Humanos da artéria mamária interna (IMA) Transplante e implante de stent: um modelo humano para estudar o desenvolvimento de reestenose intra-stent

Resumo

Este vídeo mostra um modelo para estudar o desenvolvimento da hiperplasia intimal após a implantação stent utilizando um recipiente humano (IMA) em um modelo murino imunodeficientes.

Resumo

Estudos pré-clínicos em modelos de pesquisa in vivo para investigar os processos Pathobiological e fisiopatológico no desenvolvimento de hiperplasia da íntima após stent navio são cruciais para ^1,2 abordagens translacional.

Os modelos animais usados ​​incluem ratinhos, ratos, coelhos, e porcos ^3-5. No entanto, a tradução desses modelos em ambientes clínicos continua a ser difícil, uma vez que esses processos biológicos já estudados em vasos de animais, mas nunca realizada antes em modelos de pesquisa humanos ^6,7. Neste vídeo mostramos um novo modelo humanizado de colmatar esta lacuna de translação. O procedimento apresentado é reprodutível, fácil e rápido para executar e é adequado para estudar o desenvolvimento da hiperplasia intimal ea aplicabilidade dos stents diversas.

Este vídeo mostra como executar a técnica de stent em vasos humanos seguidos por transplantes em ratos imunodeficientes, eidentifica a origem das células em proliferação como humana.

Protocolo

1. Artéria mamária interna Preparação (IMA)

1. O endotélio arterial é desnudada pela passagem de uma 2-francês cateter de embolectomia Fogarty arterial (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EUA). O cateter é puxado através de todo o comprimento do vaso duas vezes para garantir o dano endotelial.
2. Use qualquer stent humana de comprimento de 8 mm e 2,5 milímetros-3 milímetros de diâmetro (por exemplo, Translumina, Yukon stent). CUIDADO: O diâmetro do stent não deve exceder o diâmetro do vaso por mais de 10% para evitar a estenose pré e pós-stent. CUIDADO: Não ligue o comprimento do stent dentro do mesmo estudo.
3. Implantar o stent usando a pressão do balão adequado (o que é observado na embalagem stent) para atingir o diâmetro desejado.
4. Loja stent IMA em 4 ° C RPMI + heparina (500 IE/10 ml) em gelo até ao transplante.

2. Preparação dos animais

RNU Nude (Crl: NIH-Foxn1rnu) ratos (300-350 g) são housed em condições convencionais em scantainer ventilados armários, alimentado com ração e água libidum anúncio autoclavado.

1. Anestesiar ratos com isoflurano (2,5-3%), utilizando uma câmara de indução.
2. Raspar o cabelo abdominal e coloque o rato sobre as suas costas e colocar uma máscara sobre o nariz ea boca para manter a anestesia.
3. Desinfetar a área abdominal amplamente usando Provo iodo, o uso de etanol próxima a 80% - repetir esta etapa duas vezes. Verifique reflexos beliscar as patas traseiras para ter a certeza que o rato é suficiente anestesiados.
4. Sob visão microscópica, realizar uma laparotomia mediana superior para expor a aorta abdominal infra-renal.
5. Coloque os intestinos em uma luva de solução salina hidratada. Dobrar a luva em torno dos intestinos para evitar a perda de humidade.
6. Dissecar a aorta na região infra-à bifurcação, não cuidadosamente para causar danos nos ramos dos vasos.
7. Use grampos micro para parar o fluxo sanguíneo na aorta. Colocar obraçadeira proximal primeiro, seguido pelo grampo distai.
8. Remover um aplicativo. 0,5-0,7 segmento da aorta mm e lavar restante da aorta com heparina (200 unidades).
9. Leve o IMA stent e encurtar a duração adequada e posicioná-lo na abertura.
10. Ligue o IMA para a aorta destinatário, executando suturas usando 8-0 Prolene sutura (Ethicon, Norderstedt, Alemanha).
11. Com cuidado, abra o grampo primeiro craniano e, em seguida, o grampo caudal.
12. Deve haver um pulso visível na IMA transplantado e na extremidade distai da aorta.
13. Coloque os intestinos de volta para o abdômen.
14. Lave o abdômen com pré-aquecido salina estéril.
15. Feche a camada muscular da parede abdominal com prolene 6-0 sutura (Ethicon, Norderstedt, Alemanha).
16. Enquanto o rato é ainda em anestesia, injectar Carprofeno mg / kg por via subcutânea 4-5.
17. Administrar analgesia pós-operatória como adequado (por exemplo, carprofeno ou Meloxicam) durante 3 dias pós Surgery.

