Preparação Técnica Multi-passo para recuperar várias classes compostas metabólito para em profundidade e análise metabolômica Informativo

Resumo

A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse.

Resumo

Metabolomics é uma área emergente que permite perfis de amostras a partir de organismos vivos, a fim de obter uma visão sobre processos biológicos. Um aspecto vital da metabolômica é a preparação da amostra em que técnicas inconsistentes gerar resultados não confiáveis. Esta técnica envolve a precipitação de proteínas, a extracção líquido-líquido, e de extracção em fase sólida como um meio de fraccionamento de metabolitos em quatro grupos distintos. Melhoria enriquecimento de moléculas de baixa abundância, com conseqüente aumento na sensibilidade é obtida, e, finalmente, resulta em uma identificação mais confiante de moléculas. Esta técnica tem sido aplicada ao plasma, lavado bronco-alveolar, e amostras de líquido cefalorraquidiano com volumes tão baixos quanto 50 ul. As amostras podem ser utilizados para várias aplicações, a jusante; por exemplo, o sedimento resultante da precipitação de proteína pode ser armazenada para posterior análise. O sobrenadante do passo que sofre de extracção líquido-líquido usandoágua e solvente orgânico forte para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Uma vez fracionado, a camada hidrofílica pode ser processado para posterior análise ou descartados se não for necessário. A fracção hidrofóbica é ainda tratada com uma série de solventes, durante três passos de extracção em fase sólida para o separam em ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. Isto permite que o técnico a flexibilidade para escolher qual a classe de compostos é a preferida para análise. Ela também ajuda na identificação metabólito mais confiável, já que existe algum conhecimento da classe química.

Introdução

As reacções biológicas gerar metabólitos como produtos finais de processos celulares. Metabolomics é uma coleção de todos os compostos presentes no organismo, como resultado desses processos. Ele fornece uma imagem da fisiologia das células e reflete a resposta de um organismo a estímulos externos ou internos ^{1, 2.} Esses estímulos podem ser ambientais, toxicológicos, farmacológicos, dietética, hormonal, ou relacionados à doença. Muitas aplicações metabolômica têm e estão actualmente a ser estudada por pesquisadores e incluem descoberta de biomarcadores ^3, estudos de nutrição ^4, ciência dos alimentos ⁵ e testes de drogas ^6. Independentemente da aplicação, as variações nos dados, contaminação e presença de falsos positivos têm de ser reduzidas ou, de preferência removido. Na descoberta de biomarcadores ou, no caso de se determinar as diferenças entre um controlo e um grupo de doenças, ou de investigação dos efeitos de drogas em indivíduos, um f biológicaLUID é escolhido com base nas perguntas que estão sendo feitas e os tipos de metabólitos sendo investigado ^7. Por exemplo, se a estudar os efeitos imediatos de uma droga inalada nos pulmões de asmáticos, em seguida, explorar metabólitos em lavado broncoalveolar de líquidos (LBA) amostras, antes e após a administração seria preferencial. Para garantir que observadas diferenças são devido à variação biológica real em vez de amostra inadequada técnica de preparação, protocolo laboratorial padronizada e consistente é essencial ^8. Informações da amostra deve ser cuidadosamente documentadas para garantir que variáveis ​​como fluido biológico, a estirpe animal, tempo de amostragem, idade sujeito, sexo, só para citar alguns, são todos considerados e tidos em conta no estudo ^9. Além disso, para reduzir a possibilidade de contaminação ou de falsos positivos, recomenda-se que os esboços de solventes e espaços em branco do instrumento ser analisado ^10.

Para este protocolo, o termo "metabolismolites "será usado para referir-se os compostos identificados reais. Usando o software de fornecedor, um algoritmo inicial pico constatação é usado para detectar picos do espectro de massa. Estes picos estão alinhados com base na massa-para-carga razão (m / z) e tempo de retenção. Um segundo algoritmo é então usado para combinar múltiplas funções num único composto. Isso inclui características tais como sódio, potássio, amónio ou adutos no modo de ionização positivo, e cloreto de no modo de ião negativo. Opções adicionais do software incluem recursos como dímeros e outros adutos. Utilizando a glicose como um exemplo, com picos a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + _NH4), e 203,05261 m / z (M + Na), haveria três picos correspondentes ao mesmo composto com o primeiro algoritmo. No entanto, quando o segundo algoritmo, que se baseia na fórmula molecular, é aplicada nestes três adutos tornar agrupados em conjunto, resultando em um composto.

Metabólitos podem causar interferências no samples devido à complexidade dos compostos presentes. A presença de milhares de metabólitos em uma amostra causas sinalizar supressão particularmente dos metabólitos menor abundância. Exemplo de limpeza para remover proteínas interferentes, e subsequente separação em várias fracções reduz a complexidade da amostra, melhorando assim a separação de pico, aumentando a resolução, e reduzindo metabolito co-eluição. Portanto, é necessária a limpeza da amostra e uma melhor separação dos compostos. Demonstrou-se que a precipitação da proteína por si só, mesmo com o uso de vários solventes de polaridade, não é possível resolver este problema ^{11, 12.} No entanto, através da combinação de um solvente orgânico forte, tal como o MTBE com um passo de fraccionamento subsequente, a cobertura de metabolito é aumentada. ¹² Yang et al. Relataram um aumento nos metabólitos de 1.851 ou 2.073 com metanol ou sozinho precipitação metanol-etanol, respectivamente, para 3.806 metabólitos utilizando MTBE combinado extração por solventeseguido de extracção em fase sólida (SPE) passos. Reduzido sobreposição metabolito, melhor separação de pico e aumento da abundância metabolito foi observada com este método.

