Многоступенчатая Подготовка Техника восстановить нескольких метаболита классов соединений для углубленного и информационному Metabolomic анализа

Резюме

Достоверность результатов в метаболомики экспериментов зависит от эффективности и воспроизводимости пробоподготовки. Описанный является строгим и в глубины метод, который позволяет при экстракции метаболитов из биологических жидкостей с возможностью последующего анализа до тысячи соединений, или просто сложные классы интерес.

Аннотация

Метаболомика является развивающейся области, которая позволяет профилирование образцов из живых организмов для того, чтобы получить представление о биологических процессах. Важнейший аспект метаболомики является пробоподготовка которой противоречивые методы генерации ненадежные результаты. Этот метод включает в себя осаждение белков, жидкостно-жидкостной экстракции и твердофазной экстракции как средство фракционирования метаболитов на четыре отдельных классов. Улучшение обогащение низких молекул изобилии с результирующим увеличением чувствительности получается, и в конечном итоге приводит к более уверенного идентификации молекул. Этот метод был применен к плазме, БАЛ и спинномозговой жидких образцах с объемами, как низко как 50 мкл. Образцы могут быть использованы для нескольких последовательных применений; Например, осадок в результате осаждения белка могут быть сохранены для последующего анализа. Супернатант от этого шага подвергается жидкостно-жидкостной экстракции с помощьювода и сильным органическим растворителем для разделения гидрофильные и гидрофобные соединения. После того, как фракционированное, гидрофильный слой может быть обработан для последующего анализа или отброшены, если не нужен. Гидрофобный фракцию далее обрабатывали с помощью серии растворителей в течение трех стадий экстракции твердой фазы, чтобы отделить его в жирные кислоты, нейтральные липиды и фосфолипиды. Это позволяет техник гибкость в выборе которых класс соединений является предпочтительным для анализа. Это также помогает в более надежной метаболита идентификации, так как некоторые знания химический класс существует.

Введение

Биологические реакции генерируют метаболитов как конечных продуктов клеточных процессов. Метаболомика представляет собой сборник всех соединений, присутствующих в организме в результате этих процессов. Это дает картину физиологии клеток и отражает реакцию организма на внешний или внутренний стимулов ^{1, 2.} Такие стимулы могут быть экологические, токсикологические, фармакологические, диетическое, гормональные, или связанная с болезнью. Многие metabolomic приложения имеют и в настоящее время изучается исследователями и включают открытие биомаркеров ^3, питание исследований ^4, продовольственной науки ⁵ и тестирования на наркотики ^6. Независимо от применения, изменения в данных, заражения и наличия ложных срабатываний должны быть сокращены или предпочтительно удаляют. В биомаркеров или в случае определения различий между контролем и группой заболеваний, или за расследование эффекты препаратов по предметам, биологический еLUID выбирается на основе вопросов, задаваемых и типы метаболитов расследуется ^7. Например, если изучения непосредственных последствий ингаляционного препарата на легких астматиков, то, исследуя метаболитов в БАЛ (БАЛ) образцы до и после введения будет льготная. Чтобы убедиться, что наблюдается различия обусловлены фактической биологической изменчивости, а не неправильной техники пробоподготовки, стандартизированы и соответствуют протокол лаборатория имеет важное значение ^8. Образец информация должна быть тщательно задокументированы, чтобы гарантировать, что такие переменные, как биологической жидкости, процедить животных, времени выборки, с учетом возраста, пола, чтобы назвать несколько, все они считаются и учтены в исследовании ^9. Кроме того, чтобы уменьшить возможность загрязнения или ложных срабатываний, рекомендуется растворителей заготовки и инструмента заготовки быть проанализированы ^10.

Для этого протокола, термин "Metaboспутники "будет использоваться для обозначения реальных соединений, выявленных. Использование ПО поставщика, начальная алгоритм пик вывод используется для обнаружения массовых спектральные пики. Эти пики совпадают на основе массы к заряду (м / з) отношение и хранения времени. Второй алгоритм затем используется для объединения нескольких функций в одном соединении. Это включает в себя такие функции, как натрий, калий, или аммония аддуктов в режиме положительной ионизации и хлорида в режиме отрицательных ионов. Дополнительные опции в программном обеспечении включают такие функции, как димеров и других аддуктов. Использование глюкозы в качестве примера, с пиками при 181.0707 M / Z (M + H), 198,0972 м / з (M + NH _4), и 203,05261 м / з (M + Na), было бы три пики, соответствующие тем же соединение с использованием первого алгоритма. Однако, когда второй алгоритм, который основан на молекул рной формулой, применяется эти три аддукты стать сгруппированы в результате одного соединения.

Метаболиты может вызвать помехи в SAMPле из-за сложности соединений, присутствующих. Наличие тысяч метаболитов в одном образце причин сигнал подавление особенно нижних численности метаболитов. Образец очистки для удаления мешающих белков и последующее разделение на несколько фракций уменьшает сложность образец повышая таким образом пиковую разделение, увеличивая разрешение, а также снижение метаболита coelution. Таким образом, образец очистки и улучшения разделение соединений не требуется. Было показано, что осадки в одиночку белка, даже с использованием различных растворителей полярности, не может решить этот вопрос ^{11, 12.} Тем не менее, путем объединения сильный органический растворитель, такой как МТБЭ с последующей стадии фракционирования, охват метаболит увеличивается. Ян и др.. ¹² сообщили об увеличении метаболитов от 1851 или 2073 с метанолом или метанол-этанол осадков только соответственно, 3806 метаболитов с использованием экстракции в сочетании МТБЭ растворителяс последующим твердофазной экстракции (SPE) шаги. Снижение метаболит перекрытия, улучшенная пик разделение и увеличение метаболит обилие наблюдалось с помощью этого метода.

Заражение от не-метаболитов, таких как полимеры, могут возникнуть в результате отбора проб, растворителей, или приборной шума, и может привести к подавлению сигнала потенциально важных метаболитов. Рекомендуется, чтобы техник (ы) и тех, кто собирает образцы до пробоподготовки последовательно использовать тот же бренд, тип и размер сбора образца флаконов, наконечники пипеток и любых других труб, используемых в процессе сбора и подготовки образцов. Это позволяет аналитику данных, чтобы иметь полную уверенность, что наблюдаемые изменения являются реальными, а не за счет фоновых отличий от других источников. Эффективность лечения, различия между болезнью и контрольной группах, или любых других метаболических анализов могут быть исследованы с повышенным доверием.

Метод обсуждается здесь фокусируется на сочетании Методы подготовки образца, ^13-15, которые могут быть применены к плазме, БАЛ или спинномозговой жидкости (ликвора) образцов для нецелевого metabolomic профилирования для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) на основе анализа. Оба жидкостной хроматографии (LC) и ультра-жидкостная хроматография (UPLC) методы разделения может быть соединен с последующей МС в этой процедуре. Многие исследователи, выполняющие metabolomic исследований использовать любой метод осаждения белка и / или технику экстракции жидкость-жидкость ^{16, 17.} В наших исследованиях, это привело к меньше метаболиты будучи обнаруженным. Метод, описанный здесь ¹² позволяет обнаружение и идентификацию большего числа метаболитов, охватывающий более широкий спектр метаболом. Это увеличение за счет более высокой чистотой образцов и снижение матричных эффектов, вызванных предварительного разделения классов метаболитов.

Первоначальный протEin осадки этап выполняется с использованием холодного метанола (MeOH), чтобы удалить белок из образца. Жидкостно-жидкостной экстракции (LLE), используя метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ) и воду используется для разделения гидрофильных и гидрофобных соединений. Затем твердофазная экстракция (SPE) выполняется на гидрофобным слоем, чтобы отделить гидрофобные соединения на три класса - жирных кислот, нейтральных липидов и фосфолипидов. Гидрофобные фракции восстанавливали в 100% метаноле, в то время как гидрофильный фракцию восстанавливали в 5% ацетонитрила в воде. Экстракцию (SPE) шаг твердофазный обеспечивает дополнительный уровень доверия к результатам за счет уменьшения количества coeluting соединений, которые в противном случае пришлось присутствовать стадию разделения не была выполнена.

протокол

1. Первоначальные соображения, Подготовка документов и стандартов

1. Всегда используйте стакан для хранения (стекло культуры трубок, стекло AutoSampler флаконы) или передачи (стекло пипетки) липиды и органические растворители.
2. Сведите к минимуму воздействие всех образцов липидов и стандартов в воздух. Печать политетрафторэтилена (ПТФЭ) крышки плотно, чтобы избежать воздействия воздуха и испарение. Сразу ресуспендируйте высушенные липиды в следующем растворителя или держать их в постоянном токе азота.
3. С помощью 100 мкл образца. В случаях, когда более (или менее) Образец имеющийся, отрегулировать объемы соответственно. Однако во время липидов фракционирования на SPE колонке NH _2, заявил объемы должны оставаться, как указано.
4. Включите центрифуге и установлен в 0 ° С до начала подготовки образца.
5. Этот метод использует многие летучие растворители так держать все растворители увенчал пробоподготовки.
6. Подготовьте два типа стандартов на рекомендации.
7. Подготовьте отрицательный контроль, состоящий из шипами-в стандартах все при постоянной концентрации. Это шипами в всех образцов, а также совокупной выборки, который используется в виде пакета QC (шипами совокупной выборки используются для мониторинга пробоподготовки воспроизводимость на отдельные дни) и инструмента контроля качества (шипами объединенных пробах предварительно приготовленный, суб-аликвоты и используется для контролировать инструмент условия / колебания во время анализа и в отдельные дни).
   1. Подготовка положительного контроля со скоростью 1x, 2x и 4x стандартных шипами. Положительные элементы управления добавляются в всех образцов, а также совокупной выборки плазмы и используются в качестве контроля качества соединений для обоих этапов пробоподготовки и шагов инструментального анализа провести анализ и выявить различия Сменить во время анализа данных, чтобы гарантировать, что все аспекты подготовка и инструментальный анализ были выполнены правильно.
8. Стандарты Хранить при -20 ° С и хранить образцы при -80 ° С Некоторые внутренняя стойкаОРДС, которые склонны к деградации следующие длительного хранения, должны храниться при температуре -80 ° С.
9. Эта процедура требует использования опасных, горючих или летучие растворители, например МТБЭ. Выполните все действия, описанные в вытяжной шкаф.

2. Внутренние стандарты

1. Выберите внутренние стандарты (ISTD) на основе индивидуальных проектов и их конкретной экспериментального проектирования. Для biofluids таких как плазма, БАЛ, или мочи, меченных изотопами ISTDs которые похожи по своей природе, которые содержатся биологически в этих образцах было бы идеально. К ним относятся, но не ограничиваются ими, аминокислоты, гормоны или липидов. Для metabolomic образцов растений, могут быть использованы меченые стандарты, такие как флавоноиды, или каротиноиды. То же самое относится и к другим metabolomic исследований которой следователь должен выбрать внутренний стандарт, который является представителем тип анализируемого образца.
2. Убедитесь, что выбранный ISTD охватывает широкий спектр хроматограмме; например, если тон время сбора составляет 20 мин, могут быть использованы стандарты, которые элюируютс каждые 5 мин.
3. Создание гидрофильные исходные растворы в дозе 2 мг / мл с использованием различных меченных изотопами стандартов и / или других полярных соединений, которые экзогенным по отношению к анализируемой пробы. Из каждого раствора, создают одно решение в 1:01 метанол: вода всем стандартам в конечной концентрации 25 мкг / мл креатинина-D _3, 100 мкг / мл лизин-D ₄ и 200 мкг / мл валин-D ₈ .
4. Создание гидрофобные растворы с использованием различных меченных изотопами стандартов и / или других неполярных соединений, которые являются экзогенными для анализируемого образца; фондовые концентрации 17:00 жирной кислоты (4 мг / мл), 19:1 жирных кислот (4 мг / мл), 17:00 церамида (2 мг / мл), 17:00 ПЭ (1,75 мг / мл), 15 : 0 ПК (2 мг / мл) и тестостерон-D ₂ (1 мг / мл). Из каждой акции, создают одно решение в 1:01 хлороформ: метанол всем стандартам в конечной концентрации 50мкг / мл 17:00 церамида, 100 мкг / мл 15:00 PC, 100 мкг / мл тестостерона-D _2, 200 мкг / мл 17:00 и жирной кислоты, 200 мкг / мл 19:01 жирной кислоты и 200 мкг / мл 17:00 ЧП в стандартной смеси.
5. Проверьте степень ионизации каждого стандарта загодя использованием по меньшей мере пять различных концентраций для каждого стандарта для определения предела обнаружения и линейности прибора для этих соединений. Концентрацию исходного раствора для каждого отдельного стандарта будет варьироваться в зависимости от эксперимента, и концентрация каждого стандарта в сочетании шипами стандарта может находиться в диапазоне от 20 мкг / мл до 2 мг / мл в зависимости от того, насколько хорошо они ионизируют.
6. Создать шип сочетание положительных контролей и добавить их к образцам на 1x, 2x, 4x или уровней концентрации для контроля количественно прочность пробоподготовки и точности инструментальных данных. Конечная концентрация положительного контроля можетбыть: 2 мг / мл D-глюкоза, другие гидрофобные и гидрофильные стандарты 100 мкг / мл аланин-D _3, 200 мкг / мл метилмалоновая кислота-D _3, 20 мкг / мл триглицерид-D _5, и / или. Настройка стандартного концентрации на основе чувствительности измерительных приборов MS и ВЭЖХ использовали для анализа.

3. Белок Осадки

1. Оттаивания образцы до комнатной температуры и шип 10 мкл ISTD к каждому образцу, как описано ниже.
2. Спайк 10 мкл обоих гидрофильных и гидрофобных стандартных решений (созданных из запаса с шагом 2.3 и 2.4) в каждом образце. Настройка стандартного концентрации по мере необходимости на основе чувствительности измерительных приборов MS и ВЭЖХ использовали для анализа
   1. Спайк 10 мкл либо 1x, 2x, 4x или положительного решения управления (созданного со склада в шаге 2.6) к каждому образцу. Настройка стандартного концентрации по мере необходимости на основе чувствительности МС и HPLC приборы, используемые для анализа
   2. Vortex каждый образец в течение 10 сек до осаждения белка шаге
3. Добавить 400 мкл охлажденного льдом метанола (хранили при -20 ° С) к каждому образцу.
4. Vortex в течение 10 сек на пробирку.
5. Центрифуга при 0 ° С в течение 15 мин при 18000 х г.
6. Перевести все супернатант в новую стекло пробирку, а затем сушат под N _2.
7. Если анализировать белок гранул фракции, перейдите к шагам 3.8-3.11. Если не анализируя белка гранул, перейдите к разделу 4.
   Примечание: Белок гранул могут содержать соединения с высокой гидрофобностью, которые были бы полезны при выполнении исследования наркотиков ^18, пищевой анализирует участием гидрофобные флавоноиды ¹⁹ или metabolomic исследования, связанные с заболеваниями, где очень гидрофобные соединения накапливаются, таких как нейронные цероид-lipofuscinoses ²⁰ и лизосом хранения липидов заболевания ^21.
8. Добавьте 1 мл МТБЭ тон белый (или не совсем белый) белок гранул, вихрь в течение 30 сек на пробирку, затем центрифугируют при 0 ° С в течение 15 мин при 18000 х г. Слейте МТБЭ слой на новый стекло пробирку.
   Это очень важный шаг, так как ошибки здесь будет резко повлиять на результаты (см. рисунок 5 в представительных результатов).
   1. Последовательно аспирации такое же количество МТБЭ для всех образцов с размером гранул будет зависеть от типа образцов. Поэтому, если только 900 мкл может быть декантируют для образца с наименьшим количеством супернатанта, а затем декантируют 900 мкл для всех образцов.
9. Повторите шаг 3,9, и объединить, что органический слой той же стеклянной пробирку, полученного на стадии 3.7.
10. Сухие образцы по N ₂ поток и ресуспендируют в 200 мкл 1:01 хлороформ: метанол. Vortex кратко.
11. Трансфер в пробирку для центрифугирования. Центрифуга при 0 ° С в течение 15 мин при 18 000 мкг, а затем перенести супернатант в AutoSampler винтовой крышкой флакона с использованием стеклапипеток.

4. Жидкостной экстракции

1. Используя стеклянную пипетку, добавьте 3 мл МТБЭ в высушенном метаноле остаточной (из раздела 3, шаге 6), вихрь 30 сек, добавить 750 мкл воды, то вихрь 10 сек на пробирку.
2. Спин ~ 200 мкг в течение 10 мин в центрифуге при комнатной температуре.
3. Аспирируйте 2,5 мл МТБЭ слоя (без попадания воды) и трансфер в чистом пробирку стекла.
   Примечание: Это очень важный шаг, так как различия здесь будут влиять на результаты. 2,5 мл МТБЭ должны быть тщательно декантируют из верхнего слоя, поскольку он позволяет фиксированный объем, который будет декантируют без пипетки водный слой ниже. Если объем образца в начале эксперимента была меньше указанного 100 мкл этого метода, масштабировать объем МТБЭ пропорционально отражать этот объем исходном образце.
4. Добавить 3 мл МТБЭ к оставшейся водной части образца, и вихрь 10 сек на пробирку.
5. Спин ~ 200мкг в течение 10 мин в центрифуге при комнатной температуре.
6. Аспирируйте 3 мл МТБЭ (без попадания воды) и смешать с МТБЭ трубки.
7. Концентрат оставшийся водный слой путем сушки в атмосфере _N2.
8. Повторно приостанавливать осадок в 100 мкл воды.
9. Добавить 400 мкл ледяного метанола в пробирку стекло, вихря кратко, а затем передать в микроцентрифужных трубки.
10. Оставьте при -80 ° С в течение 20-30 мин. Спин при 0 ° С в течение 15 мин при 18000 х г.
    Примечание: Рекомендуется поместить целую стойку образец в -80 ° C морозильник, поскольку это позволит любой оставшийся белок для осаждения в метаноле. Если -80 ° C морозильник не доступен, и другие варианты: хранение при -20 ° С, помещая образцы в сухом льду, или держать их в ведре со льдом. Важно, чтобы последовательно хранить образцы в холодной окружающей среде и при той же температуре, чтобы позволить осаждение.
11. Аспирируйте 450 мкл супернатанта и передачи вчистый микроцентрифужных трубки. Полностью высохнуть в вакуумной центробежного концентратора не более чем в 45 ° С. (Занимает около 1-2 ч).
12. Ресуспендируют высушенного супернатанта в 200 мкл 5% ацетонитрил / вода. Vortex кратко. Замораживание при -80 ° С.

5. Твердофазная Добыча

1. Сушат МТБЭ фракцию в атмосфере азота при 35 ° С с хорошей потоке азота (занимает около 10-15 мин).
2. После полного высыхания, остановить поток азота, и быстро ресуспендируют в 1 мл хлороформа (CHCl ₃₎ с помощью стеклянной пипетки. Vortex кратко.
   Примечание: Растворители, такие как CHCl ₃ имеют низкую вязкость. В пипетки, низкое поверхностное натяжение приводит к потере растворителя из пипетки. Рекомендуется, чтобы наконечник пипетки быть Предварительно смочите по меньшей мере дважды, чтобы позволить уравновешивание между растворителем является пипеткой и пространства в пипетки. Газонепроницаемый шприц также может быть использован, если доступно.
3. Настройка SPE вакуумный коллектор и NH ₂ SPE колонки для фракционирования.
4. Теплые образцы до комнатной температуры и всегда держать приостановлено в соответствии с устойчивым потоком N _2. Нагревания до комнатной температуры позволит липидов ресуспендирования и азот предотвращает окисление и полимеризацию липидов.
5. Вымойте и состояние SPE картридж 2x с 400 мкл гексана. Откажитесь отходов и заменить новой коллекции стеклянной трубки.
6. Добавить образец в колонку SPE, собирать течь через в стеклянных трубках.
7. Со стеклянной пипетки добавить 1 мл 2:01 CHCl _3: МПА, собирать течь через в тех же стеклянных трубок (это нейтральной фракции).
8. Высушите нейтральную фракцию под N _2, чтобы минимизировать окисление (занимает около 10-15 минут).
9. Со стеклянной пипетки добавить 1 мл 5%-ной уксусной кислоты в диэтиловом эфире, собирать течь через в новых стеклянных трубок (это Фракция жирных кислот).
10. Высушите долю жирных кислот под N _2, чтобы минимизировать окисление (занимает около 10-15 минут).
11. Используйте пластиковые советы, чтобы добавить 800 &# 181; л метанола в SPE картридже, и собирать проточные в 15 мл пластиковых конических труб (это доля фосфолипидов).
12. Передача фосфолипидов фракцию в 1,5 мл центрифужные пробирки. Высушите образцы с вакуумной центробежного концентратора при 45 ° C (занимает около 1-1,5 ч).
13. Ресуспендируют каждого из образцов из трех фракций в 200 мкл 100% метанола, вихря, и трансфер в AutoSampler флаконы с завинчивающейся крышкой для хранения.

6. Пример условий хранения

1. не хранить все образцы при -80 ° С до готовности для анализа прибора.
   Примечание: Извлеченные образцы, восстановленные в органическом растворителе может храниться при -20 ° С Однако это не рекомендуется, поскольку потенциальные метаболиты интерес будет деградировать при этой температуре. Хранение жидких азота также не рекомендуется, поскольку исследователи сообщали вопросы загрязнения, специальные флаконы для хранения необходимых, и есть отсутствие однородности в камере КАУпеть широкие температурные колебания.
2. Если объемы проб малы (<100 мкл) с помощью вставки в ампулах, чтобы предотвратить испарение растворителя в свободном пространстве во время хранения.
3. Избегайте замораживания-оттаивания образцов. Оттепель образцы только один раз, непосредственно перед анализом приборов. Повторные заморозки-тает привести к деградации образца.

7. Жидкие Условия хроматографии

1. С помощью C-18 2,1 мм х 50 мм (1,8 мкм) аналитической колонке с C-18 2,1 мм х 12,5 мм (5 мкм) защитной колонкой для анализа гидрофобную часть.
2. Установите температуру AutoSampler до 4   ° С, температура колонки 60   ° C, объем впрыска до 2 мкл и скорость потока до 0,25 мл / мин.
3. С помощью 0,1% муравьиной кислоты в воде в течение мобильная фаза А и 0,1% муравьиной кислоты в изопропаноле: ацетонитрил: вода (60:36:4) для подвижной фазы B.
4. Выполните следующую градиента профиль элюции: Началот 30% B, и увеличение на 70% B от 0 до 1 мин, затем увеличить до 100% В от 1 до 15 мин и удерживать в течение 5 мин, затем 5 мин 10% B промывки и 5 мин после запуска.
5. Используйте HILIC 2.1 мм х 50 мм (2,6 мкм) аналитическая колонка с защитной колонкой для анализа гидрофильную фракцию.
6. Установите температуру AutoSampler до 4   ° С, температура колонки 20   ° C, объем впрыска до 2 мкл и скорость потока до 0,5 мл / мин.
7. С помощью 50% ацетонитрила в 10 мМ ацетата аммония, рН 5,8 для подвижной фазы А и 90% ацетонитрила в 10 мМ ацетата аммония рН 5,8 для подвижной фазы B.
8. Выполните следующую градиента профиль элюции: Пуск при 100% В от 0 до 2 мин, затем снизится до 50% B от 2 до 15 мин, а затем 5 мин 0% мытья B и 10 мин после запуска.

Результаты

Весь метод подготовки образца проводили, как описано выше, и наиболее важными и / или соответствующие аспекты представлены ниже. Гидрофильных и гидрофобных внутренние стандарты вносили в объединенных пробах плазмы выполнять прямые сравнения внутренними стандартами и эндогенных метаболитов распространенности с использованием различных методов извлечения. Данные жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) анализировали с использованием качественного и количественного программное обеспечение и в результате превосходной восстановление и разделение обоих эндогенных соединений и внутренних стандартов. Рисунок 1 демонстрирует эффективность метода МТБЭ-SPE в извлечении оба стандарта липидов (A) и эндогенные соединения (б).

В общем, лучше экстракции и покрытие из метаболитов были получены сравнению с другими методами, такими как экстракция метанол, или "МТБЭ только 'экстракции, когда число ое особенности сравнивали с помощью качественного и количественного программное обеспечение следующих ЖХ-МС анализа. Например, при использовании только экстракции метанолом, изменение креатинина-D ₃ был 15,2%. Тем не менее, с МТБЭ ЛПЭ, это была снижена до 1,04% CV. Использование МТБЭ, воспроизводимость липидов и водных соединений были <8% и <5% соответственно, по сравнению с более простой экстракции метанолом в результате чего большего вариации 29% и 15%, соответственно, для липидов и водных соединений. Внутренние стандарты, используемые для контроля липидов извлечения - тестостерон-D _2, С17 керамиды, 15:00 PC и 17:00 ЧП увеличился на 26%, 200%, 100%, 400% соответственно по сравнению с использованием только метанол. Аналогичный рост были обнаружены жирных кислот внутренних стандартов и фосфатидилхолина и phosphotidylethanolamine эндогенных метаболитов. Другие эндогенные метаболиты, такие как сфингозины, керамиды, диацилглицеринов, триацилглицеринов, холестерина и сфингомиелина были не обнаруженос использованием метанола или были обнаружены в незначительных уровней. Однако эти эндогенные липиды легко обнаружить с использованием экстракции МТБЭ.

В нашем анализе по сравнению стандартные протоколы, следующие результаты были получены: Метанол осадки один привело 1851 метаболитов, метанол-этанол дала осадки 2073 метаболиты, МТБЭ с жидкостно-жидкостной экстракции дал 3125 и MTBE с жидкость-жидкость и твердофазной экстракции восстановленного 3806 метаболиты. Поэтому этот подход приводит к большему числу метаболитов добывается, скорее всего в связи с сокращением подавления ионов и чистых образцов предшествующих LC-MS.

2 демонстрирует эффективность разделения гидрофобных метаболитов в их соответствующих химических классов для более уверенного идентификации метаболитов. Существует минимальное перекрытие из соединений, определенных в трех фракций липидов следующих SPE. В поддержку, рисунке 3 показано,восстановление внутренних стандартов, показывающие, что ISTD были элюировали во фракции, связанной с их химического класса.

Образцы для контроля качества используются для оценки качества подготовки проб, для определения любых пакетных эффекты, когда несколько дней анализа необходимы для большого набора образцов, а также для мониторинга инструмент воспроизводимость. Хроматограммы изучаются на предмет того, что шипами в стандарты более чем на 90% восстановлены с массовой погрешностью менее ± 3 промилле и удержания временного окна менее ± 5%. Если эти критерии не выполняются, результаты отбрасываются и образцы переосмыслены. В случае периодического воздействия посредством чего смещение удержания наблюдается для одной партии, программное обеспечение для анализа данных может корректировать этот. Предварительно приготовленный партия объединенных пробах плазмы прошли пробоподготовки. Фракции затем суб-аликвоты в автосамплеров флаконы и хранили при -80 ° С для использования в мониторинг приборной услоTIONS всей каждого анализа проб. Таблица 1 показывает результаты этих шип-стандартов. Жирная кислота режима отрицательной ионизации фракция (данные не приведены в таблице) не был использован для анализа, так как% CV из шип в стандартах образца QC было больше, чем 10%. Таким образом, набор данных для этой фракции отбрасывали, а инструмент проверены и поддерживается. Таблица 2 показывает результаты эндогенных метаболитов в образцах трех различных дней пробоподготовки и тройные инъекций прибора. Эндогенные метаболиты в пробоподготовки образцов КК все воспроизводимые, означающее силу пробоподготовки, а также инструмент для инъекций воспроизводимость.

Когда шаги пробоподготовки должным образом не следуют, однако, ненадежные и противоречивые результаты. На рисунке 4 показаны результаты, когда белок осадки стадия способане следует, как указано. Три оператора, A, B, C и проводили ту же самую процедуру приготовлени образца на объединенных образцах плазмы. Оператор, а не пипеткой требуемое количество супернатанта согласно экспериментальному протоколу, а пипеткой> 1 мл для обоих стирок с некоторыми из гранул. Это не только приводит к увеличению числа ложных срабатываний для этой фракции, но повышенной изменчивости данных.

Хроматографический воспроизводимость данных можно видеть на рисунке 7. Пробах плазмы были получены в трех экземплярах на отдельные дни, используя осаждение белка, жидкостно-жидкостной экстракции, и твердофазной экстракции, как описано в данном протоколе. Каждая фракция была проанализирована с помощью хроматографического разделения, описанного в разделе 7 протокола. Образцы затем вводили в трех экземплярах на LC-MS для оценки инструмента и пробоподготовки воспроизводимость. Это согласуется перекрытия демонстрирует как Strengго воспроизводимости пробоподготовки когда приготовленной на три разные дни, а также от силы хроматографическим методом в производстве воспроизводимые результаты. Увеличение химического шума наблюдается для режима отрицательной ионизации фракции жирных кислот. Это может произойти из-за загрязняющих веществ в растворителях ЖХ-МС и может привести к противоречивых результатов количественного metabolomic. Поэтому были проанализированы только метаболиты, которые Элюированные до 9 мин.

При запуске длинные рабочих списков, потеря чувствительности и изменением концентрации буферных приборов может произойти с течением времени приводит к снижению интенсивности сигнала и времени удерживания смену. Если время удерживания изменение перекрытие составляет менее 5%, а изменение интенсивности сигнала меньше 10%, данные все еще в стандартных лабораторных пределах. Анализ программное обеспечение может использоваться для выравнивания и нормализации данных для коррекции инструмента и времени удерживания дрейфа. Однако, если изменение является LARGe, то причина должна быть определена. Как только это будет исправлено, образцы могут быть повторно проанализированы.

Рисунок 1. Избыток липидов ISTDs (а) и эндогенных метаболитов (B) следующие экстракции и хроматографии с обращенной фазой (RPC) ^12. Экстракцию проводили и Полученные образцы были разделены с использованием RPC и анализировали с помощью ЖХ-МС в положительном и отрицательном режиме ионизации. Эта цифра была изменена от Ян и др., журнал хроматографии А 1300, 217-226 (2013).

Рисунок 2. Сравнение МТБЭ-SPE фракций ^12. Метаболиты, выявленные в каждой фрдействие сравнивали для выявления величину перекрытия в SPE части преп. Цифры в диаграмме Венна отражает количество метаболитов, обнаруженных в каждой фракции. Здесь несовершеннолетнего перекрытие наблюдается среди трех фракций, представляющих успешное извлечение соединение и разделение класса метаболит во время стадии SPE. Эта цифра была изменена от Ян и др., журнал хроматографии А 1300, 217-226 (2013).

Рисунок 3. Восстановление ISTDs в долях с использованием метода МТБЭ-SPE ^12. Экстракцию проводили и Полученные образцы были разделены с использованием RPC и проанализированы с помощью LCMS в положительном и отрицательном режиме, как описано в тексте. Эта цифра была изменена от Ян и др., журнал хроматографии А 1300, 217-226 (2013).

Рисунок 4. Результаты от фракции осадка, подготовленного тремя операторами. Три образца подготовка операторов A, B, C и выполняется тот же шаг подготовки белка на пробах плазмы. Цифры в диаграмме Венна отражает количество метаболитов, обнаруженных каждым оператором. Операторы В и С пипеткой требуемое количество каждого протокола пробоподготовки в то время как оператор пипеткой весь супернатант и некоторые из гранул, что приводит к более чем 500 метаболитов, большинство из которых ложных срабатываний для этой конкретной фракции.

Рисунок 5. Формирование белка гранул во белка стадии осаждения <. / Сильный> (A) 100 мкл человеческой плазмы до образец препарата; (B) в плазме после добавления льда холодным метанолом (C) белок осадок, сформированный на нижней части трубки после центрифугирования при 0 ° С в течение 15 мин при 18000 х г.

Рисунок 6. Разделение гидрофильных и гидрофобных слоев при экстракции жидкость-жидкость (LLE) шага. Органический растворитель метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ) и воды были использованы для разделения гидрофильные и гидрофобные метаболиты. МТБЭ слой растворится неполярные соединения, и водный слой растворится полярные соединения (A) в плазме супернатант после удаления белка;. (B) в плазме после сушки в атмосфере азота; (C) в плазме после того МТБЭ; Ong> (D) добавление воды к плазме и МТБЭ; (E)-МТБЭ водный слой образуется после центрифугирования; (F) удаление верхнего слоя МТБЭ; (G) в основном гидрофильный слой, остающийся после удаления МТБЭ.

На рисунке 7. Хроматограммы фракций из выбранного набора данных. Подготовка образцов проводили на трех отдельных пробах плазмы КК и каждого образца вводили в трех экземплярах на приборе LC-MS. Представлял являются всего ионные хроматограммы образцах плазмы приобретенных с использованием параметров LC-MS, указанные в разделе 7 протокола метода. Хроматографический представление других биологических жидкостей будет варьироваться из-за различий в метаболита композиции.к "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Доля	Режим ионизации	Внутреннего стандарта	н	Средний пик Площадь	Площадь пика% CV
Водный	Положительный	Креатинин-D 3	31	2217311	3,8%
Обычный липидов	Положительный	Триглицерид-D 5	31	4837032	9,9%
		С17 Керамид	31	12736707	7,9%
Фосфолипид	Положительный	15:00 ПК	32	1248929	9,3%
		17:00 ЧП	32	517234	7,9%

Результаты Таблица 1. Контроля качества от шипами внутренних стандартов. Объединенные образцы плазмы от эмфиземы модели мыши набора данных были проанализированы, чтобы контролировать условия приборов на ежедневной основе для этого мульти-недельного исследования. Программное обеспечение Количественный анализ был использован для определения площадей пиков внутренними стандартами, (N = количество инструментов контроля качества инъекций).

DG (16:0 / 16:1 / 0:0) 2,9%

Доля	Режим ионизации	Эндогенные метаболиты	Средний пик Площадь	Площадь пика% CV
Водный	Положительный	Креатинин	2554574	2,3%
		Валин	3712151	3,3%
		Глюкоза	2669190	6,9%
Обычный липидов	Положительный	3-Dehydrosphinganine	226644	3,9%
		11301	8,2%
		DG (P-14: 0/18: 1)	364119	1.9%
Фосфолипид	Положительный	ПК (24:0 / 0:0)	27599	0,9%
		PC16: 0/22: 6)	2873326	4,5%
		ПИ (16:00 / 18:01)	112998	4,4%
Жирная кислота	Положительный	10-оксо-5 ,8-decadienoic кислота	1363284	2,3%
		16-оксо-гептадеканова кислота	83700
		2-метил валериановой кислоты	285782	5,7%
Жирная кислота	Отрицательный	10-гидрокси-8-октадеценовой кислоты	10042	4,9%
		(R)-laballenic кислоты	173929	6,5%
		2-кето валериановой кислоты	35488	6,0%

Результаты Таблица 2. Контроля качества от эндогенных метаболитов. Пуле образцы плазмы от набора данных заболеваний человека были проанализированы, чтобы контролировать пробоподготовки воспроизводимость в отдельные дни. Образцы готовили в трех экземплярах в течение трех дней, (п = 9 преп инъекции КК).

Обсуждение

Одна из целей клинических metabolomic исследований является выявление изменений в метаболома, связанной с заболеванием или лечения. Поэтому образец методы подготовки должны быть надежными, последовательными, и передаваться от специалиста, чтобы техник и от лаборатории к лаборатории ^22. В результате данные должны быть представитель образца, а выявленные изменения должны отражать набор образцов, а не ошибок подготовки образцов. Поэтому точной пипетки, правильная температура, эффективная декантирование несмешивающихся слоев, сушки в атмосфере азота, а также использование одних и тех же марок и размеров посуды и советы необходимы.

В ходе осаждения белка шагом, очень важно, чтобы то же самое количество раствора декантируют из каждой таблетки. Это уменьшает изменение объема и как таковой уменьшает изменение выборочных данных. Эта стадия осаждения белка необходимо для metabolomic исследований и не может быть пропущен, поскольку он удаляет белка изобразцы до малого молекулы профилирования анализ на масс-спектрометре. Он устраняет болезнетворные микроорганизмы и большие макромолекулы, и релизы связан метаболитов из белков ^7. Отсутствие накопления белка в образцах расширяет срок службы колонку ВЭЖХ и повышает точность и качество результатов. Фиг.5 представляет собой изображение белка гранул, образованной при выполнении этой методики в образцах плазмы. Это позволяет обнаружение малых молекул, повышает ионную изобилие и снижает матричные эффекты от белков в образце. Кроме того, поскольку предполагается, что все белки будут удалены на этой стадии, аминокислоты, которые обнаружены во время анализа ЖХ-МС будет происходить из метаболических изменений, а не от распада белка.

Стадия экстракции жидкость-жидкость имеет решающее значение, так как это отделяет гидрофильные и гидрофобные метаболиты в двух несмешивающихся слоев. Рисунок 6 показывает процедуру LLE и репутациюставление слоя LLE. Неправильное разделение двух слоев приводит к метаболитов либо потери или элюент в обеих фракциях. Тщательное применение этой стадии снижает количество гидрофильных соединений, которые появляются в гидрофобной фракции. Результаты этих соединений стать ненадежным, так как это не может быть определено, какие фракции содержат репрезентативные результаты. Если все сделано правильно, метаболит перекрытия уменьшается.

Для предотвращения окислительной деструкции, особенно в липидах, но и в малых молекул, которые могут содержать тиольные группы, например, воздействие кислорода должно быть сведено к минимуму. Таким образом, эта процедура всегда выполняется в атмосфере азота, чтобы уменьшить / предотвратить окисление липида или тиоловых соединений. Кроме того, передача образца и / или решения является быстрое (в течение первой минуты), чтобы уменьшить воздействие кислорода, то образцы быстро помещают в постоянном токе азота сушить вниз. После высыхания они немедленноленно ресуспендировали в 100% метанола для рассмотренных выше причин.

Лаборатории могут извлечь выгоду из этого всеобъемлющего метода в ряде направлений; Исследователи хотят выделить один класс соединений может выбрать часть метода, который наилучшим образом отвечает их потребностям. Те, кто стремится выполнять только осаждение белков для получения пул метаболитов может сделать это. Если гидрофильные метаболиты желательны, например, многих фармацевтических препаратов, аминокислот, сахаров и, или если только гидрофобные метаболиты желании, такие как триглицериды, эпоксиды, жирорастворимых витаминов, а также фосфолипиды, например, то исследователи могут выполнить жидкость-жидкостную экстракцию шаг после осаждения белков и отбросить нежелательные фракции. Исследователи, которые требуют дальнейшего Более подробную классификацию гидрофобных соединений (нейтральные липиды, жирные кислоты, и фосфолипидов) может перейти к стадии фракционировани.

Соображения хранения важны в maintainiнг жизнеспособности образцов для последующего анализа. Если образцы хранятся неправильно, деградация или распад может произойти. В идеале, образцы должны храниться в винтовой резьбой желтые бутылочки от света для предотвращения деградации светочувствительных видов. Образцы также следует хранить в замороженном виде при -80 ° C для предотвращения деградации метаболита ^23-25. Хотя это и не обсуждалось здесь подробно, образцы всегда хранили при 4 ° С в течение автосамплера лоток ЖХ-МС анализа. Это гарантирует, что все образцы хранятся при постоянной температуре и что изменения в температуре окружающей среды не оказывают влияния на вязкость, растворимость, или стабильность образцов. Рекомендуется ручные аспекты этой процедуры, такие как ЛПЭ и SPE, практиковаться, чтобы получить уверенность и комфорт с этапов.

Существует несколько ограничений для этой техники. Discreet разделение гидрофобных и гидрофильных метаболитов не гарантирован как некоторые соединения будут наследуютсявидимому распределяется в обеих фракциях из-за их химического состава и зарядового состояния. Кроме того, как показано на фиг.4, неправильной техники во время стадии экстракции белка гранул может привести к плохой воспроизводимости метаболита в обоих образцов и контроль качества. Это влияет на статистику, особенно в небольших наборов данных, потому что статистическая мощность не доступен. Поэтому очень важно, чтобы этот шаг выполняется точно так же каждый раз для каждого образца. Еще одним ограничением является время. Хотя есть точки остановки на протяжении всего этого протокола, где образцы могут быть заморожены и подготовительные продолжения на следующий день, весь день должно быть выделено для выполнения этой процедуры. В-третьих, не каждый соединение в биологическом образце могут быть оценены для подавления ионов. Так как это не представляется возможным определить, как матрица влияет каждого отдельного метаболита, нынешний вариант оценить внутренние стандарты, которые теоретически имитируют некоторые классы endogenouсек метаболиты. Наконец, абсолютные идентификации не может быть выполнена только с помощью этого метода. Тандем МС в сотрудничестве с поисками и стандартов баз данных, необходимых для абсолютного идентификации метаболита.

Важной частью метаболомики является идентификация соединений. Хотя это и не обсуждалось здесь подробно, образцы контроля качества анализировали с помощью ЖХ-МС. Несколько подготовки образца заготовки и инструмента заготовки были подготовлены для использования в качестве вычитания фона для снижения скорости ложных срабатываний от загрязнений, в результате чего более надежных метаболитов хитов. После этой стадии количество "молекулярных характеристик" были сгруппированы на основе т / г, время удерживания, соотношение изотопов и аддуктов для получения списка действительных соединений. Хотя список соединений значительно снижается, результаты были более надежными, поскольку они не были основаны на нескольких аддуктов из того же соединения. Полный метод носит комплексный характер и позволяет isolatioн гидрофобных метаболитов, таких как нейтральные липиды, фосфолипиды, жирные кислоты, триглицеридов и стероидов, в то же время выделения гидрофильных классы в водной фракции, из которых эйкозаноидов, сахара, флавоноиды, и аминокислоты были идентифицированы ^{12, 26.}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
Methanol	Fisher Scientific	L-6815
Chloroform	Fisher Scientific	C606-1
Hexane	Sigma Aldrich	34859
Acetic acid	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether	J.T. Baker	9042-03
Isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	34965-2.5L
Water	Honeywell Burdick Jackson	365-4
OA-SYS heating system	Organomation Associates, Inc		Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C
12-position vacuum manifold	Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges	Phenomenex	8B-S009-EAK
Glass pipette tips	Fisher Scientific	13-678-20C	Used to transfer sample to SPE column
Plastic pipette tips	USA Scientific	1182-1830	Used when glass tips are not necessary
Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
Graduated glass pipets	Fisher Scientific	13-678-27B	Used to transfer organic solvents during sample prep
Pyrex glass culture tubes	Corning Incorporated	99499-16X	Used to store aqueous and lipid fractions until the next step
Autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0545
Snap cap vials for autosampler vials	Agilent Technologies	5182-0541
Glass inserts	Agilent Technologies	5183-2085	Used for small sample volumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.06.00	Used to monitor retention times and pressure curves
Mass Hunter Quantitative Analysis software	Agilent Technologies	Version B.05.02	Used to analyze quality control and sample data
Mass Profiler Professional software	Agilent Technologies	Version B.12.50	Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification