Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Resumo

Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de lípidos ^1,2, Extrusão de lipossomas, e caracterização do tamanho será aqui contidas.

Resumo

Os lipossomas são vesículas preparadas artificialmente constituídos por fosfolípidos naturais e sintéticos que são amplamente utilizados como uma membrana celular imitando plataforma para estudar proteína-proteína e proteína-lípido interacções ^3, o monitor de entrega de drogas ^4,5, e de encapsulamento ^4. Fosfolípidos naturalmente criar bicamadas lipídicas curvos, distinguindo-se a partir de uma micela. ⁶ Os lipossomas são tradicionalmente classificados por tamanho e número de bicamadas, ou seja, grandes vesículas unilamelares (LUV), pequenas vesículas unilamelares (SUVs) e vesículas multilamelares (MLV) ^7. Em particular, a preparação de lipossomas homogéneos de vários tamanhos é importante para o estudo de curvatura da membrana que desempenha um papel vital na sinalização celular, endo e exocitose, a fusão da membrana, e tráfico proteína ^8. Vários grupos analisar como as proteínas são usadas para modular processos que envolvem a curvatura da membrana e, assim, preparar lipossomas de diâmetros <100 - 400nm para estudar seu comportamento em funções celulares ^3. Outros concentram-se em lipossoma-droga de encapsulação, estudando os lipossomas como veículos para transportar e distribuir uma droga de interesse ^9. Encapsulação do fármaco pode ser conseguida como relatado durante a formação do lipossoma ^9. O nosso passo de extrusão não deve afectar o fármaco encapsulado por duas razões, ou seja, o encapsulamento da droga (1) deve ser alcançado antes de este passo e (2) lipossomas devem manter a sua estabilidade natural biofísica, de forma segura realização da droga no núcleo aquoso. Estes objetivos da pesquisa sugerem ainda a necessidade de um método otimizado para projetar estáveis ​​vesículas mícron sub-lipídicos.

No entanto, as actuais tecnologias de preparação de lipossomas (sonicação ^10, congelamento-descongelamento ^e-10, sedimentação) não permitem a preparação de lipossomas com a superfície altamente curvo (isto é, <diâmetro de 100 nm) com elevada consistência e eficácia ^10,5, o que limita a biofísica estudos de um EMERGIcampo ng de detecção de curvatura da membrana. Aqui, nós apresentamos um método de preparação sólida para uma variedade de lipossomas biologicamente relevantes.

Extrusão manual, utilizando gás-apertados seringas e membranas de policarbonato ^10,5 é uma prática comum, mas heterogeneidade é frequentemente observado quando se utiliza tamanhos de poro inferior a 100 nm devido à devido à variabilidade de pressão manual aplicada. Foram utilizados um aparelho de extrusão de pressão constante controlada para preparar lipossomas sintéticos cujos diâmetros variam entre 30 e 400 nm. Dispersão dinâmica de luz (DLS) ^{10, 11} e microscopia de electrões análise de nanopartículas de seguimento (NTA) ¹² foram utilizados para quantificar os tamanhos de lipossomas, tal como descrito no nosso protocolo, com poliestireno comercial (PS) pérolas utilizadas como um padrão de calibração. Uma correlação linear perto foi observada entre os tamanhos dos poros e trabalhadores dos lipossomas determinados experimentalmente, indicando alta fidelidade da nossa preparação pressão controlada lipossoma conhecihod. Além disso, mostrámos que este método de preparação de vesículas de lípidos é geralmente aplicável, independente de vários tamanhos de lipossomas. Por fim, também têm demonstrado em um estudo curso de tempo que estes lipossomas preparados foram estáveis ​​durante até 16 horas. Um representante de tamanho nano protocolo de preparação de lipossomas é demonstrado abaixo.