Contaminação de não-metabólitos, tais como polímeros, pode ser resultado de coleta de amostras, solventes ou ruído do instrumento, e pode resultar em supressão do sinal de metabólitos potencialmente significativas. Recomenda-se que o técnico (s) e aqueles que recolhem as amostras antes da preparação da amostra usar consistentemente a mesma marca, tipo e tamanho de frascos de coleta de amostras, pontas para pipetas e quaisquer outros tubos utilizados durante a coleta e preparação das amostras. Isso permite que o analista de dados para ter plena confiança de que as mudanças observadas são reais e não devido a diferenças de fundo de outras fontes. Eficácia do tratamento, as variações entre grupos de doenças e controle, ou quaisquer outras análises metabólicas então pode ser investigado com maior confiança.

A metanfetaminaod discutido aqui se concentra na combinação de métodos de preparação de amostras ^13-15, que podem ser aplicadas a plasma, LBA, ou amostras para profiling metabolomic não-alvo de espectrometria de cromatografia de massa líquida (LCMS) análise com base no líquido cefalorraquidiano (LCR). Tanto a cromatografia líquida (CL) e cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC) técnicas de separação pode ser acoplado a MS subsequente a este procedimento. Muitos pesquisadores realizando estudos metabolômica usar uma técnica de precipitação de proteínas e / ou uma técnica de extração líquido-líquido ^{16, 17.} Nos nossos estudos, o que resultou em menos metabolitos ser detectado. O método descrito aqui ¹² permite a detecção e identificação de um maior número de metabolitos, abrangendo uma vasta gama do metaboloma. Este aumento é devido à maior pureza das amostras e os efeitos da matriz reduzidas provocadas pela separação anterior das classes de metabolitos.

Um prot inicialein passo de precipitação é realizada utilizando-se metanol frio (MeOH) para remover a proteína da amostra. Extracção líquido-líquido (LLE) usando éter metil-terc-butílico (MTBE) e água é usada para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Em seguida, a extracção em fase sólida (SPE), é realizado na camada hidrofóbica para separar os compostos hidrofóbicos em três classes - ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. As fracções hidrofóbicas são reconstituídos em 100% de metanol, enquanto que a fracção hidrófila é reconstituída em 5% de acetonitrilo em água. A extracção (SPE)-passo em fase sólida proporciona um nível adicional de confiança nos resultados, reduzindo o número de compostos coeluting que seria de outro modo estar presentes tinham um passo de separação não foi realizada.

Protocolo

1. Considerações Iniciais, Preparação dos instrumentos e normas

1. Sempre use vidro para armazenar (tubos de cultura de vidro, frascos do amostrador automático de vidro) ou transferir (pipetas de vidro) lipídios e solventes orgânicos.
2. Minimize a exposição de todas as amostras de lipídios e as normas para o ar. Politetrafluoretileno Seal (PFTE) tampas hermeticamente para evitar a exposição ao ar e evaporação. Ressuspender Imediatamente lipídios secas na próxima solvente ou mantê-los em um fluxo constante de nitrogênio.
3. Utilizar 100 ul de amostra. Nos casos em que mais (ou menos) de uma amostra está disponível, ajustar os volumes em conformidade. No entanto, durante o fraccionamento de lípidos na coluna _NH2 SPE, afirmou volumes devem permanecer como indicado.
4. Ligue centrífuga e ajustada para 0 ° C antes do início da preparação da amostra.
5. Esta técnica utiliza muitos solventes voláteis de modo a manter todos os solventes tampadas durante a preparação da amostra.
6. Prepare dois tipos de normas por recomendação.
7. Prepare um controle negativo composto de tudo cravado em padrões de concentração constante. Este é cravado em todas as amostras, assim como uma amostra combinada, que é usado como um lote QC (amostra colectiva cravado utilizado para monitorar amostra preparação reprodutibilidade em dias separados) e instrumento QC (cravado amostras reunidas anteriormente preparado, sub-fraccionados, e usado para monitorar instrumento condições / flutuações durante a análise e em dias separados).
   1. Preparar controles positivos em 1x, 2x, 4x e picos padrão. Os controlos positivos são adicionados a todas as amostras, assim como uma amostra de plasma reunidas e são utilizados como compostos de controlo de qualidade para ambos os passos da preparação da amostra e análise instrumental passos para analisar e identificar as diferenças de mudança de dobragem durante a análise dos dados para garantir que todos os aspectos da preparação e análise instrumental foi realizada corretamente.
8. Normas armazenar a -20 ° C e armazenar amostras a -80 ° C. Certos estande internoSDRA que são propensas a degradação após o armazenamento a longo prazo devem ser armazenadas a -80 ° C.
9. Este procedimento requer a utilização de solventes perigosos, inflamáveis ​​ou voláteis, tais como MTBE. Executar todas as etapas de uma coifa.

