CaCl ₂ (2H ₂ O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl ₂ (6H ₂ O), 1.19mM NaH ₂ PO _4, 20mm NaHCO ₃ 11.1mM D-glikoz deiyonize su, pH = 7.35 ± 0.05). Stok solüsyonu Tyrode çözümü Stok I Stok II, 125 ml, 125 ml (bir deney için yeterli) 1750 mL deiyonize su eklenir ve karıştırılır ve glikoz 4g 2L yapmak için kullanılan ediliyor.
5. Perfüzyon sistemleri iki pompa açın. 40 ml / dak retrograd perfüzyon için kullanılan peristaltik pompa (Peri-Star, TEFE, Sarasota, Amerika Birleşik Devletleri) ayarlayın. Superfusion için kullanılan diğer bir peristaltik pompa (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pompa L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) ayarlayın ve holding rezervuar 80 ml / dk 'ya perfüzat geri dönmek için.
6. Perfüzyon sistemi 2L deiyonize su ile, sonra 30 dakika ve% 70 etanol ile yıkayın.
7. Tyrode çözümü tüm deiyonize su sirkülasyonunu ve 5 mikron filtre (Millipore, Billerica, MA, ABD) üzerinden geçmek, oda tahliye. +37 Için perfüzat Sıcak ° C O ₂ / CO ₂ (% 95 /% 5) gaz köpüren bir çözüm içine bir su ceketi ve sirkülatör (ThermoNESLAB EX7, Newtown, ABD) ve oksijen perfüzat. PH metre (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) ile çözeltinin pH Monitör ve 7.35 ± 0,05 pH tutmak için O ₂ / CO ₂ köpüren hızını ayarlayabilirsiniz. Deney sırasında izleme pH ve sıcaklık devam edin.
8. Çift optik eşleme cihaz yüksek uzaysal (100x100 piksel, 230 ± piksel başına 20 mikron) ve temporal (1,000-3,000 kare / sn) çözünürlük iki MICAM Ultima-L CMOS kameralar (SciMedia, Costa Mesa, CA) oluşur. Fix kalsiyum görüntüleme kameranın önünde bir band geçiren filtre (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ); süre, uzun bir-pass filtre (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) yerleştirilmiş olması gerekir belirlenen gerilim görüntüleme kamera önünde. Kameralar dikroik ayna (635 nm kesme, Omega Optik, Brattleboro, VT) içeren bir tutucu, birbirlerine dik olarak düzenlenir. Çift kamera sahibi hemen altında kalp dikroik ayna üzerine gelen emisyon ışığı odaklanan bir lens (Nikon Nikkor 55 mm 1:1.4 235.052), yoktur. Çalışma mesafesi yaklaşık 3cm.
   Uyarma ışık, bir halojen lamba (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) tarafından oluşturulan ve ısı filtre, obtüratör ve bant geçiren filtre (520 ± 45 nm) geçirilir. Esnek bir ışık kılavuzu hazırlanması üzerine bant geçiren filtre ışık yönlendirir ve bir deklanşör hazırlık boyaların photobleaching önlemek için sadece görüntü alımı sırasında ışığa maruz olduğunu sağlamak için kullanılır.
9. Pacing ve algılama için önceden hazırlayın ve Ag / AgCl ₂ elektrot odasında kalp yerleştirmeden önce bunları yükleyin. Amplifikatörler ve filtreler uygun seviyelere ayarlanmış olduğundan emin olun.

3. , Fare kalp Hasat cannulate ve Langendorff perfüzyon kurdu

10. Ve intraperitoneal heparin (100 adet), ketamin / xylazine (ksilizin, 10 mg / kg ketamin, 80mg/kg vücut ağırlığı) ile fare anestezisi. Ağrı refleksi eksikliği ile uygun bir anestezi düzeyi sağlayın.
11. Orta sternal insizyon sonra, hızlı kalp kaldırmak ve (% 95 O _2,% 5 CO ₂₎ oksijenli yıkayın, sabit sıcaklığı (37 ± 1 ° C) Tyrode çözümü.
12. Diseksiyon mikroskop kullanarakAort hızla belirlemek ve sağ subklavian arter altında çıkan aortun boyunca temiz bir kesim yapmak. Aort kısa bir bölümü daha sonra özel bir bağlı alevlendi bir ucu ile 21 gauge kanül yaptı. 4-0 siyah örgülü ipek sütür (Cerrahi Uzmanlıkları Corporation, Reading, PA) kanül üzerine kalbi düzeltmek için kullanılır. Kanülasyon sonra, kalp retrograd perfüze ve Tyrode çözümü ile superfused. Bridge Amplifikatör TBM4M, TEFE, Sarasota, retrograd perfüzyon oranı aort basıncı 60 ile 80 mmHg (Basınç detektörler, Dünya hassas aletler Inc (TEFE), Sarasota, Amerika Birleşik Devletleri tutmak için 2-5 ml / dak aralığında ayarlanır. ABD).
13. Sonra kalp kanüle, akciğer, timus ve yağ dokusu disseke ve kaldırılır.
14. Izole kalp akışı bağlı hareket etmesini önlemek için perfüzyon odasının alt apeks (Sylgard kaplamalı) (Güzel Bilim Araçları) tutturulmuş. Sağ ve sol atriyal uzantıları da gergin ve kulakçıklar optik ölçümler için maksimum yüzey alanı sağlar odası, alt (Güzel Bilim Araçlar, Inc, Foster City, CA) tutturulmuş.
    Çok önemli! Küçük bir silikon tüp pulmoner venler ile sol ventrikül içine yerleştirilir ve yakındaki bağ dokusu ipek sütür ile sabittir. Bu çözüm tıkanıklık ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler ile ventriküler kasılmaları bastırılması sonra özellikle önemlidir (bkz. Bölüm 4 adımda 19) sol ventrikül, sıkışıp perfüzat asitlenme önler.
15. Master-8 (AMP Instruments Ltd, Kudüs, İsrail) veya PowerLab 26T (AD Instruments, Sidney, Avustralya) tarafından oluşturulan pacing uyarılara yapmak için yapılmış özel bir elektrod kalbin yüzeyine yerleştirilir.
16. Küçük bir kapak cam, titreşimli bir çözüm hareket artifakı azaltmak için kalp üzerinde çözüm yüzey üzerine monte edilmiştir.
17. Odak kalp ikaz ışığı. Buna ek olarak, çift kamera aparatı ve maksimum çözünürlük elde edilecek, böylece kalp arasındaki mesafeyi ayarlamak.
18. Odadaki tüm ışıkları kapatın ve elektrik kayıtları PowerLab 26T kullanarak başlamak.