3. Os resultados representativos

Para exame histológico, os espécimes foram fixados em formalina a 4%, desidratado em uma série graduada de álcool, e se infiltrou em uma mistura (MMA I) de metacrilato de metilo 80% e 20% de ftalato de dibutilo durante 1 dia, MMA I com 1% de peróxido de benzoílo seco para 1 dia, e MMA I com peróxido de benzoílo 3% seco (MMA III) durante 1-2 dias a 4 ° C. Em seguida, os espécimes foram polimerizados em fresco MMA III em frascos de vidro em um banho de água sobre uma base de pré-polimerizado. Polimerização lento foi conseguido mantendo os frascos a 26 ° C durante a noite, aumentando a temperatura para 28 ° C, na manhã seguinte, e em seguida aumentando a temperatura gradualmente por 0,5 ° C ao longo de 12 h até a polimerização ocorreu. Os blocos foram seccionados polimerizados em 5 uM espessura utilizando um micrótomo microM HM 360 equipado com uma faca de metal duro.

Para identificar a origem das células em proliferação (Figura 1), slides foram coradas com anticorpos para identificar tanto o verde de rato de proteína (GFP) ou fluorescente MHC-I e células musculares lisas. Para estes estudos, humano IMA foi incubada com o gene repórter da GFP durante a noite usando partículas lentivirais para a transdução estável de células IMA. Células-filhas que dividem de origem humana pode ser identificado por expressando GFP. Após a desparafinização, induzida pelo calor epítopo de recuperação é realizada por aquecimento das lâminas em solução de antigénio de recuperação usando um vaporizador. A Imagem-iT FX sinal potenciador pode ser usado para o passo de bloqueio. Células de origem humana são identificados usando os anticorpos monoclonais de ratinho contra a GFP (1:100 diluído em diluente de anticorpo primário (Dako)), e ainda mais marcada com cabra-anti-IgG de ratinho, Alexa Fluor 488 (1:1000 diluído em diluente de anticorpo secundário ). As células do músculo liso foram marcados com o coelho músculo liso anti-polycolonal α-actina (1:100 diluído em diluente de anticorpo primário), seguido por cabra-anti-IgG de coelho, Alexa Fluor 555 (1:1000 diluído em diluentes anticorpo secundário). Cada passo de incubação do anticorpo é realizado a 37 ° C durante 1 hora com PBS três vezes lavagem entre os dois. Os núcleos são coradas com DAPI durante 10 minutos. Após a montagem dos slides usando Prolongar reagente Antifade ouro, as amostras foram analisadas em microscopia confocal.

Figura 1. As células neointimal como células musculares lisas A:. Verde = anti GFP, marcação das células de origem humana; vermelho = anti actina de células humanas da musculatura lisa; azul = DAPI, identificando os núcleos das células B: Verde = rato anti MHC-I, rotulagem células de origem rato; vermelho = anti actina de células humanas da musculatura lisa; azul = DAPI, identificando os núcleos das células. As células em proliferação são identificados como células musculares lisas e positivas para GFP, mas negativa para o rato molécula de MHC-I. Portanto, as células em proliferação são de origem humana.

Discussão

Embora diferentes em modelos de pesquisa in vivo são existentes para investigar o desenvolvimento da hiperplasia intimal após a colocação do stent, estes modelos ainda enfrentam obstáculos de translação de superar. Além disso, os modelos animais de grande porte são as condições de habitação caros e especiais, bem como equipamento cirúrgico não está disponível para todos os laboratórios.

Usando um IMA humano para estudar o desenvolvimento da prolif...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
2 cateter de Fogarty francês	Baxter Healthcare, Deerfield, IL, EUA	120602F
Yukon Stent	Translumina GmbH, Hechingen, Alemanha		Use o stent de sua escolha de acordo com o protocolo do estudo
Meio RPMI	Biochrom	Nr.F1275
heparina	Baxter	2B0953
isoflurano	Abade	B506
Provo Iodo-	Betadine Puredue Pharma	EAN: 5995327165830
80% etanol	Geyer	ETV 80/0500
Micro pinça	Harvard Apparatus	PY2-61-0186
Suturas 8-0	Johnson & Johnson,	2808G
Suturas 6-0	Johnson & Johnson,	1698 H
Carprofeno	Vet Feizer	PZN: 0110208
Metamizol	Ratiopharm
Solução alvo de recuperação, pH9	Dako	S2368
Imagem-iT FX sinal potenciador	Invitrogen	I36933
rato anticorpo anti-GFP monoclonal	Cores vivas BD	632381
diluente anticorpo primário	Dako	S3022
cabra-anti-IgG de ratinho, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017
diluente anticorpo secundário	Dako	S0809
coelho anti-músculo liso polycolonal α-actina	Abcam,	ab5694
cabra anti-IgG de coelho, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21430
Prolongar reagente Antifade Ouro	Invitrogen	P36930