2. Padrões internos

1. Escolha padrões internos (ISTD) com base em projetos individuais e seu projeto experimental específico. Para fluidos biológicos tais como o plasma, LBA, ou urina, istDS isotopicamente marcados, que são de natureza semelhante aos encontrados biologicamente nestas amostras seria ideal. Estes incluem, mas não estão limitados a aminoácidos, hormonas ou lípidos. Para amostras de plantas metabolomic, padrões marcados, tais como os flavonóides, ou carotenoides pode ser utilizado. O mesmo se aplica a outros estudos metabolomic qual o investigador deve escolher um padrão interno, que é representativo do tipo de amostra a ser analisada.
2. Certifique-se de que o ISTD escolhida abrange uma vasta gama de cromatograma; por exemplo, se tque o tempo de aquisição é de 20 minutos, os padrões que eluem a cada 5 minutos pode ser utilizado.
3. Criar soluções stock hidrofílicos a 2 mg / ml, utilizando uma variedade de padrões marcados com isótopos e / ou outros compostos polares que são exógenos para a amostra a ser analisada. De cada solução de estoque, criar uma solução de 1:1 de metanol: água a todas as normas para uma concentração final de 25 ug / ml de creatinina _D-3, 100 ug / ml de lisina-D _4, e 200 ug / ml de valina _D-8 .
4. Criar soluções stock hidrofóbicas, utilizando uma variedade de padrões marcados com isótopos e / ou outros compostos não polares que são exógenos para a amostra a ser analisada; concentrações de amostra de 17:00 de ácido gordo (de 4 mg / ml), 19:01 de ácido gordo (de 4 mg / ml), 17:00 ceramida (2 mg / ml), 17:00 PE (1,75 mg / ml), 15 : 0 PC (2 mg / ml), e testosterona-D ₂ (1 mg / ml). A partir de cada banco de criar uma solução em 1:1 clorofórmio: metanol, com todos os padrões a uma concentração final de 50ug / ml 17:00 ceramida, 100 ug / ml de 15:00 PC, com 100 ug / ml de testosterona-D _2, 200 ug / ml de 17:00 de ácido gordo, de 200 ug / ml de 19:01 de ácido gordo, e 200 ug / ml 17:00 PE na mistura padrão.
5. Teste o grau de ionização de cada padrão antes do tempo usando pelo menos cinco concentrações diferentes para cada padrão para determinar o limite de detecção e linearidade do instrumento para estes compostos. A concentração da solução de reserva para cada padrão indivíduo irá variar, dependendo do design experimental, e a concentração de cada padrão no padrão cravado combinado pode variar de 20 ng / ml a 2 mg / ml, dependendo de quão bem que ionizam.
6. Criar uma mistura pico de controlos positivos e adicioná-los para as amostras em 1x, 2x ou 4x níveis de concentração para monitorar quantitativamente a força da preparação da amostra e a precisão dos dados instrumentais. A concentração final de controlos positivos podeser: 2 mg / ml de D-glucose, 100 ug / ml de alanina-D _3, 200 ug / ml de ácido D-metilmalónico _3, 20 ug / ml de triglicérido _D-5, e / ou outros padrões hidrofóbicos e hidrofílicos. Ajuste as concentrações padrão em função da sensibilidade da instrumentação de MS e HPLC utilizado para a análise.

3. Precipitação Proteína

1. As amostras podem ser descongeladas para a temperatura ambiente e 10 mL de pico ISTD para cada amostra, como descrito abaixo.
2. Pico de 10 ml de ambas as soluções padrão hidrofílicos e hidrofóbicos (criados a partir do estoque em passos 2.3 e 2.4) para cada amostra. Ajuste as concentrações padrão como necessárias, com base na sensibilidade da instrumentação de MS e HPLC utilizado para a análise
   1. Pico 10 ul de qualquer de 1x, 2x, ou a solução de controlo positiva de 4x (criado a partir da lingua no passo 2.6) para cada amostra. Ajuste as concentrações padrão como necessárias, com base na sensibilidade da MS e HPLC instrumentação utilizada para a análise
   2. Vortex de cada amostra durante 10 segundos antes do passo de precipitação de proteínas
3. Adicionar 400 uL de metanol arrefecido em gelo (armazenadas a -20 ° C) a cada amostra.
4. Vortex por 10 segundos por tubo.
5. Centrifuga-se a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g.
6. Transferir todo o sobrenadante para um novo tubo de cultura de vidro, e, em seguida, seca-se sob N _2.
7. Se analisar a fração pellet de proteína, proceda aos passos 3,8-3,11. Se não analisar o pellet de proteína, pule para a Seção 4.
   Nota: Os sedimentos de proteínas podem conter compostos com alta hidrofobicidade que seriam úteis ao realizar estudos de drogas ^18, comida análises envolvendo flavonóides hidrofóbicas ¹⁹ ou estudos metabolômica relacionados a doenças onde os compostos muito hidrofóbicos se acumulam, como Lipofuscinoses Ceróides Neuronais ²⁰ e armazenamento de lipídios lisossômico doenças ^21.
8. Adicionar 1 ml de MTBE para tele branco (ou quase branco) pílula de proteína, de vórtice durante 30 segundos por tubo, depois centrifugar a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g. Decantar a camada de MTBE para um novo tubo de cultura de vidro.
   Este é um passo crítico como erros aqui vai afetar drasticamente os resultados (ver Figura 5 em resultados representativos).
   1. Consistentemente aspirar a mesma quantidade de MTBE para todas as amostras desde que o tamanho da pastilha variará entre as amostras. Portanto, se a 900 uL pode ser decantado para a amostra com a menor quantidade de sobrenadante, depois decanta-se 900 ul para todas as amostras.
9. Repetir o passo 3.9, e combinar a camada orgânica para o mesmo tubo de cultura de vidro preparado na etapa 3.7.
10. As amostras secas por um fluxo de _N2 e ressuspender em 200 ul de clorofórmio: metanol 01:01. Vortex brevemente.
11. Transferir para um tubo de centrífuga. Centrífuga a 0 ° C por 15 min a 18.000 xg, em seguida, transferir o sobrenadante para amostrador automático frascos de vidro com tampa de rosca usandopipetas.

4. Extracção líquido-líquido

1. Usando uma pipeta de vidro, adicionar 3 ml de MTBE para o metanol seco residual (a partir da secção 3, etapa 6), vortex 30 seg, adicionar 750 mL de água, seguida de vórtice 10 segundos por tubo.
2. Rotação ~ 200 x g durante 10 min numa centrífuga a RT.
3. Aspirar 2,5 ml da camada de MTBE (sem receber água) e transferir para um tubo de cultura de vidro limpo.
   Nota: Esta é uma etapa crítica como diferenças aqui vai afetar os resultados. 2,5 ml de MTBE deve ser cuidadosamente decantado a partir da camada de topo, porque permite que um volume fixo para ser decantado, sem pipetando a camada aquosa inferior. Se o volume da amostra no início da experiência era menos do que os 100 ul indicados para este método, dimensionar o volume de MTBE para reflectir esta proporcionalmente o volume da amostra de partida.
4. Adicionar 3 ml de MTBE para a parte restante da água da amostra, e vortex 10 segundos por tubo.
5. Rotação ~ 200g durante 10 minutos na centrífuga à TA.
6. Aspirar 3 ml de MTBE (sem obtenção de água) e combine com o tubo de MTBE.
7. Concentra-se a camada aquosa restante por secagem sob _N2.
8. Re-suspender resíduo em 100 ml de água.
9. Adicionar 400 mL de gelo MeOH frias para o tubo de cultura de vidro, vortex brevemente, e, em seguida, transferir para tubo de microcentrífuga.
10. Deixar a -80 ° C durante 20-30 min. Rotação a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g.
    Nota: Recomenda-se colocar todo o suporte de amostras em um freezer -80 ° C, pois isso permitirá que qualquer proteína restante para precipitar no metanol. Se um freezer -80 ° C não estiver disponível, as outras opções são: armazenar a -20 ° C, colocando as amostras em gelo seco, ou mantê-los em um balde de gelo. É importante para armazenar de forma consistente as amostras em um ambiente frio e à mesma temperatura, para permitir a precipitação.
11. Aspirar 450 mL de sobrenadante e transferir paraum tubo de microcentrífuga limpo. Seca-se completamente num concentrador centrífugo de vácuo a não mais do que 45 ° C. (Leva cerca de 1-2 horas).
12. Ressuspender sobrenadante seco em 200 mL de 5% de acetonitrilo / água. Vortex brevemente. Congelar a -80 ° C.

5. Extração em fase sólida

1. Seca-se a fracção de MTBE sob azoto a 35 ° C com um bom fluxo de azoto (demora cerca de 10-15 minutos).
2. Quando completamente secas, interromper o fluxo de azoto e rapidamente ressuspender em 1 ml de clorofórmio _(CHCI3), utilizando uma pipeta de vidro. Vortex brevemente.
   Nota: Os solventes, tais como _CHCI3 têm baixa viscosidade. Durante pipetagem, baixa tensão superficial faz com que a perda de solvente a partir da pipeta. Recomenda-se que a ponta da pipeta prewet ser pelo menos duas vezes para permitir que se estabeleça o equilíbrio do solvente a ser pipetada e o espaço na pipeta. A seringa à prova de gás pode também ser usado se estiverem disponíveis.
3. Configure um colector de vácuo SPE e NH ₂ colunas SPE para fracionamento.
4. Amostras quente para RT e sempre manter suspensa sob um fluxo constante de N _2. O aquecimento até à temperatura ambiente vai permitir a ressuspensão de lípidos e o azoto irá impedir a oxidação e polimerização de lípidos.
5. Lave e condição SPE 2x cartucho com 400 mL de hexano. Descarte de resíduos e substitua por um novo tubo de recolha de vidro.
6. Adicionar amostra à coluna SPE, recolher fluir através de tubos de vidro.
7. Com pipeta de vidro adicionar 1 ml de 02:01 _CHCl3: IPA, recolher fluir através de mesmos tubos de vidro (esta é a fracção neutra).
8. Seca-se a fracção neutra sob _N2 para minimizar a oxidação (demora cerca de 10-15 minutos).
9. Com pipeta de vidro adicionar 1 ml de ácido acético a 5% em éter etílico, recolher fluir através de novos tubos de vidro (esta é a fração de ácidos graxos).
10. Seca-se a fracção de ácido gordo sob _N2 para minimizar a oxidação (demora cerca de 10-15 minutos).
11. Utilize pontas de plástico para adicionar 800 e# 181; l de metanol para cartucho SPE, e recolher flow-through em 15 ml tubos cônicos de plástico (esta é a Fração Phospholipid).
12. Transferir fração de fosfolipídios para 1,5 ml tubos de centrífuga. Seca-se as amostras com um concentrador centrífugo de vácuo, a 45 ° C (demora cerca de 1-1,5 horas).
13. Ressuspender cada uma das amostras das três frações em 200 mL de metanol 100%, vortex, e transferência para amostrador automático frascos com tampa de rosca para armazenamento.

6. Amostra Condições de armazenamento

1. Armazenar todas as amostras a -80 ° C até estar pronto para a análise de instrumento.
   Observação: as amostras extraídas, reconstituídos em solvente orgânico pode ser armazenada a -20 ° C. No entanto isso não é recomendado como potenciais metabólitos de interesse irá degradar a esta temperatura. Armazenamento de nitrogênio líquido também não é recomendado como investigadores relataram problemas de contaminação, frascos especiais de armazenamento são necessários, e não há falta de homogeneidade na cau câmaracantar flutuações de temperatura.
2. Se o volume da amostra é pequeno (<100 ul), utilizar inserções nos frascos para evitar a evaporação do solvente na câmara de expansão durante a armazenagem.
3. Evitar congelamento-descongelamento das amostras. Descongele as amostras de uma só vez, mesmo antes da análise do instrumento. Repetidas congelar-degelos resultar na degradação da amostra.