4. Yük gerilimi ve kalsiyum duyarlı boyalar ve eksitasyon-kasılma uncoupler

19. Warm-up blebbistatin 0.6 ml. 0.5 mL holding rezervuar perfüzat blebbistatin karıştırın. Tyrode çözümü 1 mL blebbistatin kalan 0.1 mL seyreltilir ve kanül yakınında bulunan bir ilaç bağlantı noktası üzerinden yavaş yavaş (bir 20 dakikalık süre içinde) enjekte. Blebbistatin yavaş yavaş hareket artifakı azaltır gözlemleyin.
20. 1 ml Tyrode çözümü voltaj duyarlı boya RH237 stok solüsyonu 30 mcL sulandırınız ve yavaş yavaş blebbistatin aynı enjeksiyon portuna 5-7 dakika içinde enjekte.
21. 30 mcL kalsiyum göstergesi Rhod-02:00 1 ml Tyrode çözümü seyreltilir ve 5-10 dakika boyunca yavaş yavaş aynı enjeksiyon portu yoluyla uygulanan Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, DMSO% 20 çözüm) ile karıştırılır ve 1:1 .
22. Blebbistatin ve hücre zarı ve sitoplazmada ulaşmak için boyalar için 5-10 dakika bekleyin. Hareket tamamen bastırıldı protokol ile devam edin.
23. Sürekli bütün prosedür üzerinden monitörü EKG kayıtları, kalbin normal elektrik fonksiyonunu sağlamak.
24. SciMedia özel yazılım (SciMedia, Costa Mesa, CA) kullanılarak floresan sinyal kayıtları başlar.

5. Temsilcisi sonuçları:

Şekil 1 perfüzyon, elektrik kayıtları ve optik haritalama için deneysel kurulum.
EM = emisyon; Lp = longpass

Şekil 2 ventriküler pacing sırasında kaydedilen Deneysel hazırlama ve sinyal örnekleri. Sol: EKG sinyalleri ₂ Ag / AgCl disk elektrotlar (En İyi) ve S1S1 stimülasyon protokolü bir örnek gösterilmiştir (Alt) toplanan. Merkezi: Langendorff fare kalp hazırlanması. Sağ: optik Temsilcisi aksiyon potansiyelleri ve kulakçıklar (Üst) ve ventriküllerin (Alt) kalsiyum geçici sinyalleri gösterilmiştir. Sarı ok (Üst), atriyal kayıtlarında görülmektedir ventriküller, gelen floresan sinyal saçılma noktaları.
AG = sol ventrikül; RV = sağ ventrikül, LA = sol atriyum; RA = sağ atrium

Şekil 3 V _m ve vahşi bir tür fare kalp ventriküller Cat Temsilcisi optik kayıtlar. A. optik kayıtları (C) görülebilmektedir siyah noktalar işaretlenmiş eşit aralıklı yerlerden bir dizi deney hazırlık. B. Örnek dizi merkezi bir konuma V _m ve CAT (bkz. kutu izleme In (C)). C. V, eşit aralıklı yerlerden _dizi m (mavi) ve CAT (kırmızı) . Sinyaller 3x3 binned edildi.

Şekil 4 Etkinleştirme harita ve iletim. A. enine (T) ve beyaz oklarla gösterilen boyuna (L) yönden vahşi bir tür fare kalp bir örnek aktivasyon haritası. B. V _m sinyalleri (Üst) ve görülen üç puan dV / dt (Alt) karşılık gelen (T1, T2, T3, L1, L2, L3).

Şekil 5 Aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici süre analizi. % 80% 80 gevşeme (CaD80) repolarizasyon (APD80) ve kalsiyum geçici süresi A. Aksiyon potansiyeli süresi haritalar kontrol koşulları altında bir kalp (Sol) ve 30 nM isoproterenol uygulama (Sağ) sonra gösterilmiştir. Ventriküller yeşil / sarı renk (Sağ) kısaltılmış isoproterenol APD80 ve CaD80 gösterir. Vahşi tip fare ventriküllerin (Üst) ve kulakçıklar (Alt) APD80 ve CaD80 B. Örnek iz.

Tartışmalar

Bu deneyde bir eksitasyon-kasılma uncoupler ile ventriküler kontraksiyonlar bastırılması sonra çok önemli olan küçük bir silikon tüp ekleyerek Langendorff perfüzyon yöntemi değiştirilebilir. Silikon tüp çözüm tıkanıklığı, perfüzyon çözüm asitlenme, ve sol ventrikül iskemi gelişimini önlemek için kullanılır. Fare kalp hipotermi çok duyarlı, bu nedenle, kalp boyunca sıcaklık değişimleri aksiyon potansiyeli süresi suni farklılıklar neden olacaktır. Sonuç olarak, ısıtma sistemi, ^deney 8 tamamının sırasında 37 ° C sabit sıcaklıkta korumak için perfüzyon odasında hayata geçirildi . Langendorff modeli kalp innervasyon korumak olmadığından, fizyolojik, sempatik ve ^parasempatik 9 araştırmak için perfüzat nörotransmitterlerin ekleyerek dikkate almak gerekiyor . Retrograd perfüzyon yanı sıra, kalp superfusion ek, pH ve sıcaklık gibi uygun çevresel parametrelerin korumaya yardımcı olur. Bu yöntemde, Langendorff perfüze kalp yatay olarak yerleştirilmiştir. Dikey Langendorff perfüzyon kurulum ¹⁰ de kullanılıyor olabilir, ancak biraz daha farklı bir kardiyak mekaniği ¹¹ neden olabilir. CMOS kameraların yanı sıra, alternatif dedektörler de mevcuttur ve haritası V _m ve aynı anda CAT ¹² uygulanabilir.

Uygulama yüksek ayıklanmasıdır çözünürlüklü CMOS kameraların kayıtları doğruluğu garanti eder; ancak, optik haritalama sinyalleri tek bir hücre değildir. Aksine, her floresan sinyal optik büyütme bağlı olarak, yüzlerce ya da binlerce hücre geliyor. Çok daha büyük bir ventrikül floresan optik saçılma atriyal sinyallerini bozabilir, bu nedenle optik kaydedilen sinyalleri dikkatli yorumlanması gereklidir. Fare preparat başka bir sınırlama kalp ¹³ küçük boyutu nedeniyle yüzey eğriliği ile indüklenen sinyal bozulma ve gürültü. Iletim hızı ölçümleri sadece fare kalp eğriliği değil, aynı zamanda elektrot polarite ve sanal elektrotlar değişmiş olabilir. Iletim hızı, aktivasyon anizotropi ve repolarizasyon haritalar doğruluk elde etmek için, kalp yüzeyinde kamera odaklama düzeltmek şarttır.

Bu yöntemde, gerçek zamanlı EKG kayıtları, kardiyak elektrofizyoloji optik soruşturma tamamlayabilir. Gerilim duyarlı boya (RH237) ve kalsiyum göstergesi (Rhod 02:00) hızlı yanıt nedeniyle protokol, benzer uyarma, ve farklı emisyon spektrumları ^3,7 kullanılır. V _m ve CAT RH237 dışında ve Rhod-02:00 ³ ölçmek için kullanılan boyalar alternatif kombinasyonları vardır. Büyük bir Stoke vardiya (> 200 nm) ile bir gerilim romanı duyarlı boya, PGHI, çünkü PGHI ve Rhod-02:00 ¹⁴ arasında emisyon dalga boylarında büyük bir ayrılık daha _iyi V m ve CAT sinyalleri izin bulundu. Gelecek gelişmeler yeni flüoresan millerini, yeni görüntüleme dedektörleri gelişimi, ve geliştirilmiş görüntü işleme yazılımı üzerine odaklanabilir. Yüksek çözünürlük ve 3 boyutlu optik haritalama için yeni optik görüntüleme yöntemleri de optik ^haritalama 5 gelecekte önemli yön vardır .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimyasal	Şirket	Katalog Numarası
NaCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S271-1
CaCl 2 (2H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	C79-500
KCl	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S217-500
MgCl 2 (6H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	M33-500
NaH 2 PO 4 (H 2 O)	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S369-500
NaHCO 3	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	S233-3
D-glikoz	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ	D16-1
Blebbistatin	Bioscience Tocris Ellisville, MO	1760
RH237	Invitrogen, Carlsbad, CA	S1109
Rhod-02:00	Invitrogen, Carlsbad, CA	R1244
Pluronic F127	Invitrogen, Carlsbad, CA	P3000MP
Dimetil sulphoxide (DMSO)	Sigma, St Louis, MO	D2650