Protocolo

1. Preparação de lipossomas

1. Recuperar a 20 mL frasco de vidro com tampa de teflon.
2. Limpar todo o material de vidro e seringas com clorofórmio antes de usar para evitar a contaminação.
3. Transferir 100 uL de clorofórmio grau de reagente para o frasco de vidro usando uma seringa de vidro de 250 uL estanque ao ar.
4. Adicionar 30 ul de metanol de grau reagente para o frasco de vidro mesmo usando uma seringa de vidro de 100 uL estanque ao ar.
5. Para preparar um 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolamina (POPE): solução lipídica colesterol, transferir 216 uL de 10 mg / POPC mL, 42 uL de 10 uL mg / mL POPE e 20, de 11 mg / mL As soluções de colesterol _em CHCI3 para o frasco de vidro de 20 ml.
6. Evapora-se os solventes orgânicos, utilizando-lento fluxo de árgon ou de azoto gasoso até uma película fina de lípidos é observado no fundo do frasco.
7. Colocar o frasco de vidro não nivelada num exsicador de vácuo durante pelo menos 30 minutos para remover o solvente residual.
8. Transfer 2 mL de tampão, previamente passados ​​através de um filtro de 0,2 micron, para o frasco de vidro para hidratar os lípidos.
9. Incubar a mistura a 4 ° C durante a noite e utilizar dentro de 48 horas.

2. Congelar e descongelar-: Para tamanhos de lipossomas 30 - 100 nm Apenas

1. Congelar suspensão de lipossomas em azoto líquido durante 15 segundos.
2. Descongelar suspensão de lipossomas utilizando um bloco de aquecimento a 42 ° C de temperatura para ~ 3 minutos.
3. Repetir os passos 2.1 e 2.2 para um total de 5 ciclos.

3. Extrusão

Siga as instruções corretamente Avestin para montar a extrusora LF-50 Liposofast, usando o contorno instrumento em seu livro-guia.

1. Colocar o suporte de tela grande furo (com furos circulares) na base de suporte do filtro, seguido pelo prato circular sinterizado (sem buracos), um disco de drenagem (25 mm de diâmetro), e uma membrana de policarbonato (25 mm de diâmetro).
2. Coloque o pequeno, pretoO-ring no topo da membrana para fixá-lo para a base de suporte do filtro.
3. Fixe a extrusora superior filtro apertando 4 parafusos nos 4 furos correspondentes.
4. Montar a unidade de filtro para o extrusor por baixo do tambor da extrusora grande. Adicionar a solução de lipossomas para o tambor do cilindro. Coloque o seguinte no topo do barril de extrusão na ordem: circular grande O-ring, tampão estreito, circular grande O-ring, tampão circular.
5. Fixe o regulador de gás ao topo barril da extrusora e fechar todas as válvulas para evitar fugas de ar, incluindo a válvula de alívio de pressão. Coloque um frasco de vidro de 20 mL ou 50 mL Erlenmeyer sob a unidade de filtro extrusora. Uma válvula de segurança está ligado ao regulador e irá libertar se a pressão excede 600 psi. Ligue o gás de azoto e abrir a válvula de gás ligada à extrusora.
6. Aumente a pressão de nitrogênio a 25 psi para 400 nm lipossomas, 125 psi para 100 nm, lipossomas e psi 400-500 para 30 nm lipossomas.
7. Assista ao susp lipossomasension como se ejecta para dentro do recipiente enquanto está a ser empurrado pelo azoto. Mantenha o fluxo de nitrogênio até deixar de observar qualquer líquido que passa através do filtro de extrusora para dentro do frasco de vidro.

4. Dinâmica de espalhamento de luz Analysis (DLS)

1. Preparar 50 uL de uma solução 20 mM de lipossomas.
2. Ligue o fonte de alimentação e da fonte de luz.
3. Abra o software DynaPro.
4. Defina o software para o modelo de algoritmo MS / X para detectar lipossomas de 30 nm e 100 nm e MS800 modelo algoritmo para detectar> 100 nm lipossomas.
5. Conecte-se ao hardware.
6. Pipete 14 da amostra de lipossomas na cuvete de quartzo e de inserção no suporte de célula.
7. Pressione o botão start.
8. Pressione parar após ~ 20 - 30 aquisições.
9. Analisar os picos médios de diâmetro de lipossomas gravados no histograma.

5. Análise de nanopartículas Tracking (NTA)

1. Prepara-se uma uL 500, 0,1 mM de lipossomassolução.
2. Lavar o compartimento da amostra com água e etanol.
3. Seque o compartimento de amostra com uma toalha de papel que não solte fiapos.
4. Ligar a fonte de energia laser e do computador.
5. Entregar 300 uL de solução 0,1 mM de lipossomas para o compartimento da amostra.
6. Abra o controle da temperatura e da nanopartícula software Análise Tracking.
7. Pressione Capturar botão para ligar o laser.
8. Use os ajustamentos horizontais e verticais para mover o estágio e ajustar a focagem do microscópio.
9. Ajustar a temperatura desejada (20 ° C) e tempo de gravação (pelo menos 30 segundos).
10. Pressione o botão Record para tirar várias molduras das partículas de lipossomas para um período de tempo especificado. Analisar os picos correspondentes aos diâmetros de lipossomas no histograma em que controla o movimento de cada partícula.

6. Os resultados representativos

Um esquema que define o método de extrusão é pressentia na Figura 1. Para obter resultados óptimos, a preparação de lipossomas com diâmetros de 30 nm requer uma elevada pressão de ~ 500 psi e diâmetros de 100 nm requer uma pressão de 125 psi para alcançar uma taxa rápida de filtro. Para diâmetros de 400 nm, uma baixa pressão de 25 psi ~ é recomendado para alcançar uma taxa mais lenta de filtro, que permite que as vesículas para alongar e formar lipossomas maiores, homogéneos. Realizamos uma série de experimentos para determinar a pressão ideal para a produção consistentes tamanhos micro-sub vesícula. Nós variou a pressão, bem como o número de extrusão passa através de filtros de policarbonato com poros de dimensão 30, 100, e 400 nm e descobriu pressão adequada para cada tamanho desejado. Por 30 poros nm, a pressão abaixo de 500 psi irá reduzir a taxa de fluxo, causando alongamento e tamanhos de vesículas, assim, de maiores dimensões. Para 100 nm poros, um fluxo constante foi realizada em 125 psi. Para 400 nm poros, de baixa pressão (25 psi) permite que as vesículas para alongar em maior vesícula sizes. Um fluxo de filtração lenta gota a gota, é ideal para criar maior sub-micron vesículas ^13.

Realizou-DLS para determinar os tamanhos de lipossomas extrudida através de três tamanhos de diâmetros diferentes, ou seja, 30, 100 e 400 nm. DLS é um método estabelecido que recolhe a luz dispersa para determinar o diâmetro da partícula. Nós, os extrudados lipossomas hidratados de 2 mm através de uma membrana de policarbonato 30 nm a 500 psi com 5 passa através do poro do filtro; uma membrana de policarbonato de 100 nm a 125 psi com 5 passa através do poro do filtro e uma membrana de policarbonato de 400 nm a 25 psi com 2 passa através do poro do filtro. Os diâmetros dos lipossomas e medidos por DLS para 30, 100 e 400 nm tamanhos de poros foram de 66 ± 28, 138 ± 18 e 360 ± 25 nm (Figura 2). Uma suspensão de 50 pérolas de poliestireno nm foi utilizado como um padrão de calibração, como mostrado na Figura 2, onde se registado um diâmetro de 47 ± 16 nm. O polydispe por centorsity mostra que não há sobreposição dentro de tamanhos de lipossomas. É típico de observar diâmetros superiores a 30 nm quando se utiliza DLS análise devido ao viés conhecido este instrumento tem para partículas maiores ^{de 12.} Intensidades de dispersão da luz de partículas grandes e pequenas são recolhidos simultaneamente a partir de um método de detecção e, portanto, mais difícil de resolver os lipossomas em suspensão ^12. Apesar desta limitação instrumental, a curva de calibração descreve uma correlação quase linear.

NTA é uma nova tecnologia que mede o tamanho de cada partícula a partir de observações directas de difusão em um meio líquido, independente do índice de refracção das partículas ou densidade. Esta técnica de alta resolução pode ser usado para completar a medição de lipossomas com DLS. A NTA registada diâmetros de 95 ± 48 e 356 ± 51 nm, duas 100 nm e 400 nm soluções de poliestireno foram utilizados para a calibração. Soluções lipídicas de 30 nm e 100 nm foram observados ter uma mais comp diâmetro arável em relação aos DLS como mostrado na Figura 3, produzindo tamanhos médios de 29 ± 14, 95 ± 17 e 359 ± 73 nm. A NTA pode ser uma técnica de caracterização mais geral para quantificar as partículas microscópicas, desde a sua sensibilidade lhe permite medir as partículas de 50 - 1000 nm. A curva de calibração mostra uma correlação linear entre os poros da membrana de policarbonato, versus o diâmetro NTA gravada.

Tamanhos lipossomas	Limiar de detecção	Tamanho da Partícula esperado mínima (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabela 1. Parâmetros NanoSight.

ad/4151/4151fig1.jpg "/>
Figura 1. Gráfico de fluxo do método de extrusão, que descreve como a pressão eo fluxo de azoto controla a homogeneidade de diferentes diâmetros de lipossomas. Após a hidratação lipossoma, vesículas unilamelares de diferentes tamanhos são extrudidas através de diferentes policarbonato poros da membrana de filtro em diferentes pressões.

Figura 2. Dinâmicos espalhamento de luz (DLS) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas quantitativos seguintes extrusão. (A) Os gráficos de barras são mostrados para descrever os diâmetros das três amostras de lipossomas. Um padrão de calibração de 50 nm de poliestireno (PS) pérolas foi utilizado como uma referência. Os diâmetros médios de lipossomas são indicados acima da barra para cada amostra. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro gravado por DLS. Embora os 30 nm e 100 nm de registo tamanhosed valores superiores do que os seus tamanhos de poros, enquanto o tamanho maior nm 400 gravado um tamanho ligeiramente menor, a curva de calibração (b) mostra uma correlação quase linear, em que o eixo x expressa os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato, eo eixo y descreve o gravado diâmetro lipossoma por DLS.

Figura 3. Nanopartículas de Rastreamento de Análise (NTA) dados que descrevem os tamanhos de lipossomas após a extrusão. (A) Os gráficos de barras representam o diâmetro de cada amostra de lipossoma. O eixo x descreve os tamanhos dos poros dos quais as soluções foram extrudida através de. O eixo y descreve o diâmetro de tamanho gravado pelo NTA. Os diâmetros médios de lipossomas são rotulados por cima de cada amostra. (B) A curva de calibração NTA mostra uma correlação mais linear do que a curva de calibração DLS entre os tamanhos dos poros da membrana de filtro versus o diâmetro gravada. O eixo x descreve os tamanhos dos poros da membrana de policarbonato. O eixo y descreve o diâmetro gravada lipossoma por NTA.

Figura 4. Negativas mancha de transmissão de electrões de microscopia (TEM) mostrando imagens cada tamanho de lipossoma (500 uM), seguido por extrusão. Grelhas de carbono Formvar malha foram negativamente descarregada antes da coloração da amostra, onde acetato de uranilo 1% em água foi utilizado para corar as amostras antes da secagem e de imagem em 34.000 ampliação ×. Tamanhos 30, 100, e 400 nm são claramente distintas umas das outras. A ampliação foi definida a 25.000 ×. A barra de escala representa 0,5 micron.

Figura 5. Uma experiência de tempo-curso foi realizado com três tamanhos de lipossomas. Dispersão dinâmica de luz (DLS) foi medido para cada solução de lipossoma de extrusão imediatamente a seguir. Todas as soluções de lipossomas foram armazenados em 4 °C durante a noite. Seus diâmetros foram registados pelos DLS após uma incubação durante a noite. Pouca ou nenhuma alteração foi observada após um período de incubação de 16 horas.

Discussão

Usando o Avestin Liposofast Extrusor LF-50, foi demonstrado como pequeno porte, lipossomas sintéticos são preparados através de um sistema de pressão controlada. É importante notar que as vesículas multilamelares formam-se espontaneamente após a hidratação de lipossomas, que pode levar à produção de nanopartículas menores. Estas pequenas vesículas multilamelares inevitavelmente fluir através do maior tamanho dos poros da membrana de policarbonato, causando heterogeneidade em soluções de vesículas unila...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	02432-25ML	Os estabilizadores 95%
Metanol de grau elevado	Sigma-Aldrich	179.337-4L
Extrusora LF-50 Liposofast	Avestin, Inc.
Fosfolipídios	Avanti Polar Lipids
Os poros de policarbonato	Avestin, Inc.		25 mm de diâmetro
Escorra discos PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm de diâmetro