-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

Resumo

Descreve-se a utilização de um ensaio de inibição da neuraminidase à base de fluorescência fenotípica para avaliar a susceptibilidade de vírus influenza A e B para a classe dos inibidores da neuraminidase de medicamentos antivirais.

Resumo

Os neuraminidase (NA) inibidores são a única classe de medicamentos antivirais aprovados para o tratamento e profilaxia da gripe, que são eficazes contra estirpes circulantes. Além de sua utilização no tratamento da gripe sazonal, os inibidores de NA foram armazenadas por um número de países para uso em caso de uma pandemia. Por conseguinte, é importante controlar a susceptibilidade de circulação de vírus da gripe para esta classe de medicamentos antivirais. Existem diferentes tipos de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a susceptibilidade dos vírus da gripe para os inibidores de NA, mas os ensaios de inibição da enzima utilizando quer um substrato fluorescente ou um substrato quimioluminescente são as mais amplamente utilizadas e recomendadas. Este protocolo descreve a utilização de um ensaio baseado em fluorescência para avaliar a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA. O ensaio baseia-se na clivagem do enzima de NA 2 '- (4-Metilumbeliferil) -α-D- ácido acetilneuramínico N (Muñana) Substrato para libertar o produto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU). Por conseguinte, o efeito inibidor de um inibidor da NA do vírus da gripe NA é determinado com base na concentração do inibidor de NA, que é necessária para reduzir 50% da actividade de NA, dada como um valor de IC _50.

Introdução

A hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os dois principais glicoproteínas de superfície de vírus influenza A e B. HA liga-se ao ácido siálico-galactose de glicoproteínas da superfície celular ou glicolípidos, ao passo que o NA liberta vírus por clivagem do ácido siálico da galactose na superfície da célula ^1. Os inibidores de NA são uma classe de antivirais da gripe que foram racionalmente desenhados para se ligarem firmemente ao local activo NA enzimática, impedindo assim a libertação e dispersão de descendência do vírus. Oseltamivir e zanamivir são dois inibidores de NA que tenham sido aprovados em muitos países do mundo para o tratamento e profilaxia da gripe. Nos últimos anos, dois inibidores adicionais de NA, peramivir e laninamivir, foram aprovados para uso em um número limitado de países. Triagem dos vírus da gripe para a susceptibilidade a inibidores de NA e a identificação de mutações que conferem resistência são importantes para determinar e monitorizar a effectiveness desta classe de medicamentos antivirais.

Nos últimos 16 anos, o ensaio de inibição do NA-base de fluorescência foi realizada rotineiramente na OMS para Referência e Pesquisa sobre Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) para monitorar a tendência de mudança de susceptibilidade antiviral entre circulante vírus da gripe. Anualmente, mais de 2.000 vírus da gripe são testados para a susceptibilidade antiviral. Na maior parte das estações de influenza,> 98% dos vírus são sensíveis a todos os quatro inibidores de NA ^{2, 3, 4,} embora durante a temporada de gripe norte hemisfério 2007-2008, houve um aumento no número de ex vírus sazonais A (H1N1) que tinha susceptibilidade reduzida a oseltamivir ^5. Este grupo de vírus, o qual continha o H275Y substituição de aminoácidos de NA, se espalhar para o resto do mundo pelo final de 2008, fazendo com que o oseltamivir inappropricomeu globalmente para o tratamento do vírus. A grande maioria dos circulando influenza B, influenza A (H3N2), e vírus influenza A (H1N1) estirpes pdm09 são susceptíveis a oseltamivir, embora aglomerados comunidade de A (H1N1) variantes pdm09 contendo o H275Y substituição de aminoácidos de NA que confere a oseltamivir reduzida e peramivir susceptibilidade, foram relatadas em várias partes do mundo, ^{6, 7.}

Devido à necessidade de um tulo suficientemente elevado de vírus, amostras clínicas (incluindo animais lavagens nasais) devem ser passadas em qualquer cultura de células ou ovos embrionados de galinha anteriores para os testes de susceptibilidade antiviral. O ensaio de inibição do NA descrito neste artigo pode ser dividida em três secções:

Determinar a gama linear para o produto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU), em especial um fluorómetro
Devido às diferenças inerentes entre fluorómetros, tele gama linear para o produto final fluorescente, 4-MU, e a unidade de fluoresccia relativa (RFU), é necessário estabelecer. Uma vez que o intervalo linear para 4-MU está estabelecida, o sinal de alvo ideal é seleccionado, para o qual a concentração dos vírus influenza é ajustado no ensaio de actividade de NA. Depois de concluído por um fluorímetro particular, este não precisa ser repetido.

A determinação da actividade de NA dos vírus
O ensaio de actividade de NA é um ensaio simples que envolve a adição do 2 '- (4-metil) -D- -α ácido N-acetilneuramínico (Muñana) substrato de vírus diluído em série. A quantidade de produto final fluorescente 4-MU gerado a partir da clivagem de Muñana pela AN é medido utilizando um fluorómetro. A diluição do vírus adequado para usar no ensaio de inibição do NA é seleccionado através da representação gráfica unidades de fluorescência contra a diluição de vírus. A partir da curva sigmoidal produzido, o ponto médio da secção linear deve corresponder aa gama linear de 4-MU do fluorómetro determinado na secção 1 e irá informar a concentração apropriada de vírus para ser utilizado na secção 3.

Avaliar a susceptibilidade do vírus para inibidores de NA, utilizando o ensaio de inibição do NA
Para avaliar a susceptibilidade do vírus a um inibidor da NA em particular, vírus na diluição determinado no ponto 2, foram incubados com uma gama de concentrações de inibidor de NA. Após uma incubação subsequente com Muñana, o 4-MU gerado por vírus não inibidas é medido em RFU pelo fluorómetro. O efeito inibidor do inibidor da NA sobre a actividade da enzima de NA de um vírus é calculado de acordo com a concentração do inibidor de NA requerida para reduzir 50% da actividade de NA, dada como um valor de IC _50.

Protocolo

1. Determinar a faixa linear de Fluorescent Produto 4-MU em um Fluorometer

1. Preparar 10 ml de solução 6,4 mM de estoque 4-MU por dissolução de 11,3 mg de 4-MU em 5 mL de etanol absoluto. Adiciona-se 5 mL de NaCl a 0,9% (w / v) à solução de estoque para perfazer 10 mL. Preparar uma solução de trabalho 640 uM por diluição de 1 mL de 6,4 mM de 4-MU em 9 mL de 1x tampão de ensaio (33,3 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanossulf único (MES) e 4 mM _{de CaCl2,} pH 6,5).
   NOTA: Prepara-se o tampão de ensaio pela adição de 2x 13 g de MES e 8 ml de 1 M CaCl _2-992 mL de água destilada. Ajustar o pH para 6,5 ​​por meio de 10 M de NaOH. Filtra-se o tampão através de um filtro de acetato de celulose esterilizado de tamanho de poros de 0,2 um. Cuidado! O hidróxido de sódio é cáustico e pode causar queimaduras químicas na pele e olhos. Garantir que o equipamento de protecção individual completo é gasto.
2. Preparar 5 ml de uma gama de concentrações de 4-MU (isto é, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 & #181; M e 320? M) através de uma diluição em série de duas vezes de 640 uM 4-MU utilizando tamp de ensaio 1x.
3. Dispensar 50? L de cada diluio em sie de 4-MU (isto é, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM e 640 uM) (dois poços por diluição) em uma solução límpida, 96- bem placa de fundo plano e 50 uL de tampão de ensaio 1x nas cavidades restantes (que servem como peças em bruto para medir sinais de fundo).
   NOTA: As concentrações finais de 4-MU no volume de reacção (50 ul 4-MU + 50 uL de 300 uM Muñana) é 2,5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM e 320 uM .
4. Prepara-se uma solução de estoque 2,5 mM MUNANA através da reconstituição de 25 mg de Muñana em 20 ml de água destilada. Misture 0,72 mL de Muñana 2,5 mM com 5,28 mL de 1x tampão de ensaio para se obter uma solução de trabalho (volume suficiente para uma placa) 300 uM Muñana. Cobrir o tubo contendo o Muñana Trabalhando 300 uMg de solução com folha de alumínio e mantê-lo em gelo a menos que utilizado imediatamente. Descarte todos os materiais que sobraram.
   NOTA: A solução de estoque 2,5 mM MUNANA pode ser armazenado a -20 ° C durante 1 mês e deve ser usada dentro de um ciclo de congelamento / descongelamento. Os 4-MU soluções e Muñana são sensíveis à luz e deve ser protegido contra a exposição à luz prolongada.
5. Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana a cada poço, bata levemente para misturar e incubar a 37 ° C durante 30 min. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação.
   NOTA: Este passo é para ter em conta a fluorescência de fundo no ensaio de inibição de NA.
6. Preparar a solução de paragem através da mistura de 11 mL de etanol absoluto com 2,225 mL de NaOH 0,824 M (volume suficiente para uma placa).
7. Adicionar 100 uL de solução de paragem a cada poço para parar a reacção e bata suavemente para misturar.
8. Ler a placa utilizando um fluoretro com um ajuste de comprimento de onda de excitação de 355 nm e um ajuste do comprimento de onda de emissão de 460 nm, como per as instruções do fabricante.
9. Calcule a média do sinal de fundo usando sinais de fluorescência a partir de todos os poços não contendo 4-MU. Subtrair este sinal média de fundo de cada uma das cavidades contendo 4-MU e calcular os sinais médios (RFU) para cada concentração de 4-MU. Traça-se a curva padrão de RFU em função da concentração de 4-MU (M), como se mostra na Figura 1a; uma secção linear estreita-se da curva é mostrado na Figura 1b.
10. Visualizar a trama de RFU contra 4-MU concentração (uM) para determinar a gama linear e o sinal de alvo ideal; o intervalo linear é onde o sinal de fluorescência aumenta na proporção do aumento das concentrações de o 4-MU no terreno, enquanto o sinal de alvo ideal é uma concentração arbitrária 4-MU dentro da gama linear.
    NOTA: O intervalo linear e o sinal de alvo ideal são específicos do fluorómetro. Por exemplo, o fluorímetro no Melbourne WHOCCRRI tem uma gama linear de dois0,5-40 uM 4-MU e um sinal de alvo óptima de ~ 30? M de 4-MU, o que corresponde a ~ 1500 RFU.

2. Determinação da Actividade de NA dos vírus

NOTA: Os vírus da gripe são cultivadas a títulos suficientes no rim Madin-Darby Canine (MDCK) ou ovos de galinha embrionados ^8.

1. Dispensar 120 uL por poço de vírus influenza em cultura não diluídos em coluna 1 e 60? L de tamp de ensaio 1x contendo 0,1% de NP-40 para os restantes 11 colunas de um 96 poços, a placa de fundo em U.
2. Serialmente executar diluição de duas vezes dos vírus ao longo da placa (isto é, a transferência de 60 uL da coluna 1 para a coluna 2 e assim por diante, até a coluna 11) utilizando uma pipeta multicanal, deixando coluna 12 como um branco contendo tampão de ensaio única 1x.
3. Transferir 50 uL de cada um dos poços (vírus diluído em branco) em uma de 96 cavidades, placa clara, de fundo plano.
   NOTA: Não é necessário cpontas de pipeta hange se materiais são transferidos de coluna através de 12 para a coluna 1.
4. Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana (preparado de acordo com o passo 1.4) por poço e bata levemente a placa para misturar. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação.
5. Adicionar 100 uL de solução de paragem (preparado de acordo com o passo 1.6) por poço para terminar a reacção e bata levemente a placa para misturar.
6. Leia a placa usando um fluorímetro.
   1. Usar uma configuração de comprimento de onda de excitação de 355 nm e um ajuste do comprimento de onda de emissão de 460 nm.
7. Determinar o sinal de média de fundo com base nas leituras de fluorescência em coluna 12 e subtrair o sinal de média de fundo de cada poço. Traçar um gráfico da RFU contra diluições de vírus.
   NOTA: Os valores de fundo para 100 Muñana uM no WHOCCRRI Melbourne estão tipicamente entre 50 e 120 RFU, mas estes irão diferir dependendo da bei fluorómetrong utilizado.
8. Ver a trama de RFU contra diluições de vírus para determinar o ponto médio da secção linear da curva para cada vírus (Figura 2). Usar o sinal de alvo óptima (determinado no passo 1) como ponto de referência.
   NOTA: Este deve corresponder com a gama linear de 4-MU do fluorómetro determinado na secção 1 e vai proporcionar a concentração apropriada de vírus para ser utilizado na secção 3.

3. avaliar a susceptibilidade do vírus para NA NA Inibidores Utilizando o Ensaio de Inibição

1. Preparar stocks mestres de inibidores de NA em concentrações de 300 uM.
   1. Preparar 300 uM zanamivir (peso molecular, PM = 332,32 g / mol) por dissolução de 5,0 mg de zanamivir em 50 mL de 2x tampão de ensaio (MES 66,6 mM e 8 mM _{de CaCl2,} pH 6,5).
   2. Preparar 300 uM de oseltamivir carboxilato (D-tartarato; PM = 386,44 g / mol) por dissolução de 5,8 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x.
   3. Preparar300 uM peramivir tri-hidrato de (PM = 382,45 g / mol) por dissolução de 5,7 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x.
   4. Preparar 300 uM laninamivir (PM = 346,34 g / mol) por dissolução de 5,2 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x.
      NOTA: Os stocks mestres inibidor de NA podem ser armazenadas a -20 ° C durante 12 meses. Verificar o PM dos inibidores de NA para garantir os pesos e volumes correctos são utilizados na reconstituição. O carboxilato de oseltamivir é o composto activo do pró-fármaco fosfato de oseltamivir. Portanto, apenas o carboxilato de oseltamivir deve ser utilizado no ensaio de inibição de NA.
2. A partir dos stocks mestres, preparar stocks de dez diluições em série de inibidores de NA em 50 tubos de centrífuga mL trabalhando em concentrações de 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM e 30.000 nM no ensaio 2x tampão MES (66,6 mM e 8 mM _{de CaCl2,} pH 6,5); isto é para utilização em vários ensaios.
   NOTA: As concentrações finais dos inibidores de NA na reacção volume (50 ul de diluição de vírus + 50 uL de inibidor de NA + 50 uL de 300 uM Muñana) são de 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 10.000 nM, respectivamente. A concentração final não inclui os 100 pL de solução de paragem. Armazenar todos os inibidores de diluições de NA a 2-8 ° C. O prazo de validade é a mesma que a dos stocks mestre.
3. Preparar as diluies de vus em tamp de ensaio 1x contendo 0,1% de NP-40 surfactante num bloco de 96 poços profundos. A utilização de diluições de vírus com base nos resultados do ensaio de actividade de NA derivados da secção 2. Utilizar um volume total de 2 mL por vírus a testar quatro inibidores de NA.
   NOTA: Preparar duas cavidades (1 mL por poço) por vírus em um bloco de 96 poços profundos. Exemplos de diluições de vírus para o vírus 1, 2, e 3 são mostrados na Tabela 1.
4. Dispensar o volume necessário de inibidores de NA (preparados de acordo com o passo 3.2) em um reservatório 8 de poços profundos. A partir daí, dispensar 50? L de inibidores de NA em diluições que variaram entre 0 nM (2x ensaio bpode ser prejudicado apenas) a 30.000 nM em filas A a H em um de 96 poços, a placa de clara, de fundo plano.
   NOTA: A disposição da placa está ilustrado na Figura 3.
5. Adicionar 50 ul de vírus diluído de teste por poço para colunas 1-11 e 50 por po de tamp de ensaio 1x apenas para a coluna 12. Bater levemente a placa para misturar e incubar à temperatura ambiente durante 45 min. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação.
6. Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana (preparado de acordo com o passo 1.4) por poço e bata levemente a placa para misturar. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação.
7. Adicionar 100 uL de solução de paragem (preparado de acordo com o passo 1.6) a cada poço e bata levemente a placa para misturar.
8. Leia a placa usando um fluorímetro.
   1. Usar um comprimento de onda de excitação de 355 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm, como descrito anteriormente.

4. Cálculo doOs valores de _IC50

NOTA: O v1.2 JASPR é o software de ajuste de curva, que permite o cálculo de valores de _IC50. O software foi desenvolvido pela Divisão de Influenza do CDC, Atlanta, EUA. O software utiliza a equação: V = V _max x (1 - ([I] / (K _i + [I]))), em que _Vmax é a taxa máxima de metabolismo, [I] é a concentração de inibidor, V seja a resposta a ser inibida, e _Ki é a _IC50 para a curva de inibição.

1. Copiar e colar os dados brutos produzidos pela fluorómetro para uma folha de cálculo em um formato de placa de 12-coluna (de 96 poços), começando com a célula A1.
   NOTA: Raw dados de cada placa posterior deve ser escalonada por um linha vazia. Se cada um dos vírus foi testada contra os quatro inibidores de NA, colar os dados brutos em um conjunto de quatro (com uma linha vazia entre cada placa).
2. Abra o software de adaptação e click na guia "Experiment". Escolha "Alternativa 2-droga Fluoro 11 amostras."
3. Clique na aba "Opções" e marque "gerar gráficos."
4. Clique em "Opções" novamente e clique na aba "New Key". Salve o "inhibition_key" arquivo .csv na mesma pasta que o arquivo de planilha de dados brutos.
5. No arquivo inhibition_key, listar todos os nomes de amostra abaixo da ID. Cada nome da amostra deve ser exclusivo.
6. Se quatro inibidores de NA foram testados, inserir espaços para duas fileiras adicionais abaixo oseltamivir e digitar "Peramivir" e "laninamivir." Salve as alterações feitas no arquivo inhibition_key.
7. Voltar ao "jaspr v 1.2-A inibição ajuste de curva" janela e selecione o arquivo de dados brutos como o "Arquivo Experiment" e inhibition_key como o "Arquivo Key." Executar a análise. Salve os resultados em formatos .csv e .pdf.
   NOTA: O software irá traçar automaticamente uma curva de inibição (RFU açaínst NA concentrações de inibidor), como mostrado na Figura 4. O programa também calcula os valores de _IC50 para cada um dos vírus contra um indivíduo NA inibidor (Figura 4). Além disso, JASPR apresenta os valores de IC ₅₀ e o fundo de sinal-para-(S / B) proporção em formato de folha de cálculo. Os valores de fundo podem diferir de laboratório para laboratório, dependendo do fluorímetro usado. No Melbourne WHOCCRRI, o fundo valores para a gama Muñana 100 uM 50-120 RFU. Para um valor confiável _IC50, é preferida uma razão de S / B de ≥10, embora uma proporção de menos do que 10 ainda é aceitável, em especial para os vírus mutantes que têm uma actividade muito baixa de NA.
8. Inspeccionar os valores de IC ₅₀ e as formas de curvas geradas pelo software. Todos os pontos de dados deve cair sobre ou perto da curva; se não o fizerem, repetir o ensaio de inibição NA.
   NOTA: Para vírus que mostram anormalmente elevados valores de IC _50, o ensaio deve ser de repetiçãoed para confirmar o resultado.

Resultados

Usando as diretrizes para relatórios padronizados do grupo de trabalho da OMS para vigilância da gripe Susceptibilidade Antiviral ^9, a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA são reportadas usando as condições inibição normal (NI), a inibição reduzida (RI), e inibição altamente reduzida (HRI) . NI vírus são aqueles com valores de IC ₅₀ inferior a 10 vezes em comparação com a referência mediano de IC ₅₀ para os vírus da gripe A (ou menos do que cinco vezes a presença de vírus da gripe B). RI vírus são aqueles com valores de _IC50 entre 10 e 100 vezes acima da mediana de referência de IC ₅₀ para os vírus da gripe A (ou 5- e 50-vezes superior para influenza B). HRI vírus são aqueles com valores de _IC50 de 100 vezes acima da mediana de referência de IC ₅₀ para os vírus influenza A (ou acima de 50 vezes para o vírus da gripe B); ver Tabela 2.

A referência mediana valores de IC ₅₀ para A (H1N1) pdm09, A (H3N2) e vírus B Yamagata / B Victoria são calculados e atualizados anualmente no Melbourne WHOCCRRI para refletir pequenas alterações nos valores IC ₅₀ de circulantes estirpes de gripe para os inibidores de NA (Tabela 3). Os valores de _IC50 médios em vírus influenza A (H1N1) virus pdm09 são quase o mesmo entre os quatro inibidores de NA, mas o zanamivir mediana e laninamivir valores de _IC50 para os vírus A (H3N2) são de 2 a 4 vezes mais elevada em comparação com o oseltamivir e peramivir valores de IC ₅₀ (Tabela 3). O oseltamivir mediana valor de IC ₅₀ para os vírus da gripe B é geralmente de 5 a 10 vezes maior do que o zanamivir, peramivir, e laninamivir valores de IC ₅₀ (Tabela 3).

O ensaio de inibição do NA é um ensaio fenotípico que não fornece informações sobre a alterações assoc genéticaciado a RI ou HRI. Portanto, é importante que a análise genética é realizada de acordo com a identificação de vírus ou com RI HRI. No Melbourne WHOCCRRI, o gene de NA de variantes é analisado utilizando sequenciação de Sanger e piro-sequenciação. Uma lista representativa de substituições de aminoácidos que podem ser encontrados no gene de NA dos vírus variantes com RI e HRI é apresentado na Tabela 4. Uma lista mais completa de substituies de aminoidos que podem alterar a susceptibilidade NAI também está disponível no website da OMS ^10.

Figura 1: RFU em função da concentração de 4-MU. (A) Curva Padrão de RFU contra 4-MU concentração (jiM). A caixa a tracejado mostra a gama linear de 4-MU para o fluorómetro. Os sinais de fluorescência acima do intervalo linear pode ser saturado, e, portanto, nenhum sas alterações na fluorescência shopping não pode ser detectado pelo fluorómetro. (B) a secção linear plano da curva padr da Figura 1a para a identificação do "sinal de alvo ideal." O fluorómetro no Melbourne WHOCCRRI tem uma gama linear de 2,5-40 uM 4-MU e um sinal de alvo óptima de ~ 30? M de 4-MU, o que corresponde a ~ 1500 RFU. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo das curvas de vírus da gripe de actividade de NA. O valor médio de fundo 50,61 RFU foi subtraída de cada ponto de diluição sobre as curvas de actividade de NA. As setas indicam a diluição de vírus adequado para usar no ensaio de inibição de NA para cada vírus. Para preparação mais fácilaration de diluições de vírus, pode-se escolher para efectuar uma diluição 1/100 para VÍRUS 3 em vez de uma diluição de 1/96. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: esquema Placa para a configuração do ensaio de inibição do NA. Cada placa inclui a última coluna, que actua como um controlo negativo que não contém vírus mas tampão de ensaio única 1x (AB), inibidor da NA, Muñana, e solução de paragem. NOTA: JASPR utiliza leituras da coluna 12 de cada uma das placas para determinar o sinal do branco média utilizados no cálculo dos valores de IC _50. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de uma curva de inibição e o valor de IC ₅₀ de um vírus pdm09 A (H1N1), A / Perth / 82/2015. O software JASPR apresenta a curva de inibição de fluorescência (RFU) contra o aumento da concentração (nM) do inibidor da NA, com cada ponto de ajuste no interior da curva. Com base na curva de inibição, o valor de _IC50 é determinado como a concentração de inibidor de NA para reduzir 50% da actividade de NA do vírus. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vírus	diluição de vírus necessária	1x volume de tampão de ensaio (? L)	Surfactante-ampères-NP-40 (10%) (ml)	volume de vírus (mL)
1	1/20	940	10	50
2	1/40	965	10	25
3	1/100	890	10	10

Tabela 1: Preparação de diluições de vírus para o vírus 1, 2, e 3 no ensaio de inibição de NA.

Tipo de Vírus / subtipo / linhagem	inibição normal	inibição reduzida	inibição altamente reduzida
	(NI)	(RI)	(HRI)
A (H1N1) pdm09	<10 dobra	10-100 vezes	> 100 vezes
A (H3N2)	&# 60; 10 dobra	10-100 vezes	> 100 vezes
B Yamagata e B Victoria	<5 dobra	5-50 dobra	> 50 dobra

Tabela 2: O Grupo de Trabalho Antiviral OMS recomenda orientações para a classificação de susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA.

Tipo de Vírus / subtipo / linhagem	N	zanamivir	oseltamivir	peramivir	laninamivir
		Mediana (gama) IC 50 nM	Mediana (gama) IC 50 nM	Mediana (gama) IC 50 nM	Mediana (gama) IC 50 nM
A (H1N1) pdm09	1.326	0,42 (0,1-3,43)	0,36 (0,01-3,48)	0,19 (0,07-1,60)	0,55 (0,05-2,29)
A (H3N2)	1.654	0,9 (0,11-4,0)	0,38 (0,01-3,65)	0,33 (0,12-3,06)	1,38 (0,01-9,38)
B Yamagata e B Victoria	1.115	2.2 (1,24-10,72)	15,12 (2,39-70,75)	1,36 (0,57-6,67)	2,89 (1,62-9,15)

Tabela 3: Mediana _IC50 e _IC50 gama de inibição normal (NI) vírus de 2015 derivada no CCRRI OMS, Melbourne.

substituição de aminoácido	Tipo / subtipo / linhagem	IC 50 dobra-co mudançampared para referenciar medianos valores de IC 50.
		zanamivir	oseltamivir	peramivir	laninamivir
H275Y	A (H1N1) pdm09	1	557 (HRI)	123 (HRI)	2
E119V	A (H3N2)	1	63 (RI)	1	1
H134Y	B Victoria	1	4	76 (HRI)	2
N151T	B Victoria	4	4	42 (HRI)	1
G104E	B Victoria	1220 (HRI)	87 (HRI)	17724 (HRI)	701 (HRI)
E105K	B Victoria	3	5 (RI)	59 (HRI)	2
I222T	B Victoria	2	7 (RI)	8 (RI)	3
H273Y	B Yamagata	1	230 (HRI)	377 (HRI)	2
D197N	B Yamagata	4	7 (RI)	32 (RI)	3

Quadro 4: Lista representativa de substituições de aminoácidos ligados à inibição reduzida (RI) ou inibição altamente reduzida (HRI) de inibidores de NA.

Problema	Razões possíveis)	Solução (s)
Não ou baixa atividade NA	Nenhum vírus estava presente ou baixo rendimento do vírus.	Amostra clínica, devem ser cultivados em linhas de células (isto é, células de rim de Madin-Darby Canine) ou em ovos de galinha embrionadospara uma carga mais elevada de vírus para utilização no ensaio de inibição de NA.
	Alguns vírus mutantes têm extremamente baixa atividade NA apesar de alta carga de vírus.	Utilizar a concentração do vírus puro para o teste. Pode ser usado tampão de ensaio de pH mais baixo (por exemplo pH 5,3). No entanto, o cuidado deve ser tomado quando se comparam dados.
Baixa ou nenhuma actividade no ensaio de inibição de NA NA	Nenhum vírus foi adicionado.	Re-diluir o vírus. Certifique-se de que o vírus é directamente adicionada ao tamp de ensaio 1x.
	foi usada diluição do vírus errado.	Repetir o ensaio de actividade de NA.
	tempo de incubação insuficiente.	Assegurar o tempo de incubação é seguida.
Os pontos de dados cair fora da curva IC50	A contaminação cruzada de inibidor da NA de maior concentração.	Certifique-se de que as pontas não estão em contato com o inhibi NAtor na dispensação de vírus diluído na placa de 96 poços.
		Se foi utilizado um reservatório de 8 poços profundos, descartar e re-administrar o inibidor da NA concentrações em um novo reservatório 8 poços profundos.
	O volume do inibidor de NA ou Muñana ou vírus diluído não foi adicionado igualmente em cada poço.	Repetir o ensaio com uma pipeta de multi-canal calibrado. Certifique-se de igual volume de cada reagente é distribuído por cada poço.
Invulgarmente elevados valores de IC50	Foi adicionado demasiado elevada concentração de vírus.	Repetir o ensaio de actividade de NA e de NA ensaio de inibição.
	A amostra de teste continham misturas de gripe A e da gripe B.	Execute-PCR em tempo real para identificar a presença de misturas de vírus.
	A contaminação bacteriana na amostra	vírus da cultura no estado esterilizado, com a presença de antibiótico.
sinal de fluorescência de alta fundo	substrato Muñana podem degradar ao longo do tempo.	Use um novo lote de Munana subtrate.
	Detecção de fluorescência de poços vizinhos.	Use preto placas de 96 poços de fundo plano

Tabela 5: Solução para potenciais problemas no ensaio de inibição do NA.

Discussão

A vigilância global de susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA está actualmente a ser realizado por uma série de laboratórios usando ou fluorescentes ou quimioluminescentes inibição NA ensaios ^{11, 12.} O ensaio fluorescente é mais comummente usado do que o ensaio quimioluminescente. Embora ambos os ensaios são robustos e reprodutível, os valores de IC ₅₀ obtidos a partir do ensaio baseado em fluorescência são frequentemente mais elevados do que o ensaio baseado em quimioluminescência, fazendo uma comparação directa dos dados provenientes dos dois ensaios difíceis ^13. Mesmo com o uso do mesmo protocolo, os dados gerados a partir de um laboratório pode variar a partir de uma outra. Devido a estas variações entre laboratórios, o Grupo de Trabalho OMS na vigilância da gripe Susceptibilidade Antiviral produzido um guia para auxiliar na comparações entre laboratórios. Em vez de comparar os valores absolutos de _IC50, este uso orientaçãosa comparação com base na diferença de dobragem de IC ₅₀ para a mediana de IC ₅₀ dos vírus influenza NI testados em cada um laboratório particular. A possibilidade de comparar os dados a partir dos cinco centros colaboradores resultou na publicação anual mundial de influenza dados antivirais susceptibilidade ^{2, 3, 4.} A disponibilidade de grande quantidade de dados influenza susceptibilidade no domínio público permite aos pesquisadores comparar _IC50 dados desses estudos com que gerou em seus próprios laboratórios.

Outros ensaios de inibição de NA que adoptam um conceito semelhante também estão comercialmente disponíveis. Estes kits comerciais que contêm reagentes prontos-a-usar (NA não inibidores incluídos) são igualmente reprodutível. No entanto, a casa no ensaio de inibição do NA é substancialmente mais barato do que os kits comerciais, porque a maioria dos reagentes pode ser feita em casa emquantidades maiores e o substrato Muñana, que anteriormente se fez o maior custo do ensaio, pode agora ser adquirido a partir de várias fontes, a preços competitivos. O custo de testar um isolado de influenza por droga é de aproximadamente $ 1 (USD). No Melbourne WHOCCRRI, as melhorias têm sido feitas para o ensaio de inibição in-house NA após a incorporação de uma plataforma robótica para os componentes de processamento de líquidos de ensaio. Para além da preparação manual das diluições de vírus, a maioria dos procedimentos são realizados usando o robô de manipulação de líquidos. Não só este minimizar o manuseio manual, mas também aumenta o número de ensaios que podem ser executados em um dia.

Embora o ensaio de inibição do NA é muito robusto, há uma série de passos críticos que precisam ser completado com cuidado adicional. Em primeiro lugar, qualquer irregularidade nas concentrações do inibidor da NA se possam deslocar as curvas de inibição e os valores de IC _50; portanto, uma atenção especial deve serpago ao preparar as concentrações de inibidor de NA. Em segundo lugar, os períodos de incubação de pipetagem e precisos exactos são cruciais para manter resultados consistentes em ensaios; isto pode ser conseguido usando pipetas e temporizadores calibrados. A inclusão de vírus de controlo em cada ensaio também permite a monitorização do desempenho do ensaio de ensaio para ensaio e durante longos períodos de tempo. Em terceiro lugar, porque a actividade da enzima de NA do vírus da gripe sazonal é óptima a pH 6,5, o pH correcto do tampão de ensaio é importante. Alguns relatórios descobriram que a utilização de condições mais baixos de pH pode melhora a identificação de variantes de influenza, tais como a variante A (H7N9) contendo a mutação R292K ^{14, 15.} No entanto, a modificação do pH do tampão de ensaio vai deslocar os valores de IC _50, e isto pode complicar a comparação de dados dentro de laboratórios e entre laboratórios. Outras modificações e solução de problemas que podem ser performed estão listados na Tabela 5.

Os inibidores de NA são a única classe de medicamentos antivirais aprovados que são actualmente eficaz contra o vírus de influenza circulantes. Até outras classes antivirais tornam-se disponíveis para uso clínico, a vigilância da susceptibilidade antiviral de circulação de vírus da gripe será focada em inibidores de NA sozinho. Por causa da simplicidade e reprodutibilidade dos resultados, o uso do ensaio de inibição de NA para avaliar a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA continuará.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Influenza A and B viruses		Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Biosynth AG	M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Sigma	M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU)	Sigma	M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)	Sigma	M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)	APS AJAX Finechem	127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)	Thermo Fisher Scientific	PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)	APS AJAX Finechem	482-2.5KG
Absolute Ethanol	APS AJAX Finechem	214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates	NUNC	456537
96-well U-bottom plates	Greiner Bio-one	4650101
8 channel deep well block	Pacific Laboratory Products	RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells	Pacific Laboratory Products	P-2ML-SQ-C
Plate sealers	Thermo Fisher Scientific	236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL)	Sigma-Aldrich	CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)	8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)	Greiner Bio-one	P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller	Eppendorf	4430000018
Centrifuge tubes 50 mL	BD Bioscience	352070
Racked tubes	Scientific Specialties, Inc.	1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm	TermoFisher Scientific	ASCENT FL 374
Ascent software	TermoFisher Scientific	5185410CD
Incubator set at 37 °C	Lab Supply	Biocell 1000
Zanamivir	GlaxoSmithKline	Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate	Roche
Peramivir (BCX-1812)	BioCryst
Laninamivir (R-125489)	Daiichi-Sankyo
JASPR v1.2	Influenza Division at the CDC Atlanta, USA	freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)