7. Líquidos condições cromatográficas

1. Usar um C-18 2,1 milímetros x 50 mm (1,8 mm) com uma coluna analítica C-18 de 2,1 milímetros x 12,5 milímetros (5 um)-coluna para analisar a fracção hidrofóbica.
2. Regule a temperatura do amostrador automático para 4   ° C, a temperatura da coluna para 60   ° C, o volume de injecção de 2 ul e a taxa de fluxo de 0,25 ml / min.
3. Use 0,1% de ácido fórmico em água para a fase móvel A, e 0,1% de ácido fórmico em isopropanol: acetonitrilo: água (60:36:4), para a fase móvel B.
4. Execute o seguinte perfil de eluição gradiente: Iniciar umt 30% de B, e aumento de 70% de B de 0 a 1 min, em seguida, subir para 100% de B de 1 a 15 minutos e manter durante 5 min, seguido de 5 min 10% de B e de lavagem de 5 min pós prazo.
5. Usar um x 50 mm HILIC 2,1 milímetros (2,6 mm) coluna analítica com uma coluna de guarda para analisar a fracção hidrofílica.
6. Regule a temperatura do amostrador automático para 4   ° C, a temperatura da coluna para 20   ° C, o volume de injecção de 2 ul e a taxa de fluxo de 0,5 ml / min.
7. Usar 50% de acetonitrilo em acetato de amónio 10 mM, pH 5,8, para a fase móvel A e 90% de acetonitrilo em 10 mM de acetato de amónio pH 5,8, para a fase móvel B.
8. Executar o seguinte perfil de eluição gradiente: Inicio a 100% de B de 0 a 2 min, depois diminua para 50% de B, 2-15 min, seguido de 5 min 0% de lavagem B e 10 min após a execução.

Resultados

Toda a técnica de preparação da amostra foi realizada como descrito acima e os aspectos mais importantes e / ou relevantes são apresentados abaixo. Padrões internos hidrofílicos e hidrofóbicos foram incrementadas em amostras de plasma agrupados para realizar comparações diretas dos padrões internos e abundâncias de metabólitos endógenos usando vários métodos de extração. Espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) Os dados foram analisados ​​utilizando o software qualitativa e quantitativa e resultou em excelente recuperação e separação de ambos os compostos endógenos e os padrões internos. Figura 1 demonstra a eficácia do método de MTBE-SPE em extrair ambos os padrões de lípidos (A) e compostos endógenos (B).

No geral, melhor extração e cobertura dos metabólitos foram obtidos em comparação com outros métodos, como a extração de metanol, ou 'só MTBE «extracção quando o número ocaracterísticas f foi comparado usando software qualitativa e quantitativa seguinte análise LC-MS. Por exemplo, utilizando apenas a extracção de metanol, a variação de creatinina _D-3 foi de 15,2%. No entanto, com MTBE LLE, este foi reduzido para 1,04% CV. Usando o MTBE, a reprodutibilidade de lípidos e compostos aquosas foram <8% e <5%, respectivamente, comparado com uma simples extracção metanol o que resultou em maior variação de 29% e 15%, respectivamente, para lípidos e compostos aquosos. Os padrões internos utilizados para monitorar as recuperações de lípidos - testosterona-D _2, C17 ceramida, 15:00 PC, PE e 17:00 aumentou em 26%, 200%, 100%, 400%, respectivamente, em relação ao uso de metanol. Aumentos semelhantes foram detectados por padrões internos de ácidos graxos e phosphotidylcholine e metabolitos endógenos phosphotidylethanolamine. Outros metabolitos endógenos, tais como ceramidas, esfingosinas, diacilgliceróis, triacilgliceróis, colesterol e esfingomielina, ou não foram detectadasusando metanol ou foram detectados em níveis insignificantes. No entanto, estes lipídios endógenos foram facilmente detectadas usando extração MTBE.

Na nossa análise comparando protocolos padrão, os resultados seguintes foram obtidos: precipitação com metanol sozinho resultou em 1,851 metabolitos, precipitação com metanol-etanol deu 2,073 metabolitos, MTBE com a extracção líquido-líquido, deu 3,125, e com MTBE líquido-líquido e de extracção em fase sólida recuperadas 3.806 metabólitos. Portanto, esta abordagem resulta em um maior número de metabólitos sendo extraídos, muito provavelmente devido à supressão de íons reduzidas e das amostras mais limpas antes de LC-MS.

A Figura 2 demonstra a eficiência na separação dos metabolitos hidrófobos nas respectivas categorias de produtos químicos para a identificação do metabolito mais confiantes. Há uma sobreposição mínima de compostos identificados nas três fracções lipídicas seguintes SPE. Em apoio, a Figura 3 mostraa recuperação dos padrões internos que demonstram que foram eluídas da ISTD na fracção relacionada com a sua classe de produtos químicos.

As amostras de controlo de qualidade são usados ​​para avaliar a qualidade da preparação da amostra, para determinar quaisquer efeitos batch quando vários dias de análise são necessários para um grande conjunto de amostras, e para monitorizar instrumento reprodutibilidade. Os cromatogramas são examinados para assegurar que os padrões são enriquecidas em mais do que 90% recuperado com massa de erro inferior a ± 3 ppm e retenção de janela de tempo de menos do que ± 5%. Se estes critérios não forem satisfeitos, os resultados são descartadas e as amostras são novamente analisadas. No caso de efeitos de lote através do qual uma mudança na retenção é observado para um lote, o software de análise de dados pode corrigir por este. Um lote previamente preparada de amostras de plasma reunidas foram submetidos a preparação da amostra. As fracções foram em seguida sub-divididas em alíquotas para frascos de auto-amostragem e armazenado a -80 ° C para uso na monitorização instrumento condições ao longo de cada análise de amostras. Tabela 1 mostra os resultados a partir destes padrões de pico-a. A fracção modo de ionização negativa de ácidos gordos (dados não apresentados na tabela) não foi utilizado para análise, porque o CV% dos padrões de pico-a para a amostra QC foi maior do que 10%. O conjunto de dados para a fracção que foi, portanto, descartado e o instrumento inspeccionado e mantido. Tabela 2 mostra os resultados de metabolitos endógenos nas amostras seguintes três dias diferentes de preparação da amostra e as injecções de instrumentos em triplicado. Os metabolitos endógenos na preparação de amostras de amostras QC são reproduzíveis, significando a força da preparação da amostra, bem como o aparelho de injecção de reprodutibilidade.

Quando os passos de preparação de amostra não são adequadamente seguidos, no entanto, obtêm-se a resultados pouco fiáveis ​​e inconsistentes. Figura 4 mostra os resultados quando o passo de precipitação de proteína do métodonão é seguido, conforme descrito. Três operadores, A, B, C e realizou o mesmo procedimento de preparação da amostra em amostras de plasma reunidas. Um operador, em vez de pipetando a quantidade necessária de sobrenadante por o protocolo experimental, em vez pipetados> 1 ml para ambas as lavagens com algum do pelete. Isto não só resulta em um maior número de falsos positivos para a fracção, mas o aumento da variabilidade dos dados.

A reprodutibilidade dos dados cromatográficos pode ser visto na Figura 7. Amostras de bancos de plasma foram preparadas em triplicado, em dias separados utilizando a precipitação de proteínas, a extracção líquido-líquido, e de extracção em fase sólida como descrito no presente protocolo. Cada fração foi analisada utilizando a separação cromatográfica descrito no capítulo 7 do protocolo. As amostras foram então injectadas em triplicado em LC-MS para avaliar instrumento e preparação da amostra de reprodutibilidade. Esta sobreposição consistente demonstra tanto a strength da reprodutibilidade da preparação da amostra, quando preparado em três dias diferentes, bem como a força do método de cromatografia em produzir resultados reprodutíveis. Observa-se um aumento do ruído químico para o modo de ionização negativa da fração de ácidos graxos. Isto pode ocorrer devido a contaminantes nos solventes de LC-MS e pode resultar em resultados quantitativos metabolomic inconsistentes. Por isso foram analisados ​​apenas metabólitos que eluídas antes de 9 min.

Ao executar as listas de trabalho longos, uma perda de sensibilidade do instrumento e mudança em concentrações de tampão podem ocorrer ao longo do tempo, resultando em diminuição da intensidade do sinal e desvio de tempo de retenção. Se a variação de sobreposição tempo de retenção é menor do que 5% e a variação da intensidade do sinal é menor do que 10%, os dados ainda está dentro dos limites normais de laboratório. O software de análise pode ser utilizado para alinhar e normalizar os dados para corrigir desvio instrumento e tempo de retenção. No entanto, se a variação for large, em seguida, o motivo tem de ser determinado. Uma vez que isto seja corrigido, as amostras podem ser re-analisados.

Figura 1. A abundância de istDS lipídicas (A) e os metabolitos endógenos (B) a seguir a extracção e cromatografia de fase reversa (RPC) ^12. A extracção foi efectuada e as amostras resultantes foram separadas usando RPC e analisadas utilizando LC-MS no modo de ionização positivo e negativo. Esta figura foi modificado a partir de Yang et ai, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 2. Uma comparação de MTBE-SPE frações ^12. Os metabolitos identificados em cada fração foram comparadas para identificar a quantidade de sobreposição durante a porção de SPE da prep. Os números no diagrama de Venn reflectir o número de metabolitos detectados em cada fracção. Aqui menor sobreposição é observada entre as três frações, representando extração composto de sucesso e separação classe metabólito durante a etapa de SPE. Esta figura foi modificado a partir de Yang et ai, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 3. A recuperação de istDS nas fracções, utilizando o método de MTBE-SPE ^12. A extracção foi efectuada e as amostras resultantes foram separadas usando RPC e analisados ​​utilizando LCMS no modo positivo e negativo como descrito no texto. Este valor foi modificado de Yang et al, Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013).

Figura 4. Resultados da fração pellet elaborado por três operadores. Três amostras preparação operadores A, B, C e realizada no mesmo passo de preparação de proteína em amostras de plasma reunidas. Os números no diagrama de Venn reflectir o número de metabolitos detectados por cada operador. Operadores B e C pipetado o volume necessário por o protocolo de preparação da amostra, enquanto operador Um pipetados todo o sobrenadante e algum do pelete, resultando em mais de 500 mais metabolitos, a maioria sendo falsos positivos para a fracção específica.

Figura 5. Formação de sedimento de proteína durante a etapa de precipitação de proteína <. / Forte> (A), 100 ul de plasma humano, antes da preparação da amostra, (B) no plasma após adição de metanol arrefecido em gelo, (C) pílula de proteína formada no fundo do tubo de centrifugação, depois a 0 ° C durante 15 min a 18.000 x g.

Figura 6. Separação das camadas hidrofílicos e hidrofóbicos durante a extracção líquido-líquido (LLE) passo. O solvente de éter metil terc-butílico orgânico (MTBE) e água, foram utilizadas para separar os metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos. A camada de MTBE foi dissolvido compostos não-polares, e a camada de água foi dissolvido compostos polares (A) sobrenadante do plasma, após a remoção de proteína,. (B) no plasma, após secagem sob azoto, (C) no plasma após adição de MTBE; ong> (D) adição de água de plasma e MTBE, (E) camada de MTBE-água formada após a centrifugação, (F) a remoção da camada de MTBE topo, (L), principalmente camada hidrófila permanece após a remoção de MTBE.

Figura 7. Cromatogramas de fracções de um conjunto seleccionado de preparação da amostra. Foi realizado em três amostras de QC plasma reunido separadas e cada amostra foi injectada em triplicado no instrumento LC-MS. Representado são cromatogramas de íons totais das amostras de plasma adquiridos usando os parâmetros de LC-MS indicados na seção 7 do protocolo de método. A representação cromatográfica de outros fluidos biológicos podem variar devido a diferenças na composição do metabolito.k "> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fração	Modo de ionização	Padrão interno	n	Área Média Peak	Área do pico% CV
Aquoso	Positivo	Creatinina D-3	31	2217311	3,8%
Lípido neutro	Positivo	Triglicérides-D 5	31	4837032	9,9%
		C17 ceramida	31	12736707	7,9%
Phospholipid	Positivo	15:00 PC	32	1248929	9,3%
		17:00 PE	32	517234	7,9%

Os resultados do controlo de qualidade tabela 1. Dos padrões internos cravado. Amostras de plasma obtidos a partir de um conjunto de dados modelo enfisema rato foram analisados ​​para monitorar as condições do instrumento em uma base diária para este estudo multi-semana. O software de análise quantitativa foi usada para determinar as áreas dos picos dos padrões internos (n = número de instrumento injecções de CQ).

Fração	Modo de ionização	Metabolitos endógenos	Área Média Peak	Área do pico% CV
Aquoso	Positivo	Creatinina	2554574	2,3%
		Valina	3712151	3,3%
		Glicose	2669190	6,9%
Lípido neutro	Positivo	3-Dehydrosphinganine	226644	3,9%
		DG (16:0 / 16:1 / 0:0)	11301	8,2%
		DG (P-14: 0/18: 1)	364119	1,9%
Phospholipid	Positivo	PC (24:0 / 0:0)	27599	0,9%
		PC16: 0/22: 6)	2873326	4,5%
		PI (16:00 / 18:01)	112998	4,4%
Ácido graxo	Positivo	-5-oxo-10 ,8-decadienoic	1363284	2,3%
		Ácido 16-oxo-heptadecanóico	83700	2,9%
		Ácido 2-metil valérico	285782	5,7%
Ácido graxo	Negativo	Ácido 10-hidroxi-8-octadecenóico	10042	4,9%
		(R)-laballenic ácido	173929	6,5%
		Ácido valérico ácido 2-ceto	35488	6,0%

Os resultados do controlo de qualidade tabela 2. Dos metabolitos endógenos. Amostras de plasma obtidos a partir de um conjunto de dados doença humana foram analisadas para monitorar amostra preparação reprodutibilidade em dias separados. As amostras foram preparadas em triplicado, durante três dias, (n = 9 prep injecções de CQ).

Discussão

Um dos objetivos dos estudos clínicos metabolômica é identificar mudanças no metaboloma relacionados com a doença ou tratamentos. Portanto as técnicas de preparação de amostras precisa ser robusto, consistente e transferíveis de técnico para técnico e de laboratório para laboratório ^22. Os dados resultantes precisa ser representativa da amostra, e as mudanças identificadas precisam refletir a amostra definida em vez de erros de preparação de amostras. Portanto pipetagem precisa, a temperatura correta, decantação eficiente de camadas imiscíveis, secagem em atmosfera de azoto, e uso das mesmas marcas e tamanhos de copos e dicas são necessárias.

Durante o passo de precipitação de proteína, é fundamental que a mesma quantidade de solução é decantada a partir de cada pelete. Isto reduz a variação de volume e, como tal, reduz a variação nos dados de exemplo. Este passo de precipitação de proteínas é necessária para estudos metabolomic e não pode ser ignorada, uma vez que remove a proteína a partir deas amostras antes da análise de perfil de molécula pequena sobre o espectrómetro de massa. Ele elimina patógenos e grandes macromoléculas, e libera obrigado metabólitos de proteínas ^7. A falta de acumulação de proteínas nas amostras aumenta a vida útil da coluna de HPLC e aumenta a precisão e qualidade dos resultados. Figura 5 é uma representação da pelete de proteína formado quando da realização desta técnica em amostras de plasma. Isto permite a detecção de moléculas pequenas, aumenta a abundância de iões, e reduz os efeitos da matriz de proteínas na amostra. Além disso, uma vez que se assume que todas as proteínas são removidos nesta etapa, os aminoácidos que são detectadas durante a análise por LC-MS que originam alterações metabólicas, em vez de a partir de degradação de proteínas.

A fase de extracção líquido-líquido é crítica, uma vez que separa os metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos em duas camadas imiscíveis. Figura 6 mostra o processo LLE e um representantepresentação da camada LLE. Uma separação indevida das duas camadas resulta em metabolitos ou ser perdidos ou sendo eluídas em ambas as fracções. Aplicação cuidadosa deste passo reduz o número de compostos hidrofílicos que aparecem na fracção hidrofóbica. Os resultados para estes compostos tornam-se pouco fiável, uma vez que não pode ser determinado que fracção contém os resultados representativos. Quando feito corretamente, metabólito sobreposição é reduzida.

Para evitar a degradação oxidativa, principalmente em lípidos, mas também, em pequenas moléculas que podem conter grupos tiol, por exemplo, a exposição ao oxigénio tem de ser mantida a um mínimo. Por conseguinte, este procedimento é sempre realizada sob azoto para reduzir / evitar a oxidação dos lípidos ou compostos contendo tiol. Além disso, a transferência da amostra e / ou a solução é rápida (dentro do primeiro minuto), para reduzir a exposição ao oxigénio, em seguida, as amostras são rapidamente colocados sob um fluxo constante de azoto para secar para baixo. Uma vez secos, são imediatamentediatamente ressuspensas em 100% de metanol para as razões acima discutidas.

Laboratórios podem se beneficiar deste método abrangente de várias maneiras; Os pesquisadores procuram isolar uma classe de compostos pode escolher a parte do método que melhor se adapte às suas necessidades. Aqueles que procuram para realizar apenas uma precipitação de proteínas para obter um pool de metabólitos podem fazê-lo. Se os metabolitos hidrofílicos são desejados, tais como muitas drogas farmacêuticas, aminoácidos e açúcares, ou se apenas metabolitos hidrofóbicos são desejados, tais como triglicéridos, epóxidos, vitaminas solúveis em gorduras, e fosfolípidos, por exemplo, em seguida, os investigadores podem realizar a extracção líquido-líquido passo seguinte precipitação de proteínas e descartar a fração indesejada. Os investigadores que necessitam de mais sub-classificação dos compostos hidrofóbicos (lipídios neutros, ácidos graxos e fosfolipídios) podem avançar para a etapa de fracionamento.

Considerações de armazenamento são importantes na maintaining a viabilidade das amostras para análise posterior. Se as amostras são armazenadas de forma incorreta, a degradação ou decomposição pode ocorrer. Idealmente, as amostras devem ser armazenadas em frascos âmbar com tampa de rosca longe de luz para evitar a degradação das espécies sensíveis à luz. As amostras também deve ser mantido congelado a -80 ° C para evitar degradação do metabolito ^23-25. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras são sempre mantidas a 4 ° C no tabuleiro amostrador automático durante a análise por LC-MS. Isto assegura que todas as amostras são mantidas a uma temperatura constante e que as alterações na temperatura ambiente, não afectam a viscosidade, solubilidade, estabilidade ou das amostras. Recomenda-se que os aspectos manuais deste procedimento, como LLE e SPE, ser praticada, a fim de ganhar a confiança e conforto com as etapas envolvidas.

Existem algumas limitações para esta técnica. Discreto separação dos metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos não é garantida como certos compostos vontade inherSuavemente particionar em ambas as frações, devido à sua composição química e taxa de Estado. Além disso, como mostrado na Figura 4, a técnica inadequada durante o passo de extracção do sedimento da proteína pode resultar em fraca reprodutibilidade metabolito em ambas as amostras e os controlos de qualidade. Isso afeta as estatísticas, especialmente em pequenos conjuntos de dados, porque o poder estatístico não está disponível. Portanto, é fundamental que esta etapa ser realizada exatamente no mesmo tempo cada para cada amostra. Outra limitação é o tempo. Embora existam pontos de parada ao longo deste protocolo, onde as amostras podem ser congeladas e a preparação continuou no dia seguinte, um dia inteiro deve ser anulado para realizar esse procedimento. Em terceiro lugar, nem todos os compostos dentro de uma amostra biológica pode ser avaliada para a supressão de iões. Como não é possível identificar como a matriz está afetando cada metabólito individual, a opção é avaliar os padrões internos que teoricamente imitam algumas classes de endogenous metabolitos. Por último, as identificações absolutos não pode ser realizado apenas com este método. Tandem MS em colaboração com pesquisas de banco de dados e padrões são necessários para a identificação absoluta metabólito.

Uma parte importante do metaboloma, é a identificação de compostos. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras de controle de qualidade foram analisados ​​utilizando LC-MS. Vários espaços de preparação de amostras e espaços em branco instrumento foram preparadas para uso como pano de fundo a subtração de reduzir a taxa de falsos positivos de contaminantes, resultando em visitas metabólitos mais confiáveis. Após esta etapa, o número de "características moleculares" foram agrupados com base em m / z, tempo de retenção, razão isotópica, e adutos para produzir uma lista de compostos reais. Embora a lista de compostos foi grandemente reduzida, os resultados foram mais fiável porque não eram baseados em vários adutos do mesmo composto. O método integral é abrangente e permite isolation de metabolitos hidrofóbicos tais como lípidos neutros, fosfolípidos, ácidos gordos, triglicéridos, e esteróides, enquanto também isolar as classes hidrofílicos na fracção aquosa, dos quais os eicosanóides, açúcares, flavonóides e aminoácidos foram identificados ^{12, 26.}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
Methanol	Fisher Scientific	L-6815
Chloroform	Fisher Scientific	C606-1
Hexane	Sigma Aldrich	34859
Acetic acid	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether	J.T. Baker	9042-03
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	34965-2.5L
Water	Honeywell Burdick Jackson	365-4
OA-SYS heating system	Organomation Associates, Inc		Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C
12-position vacuum manifold	Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges	Phenomenex	8B-S009-EAK
Glass pipette tips	Fisher Scientific	13-678-20C	Used to transfer sample to SPE column
Plastic pipette tips	USA Scientific	1182-1830	Used when glass tips are not necessary
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
Graduated glass pipets	Fisher Scientific	13-678-27B	Used to transfer organic solvents during sample prep
Pyrex glass culture tubes	Corning Incorporated	99499-16X	Used to store aqueous and lipid fractions until the next step
Autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0545
Snap cap vials for autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0541
Glass inserts	Agilent Technologies	5183-2085	Used for small sample volumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.06.00	Used to monitor retention times and pressure curves
Mass Hunter Quantitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.05.02	Used to analyze quality control and sample data
Mass Profiler Professional software	Agilent Technologies	Version B.12.50	Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification