Флуоресцентный на основе нейраминидазы Анализ ингибирования для оценки восприимчивости вирусов гриппа к нейраминидазы Ингибитор классу противовирусных препаратов

Резюме

Мы опишем использование фенотипической флуоресценции на основе ингибирования нейраминидазы анализа для оценки восприимчивости вирусов гриппа А и В к классу ингибиторов нейраминидазы противовирусных препаратов.

Аннотация

Ингибиторы (NA) нейраминидазы являются единственным классом противовирусных препаратов, одобренных для лечения и профилактики гриппа, которые в настоящее время эффективны против циркулирующих штаммов. В дополнении к их использованию в лечении сезонного гриппа, ингибиторы NA были складированы рядом стран для использования в случае возникновения пандемии. Поэтому важно следить за восприимчивостью циркулирующих вирусов гриппа к этому классу противовирусных препаратов. Существуют различные типы анализов, которые могут быть использованы для оценки восприимчивости вирусов гриппа к ингибиторам NA, но ингибирование фермента анализы с использованием либо флуоресцентного субстрата или хемилюминесцентный субстрат являются наиболее широко используется и рекомендуется. Этот протокол описывает использование флуоресцентного анализа на основе для оценки восприимчивости вируса гриппа к ингибиторам NA. Анализ основан на ферменте NA расщепление 2 '- (4-метилумбеллиферил) -α-D Н -acetylneuraminic кислота (Muñana) Субстрат для высвобождения флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона (4-MU). Таким образом, ингибирующее действие ингибитора Ан На на NA вируса гриппа определяется на основе концентрации ингибитора NA, которое требуется , чтобы уменьшить 50% от активности НС, данного в качестве значения IC _50.

Введение

Гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) являются двумя основными поверхностными гликопротеинами вирусов гриппа А и В. HA связывается с сиаловой кислотой-галактозой клеточных поверхностных гликопротеинов или гликолипидов, в то время как НС выпускает вирус расщепления сиаловых кислот из галактозы на клеточной поверхности ^1. Ингибиторы NA представляют собой класс противовирусного гриппа, которые были рационально предназначены для плотно связываются с активным сайтом ферментного Н.А., тем самым предотвращая высвобождение и распространение вируса потомства. Профилактический и занамивир два ингибитора NA, которые были одобрены во многих странах мира для лечения и профилактики гриппа. В последние годы, два дополнительных ингибиторов NA, перамивир и laninamivir, были одобрены для использования в ограниченном числе стран. Скрининг вирусов гриппа на чувствительность к ингибиторам NA и идентификации мутаций, которые придают устойчивость играют важную роль в определении и мониторинге effectiveness этого класса противовирусных.

В течение последних 16 лет, флуоресценция на основе Н.А. анализ ингибирования была выполнена обычно в Сотрудничающий центр ВОЗ по контролю и исследованиям гриппа, Мельбурн (Мельбурн WHOCCRRI) наблюдение за изменением тенденции противовирусной чувствительности среди циркулирующих вирусов гриппа. Ежегодно более 2000 вирусов гриппа тестируют на чувствительность к противовирусным препаратам. В большинстве сезонов гриппа,> 98% вирусов восприимчивы ко всем четырем ингибиторов NA ^{2, 3, 4,} хотя во время сезона гриппа 2007-2008 годов, был всплеск числа бывших сезонных A (H1N1) вирусов что уменьшило восприимчивость к озельтамивиру ^5. Эта группа вирусов, которые содержали NA заместительной аминокислоты H275Y, распространился на остальную часть мира к концу 2008 года, что делает осельтамивир inappropriел глобально для лечения этого вируса. Подавляющее большинство циркулирующих в настоящее время гриппа B, гриппа A (H3N2) и гриппа A (H1N1) штаммы pdm09 восприимчивы к осельтамивиру, хотя общественные кластеры A (H1N1) вариантов pdm09, содержащих аминокислотную замену H275Y НС, что придает уменьшенную оселтамивира и перамивир восприимчивость, были зарегистрированы в различных частях мира , ^{6, 7.}

Из-за необходимость достаточно высокого титр вируса, клинические образцы (в том числе животных назальных смывов) должны быть пассировать в любой культуре клеток или куриные эмбрионы до начала противовирусной тестировании чувствительности. Анализ ингибирования НСА описан в этой статье, можно разделить на три секции:

Определение линейного диапазона для флуоресцентного продукта 4-метилумбеллиферона (4-MU) на конкретном флуорометре
Из-за присущие различия между флюорометрами, тон линейный диапазон для флуоресцентного конечного продукта, 4-MU, и относительная флуоресценция блока (РФС), должен быть установлен. После того, как линейный диапазон для 4-MU установлен, выбран оптимальный целевой сигнал, к которому концентрация вирусов гриппа регулируется в анализе активности НСА. После завершения для конкретного флуорометре, это не должно быть повторено.

Определение активности NA вирусов
Анализ активности Н.А. представляет собой простой тест , который включает в себя добавление 2 '- (4-метилумбеллиферил) -α-D Н -acetylneuraminic кислоты (Muñana) субстрата серийно разводили вирусы. Количество флуоресцентного конечного продукта 4-MU генерируется из расщепления Muñana по НС измеряется с помощью флуориметра. Соответствующее разведение вируса, чтобы использовать в анализе ингибирования NA выбрано путем построения флуоресценции единиц против вируса разбавления. Из сигмовидной кривой производства, средняя точка линейного участка должна соответствовать4-МУ линейного диапазон флуорометра определяется в разделе 1, и информирует соответствующую концентрацию вирусов, которые будут использоваться в разделе 3.

Оценка чувствительности вируса к ингибиторам NA с помощью анализа ингибирования NA
Для оценки восприимчивости к вирусам конкретного ингибитора NA, вирусы при разбавлении, определенной в разделе 2, инкубируют с диапазоном концентраций ингибитора NA. После последующей инкубации с Muñana, 4-MU генерируется неингибированными вирусы измеряются в РФСЕ по флуорометру. Ингибирующее действие ингибитора НСА по ферментативной активности NA вируса рассчитываются в соответствии с концентрацией ингибитора NA , необходимой для снижения на 50% активности НСА, данной в качестве значения IC _50.

протокол

1. Определение линейного диапазона флуоресцирующего продукта 4-MU на Флуорометр

1. Подготовьте 10 мл 6,4 мМ раствора 4-MU путем растворения 11,3 мг 4-MU в 5 мл абсолютного этанола. Добавляют 5 мл 0,9% NaCl (вес / объем) до исходного раствора, чтобы сделать 10 мл. Подготовьте 640 мкМ рабочий раствор путем разбавления 1 мл 6,4 мМ 4-MU в 9 мл 1x буфера для анализа (33,3 мМ 2- (N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) и 4 мМ CaCl _2, рН 6,5).
   Примечание: Подготовка буфера для анализа 2x добавлением 13 г MES и 8 мл 1 М CaCl ₂ до 992 мл дистиллированной воды. Доводят рН до 6,5 с помощью 10 М NaOH. Фильтр буфера, используя стерильный фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм. Внимание! гидроксида натрия каустической соды и может вызвать химические ожоги кожи и глаз. Убедитесь в том, что полное индивидуальное защитное оборудование изношены.
2. Подготовьте 5 мл в диапазоне концентраций 4-MU (т.е. 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 160 & #181; М, и 320 мкМ) через два раза серийного разведения 640 мкМ 4-MU с помощью 1x буфера для анализа.
3. Разлить по 50 мкл каждого из серийных разведений 4-MU (т.е., 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 160 мкМ, 320 мкМ и 640 мкМ) (две скважины в разведении) в прозрачный, 96- хорошо плоским дном пластины и 50 мкл 1х буфера для анализа в остальные лунки (которые служат в качестве заготовок для измерения фоновых сигналов).
   Примечание: Конечные концентрации 4-MU в объеме реакционной смеси (50 мкл 4-MU + 50 мкл 300 мкМ Muñana) являются 2,5 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 40 мкМ, 80 мкМ, 160 мкМ и 320 мкМ ,
4. Подготовьте 2,5 мМ исходного раствора Muñana путем восстановления 25 мг Muñana в 20 мл дистиллированной воды. Смешайте 0,72 мл 2,5 Мм Манана с 5,28 мл 1x буфера для анализа, чтобы получить 300 мкМ Muñana рабочего раствора (достаточный объем для одной пластины). Крышка трубки, содержащей 300 мкМ Muñana Workinг раствора с алюминиевой фольгой и держать его на льду, если не использовать сразу. Выбросьте все оставшиеся материалы.
   Примечание: 2,5 Мм Манана исходный раствор можно хранить при температуре -20 ° С в течение 1 месяца и должен быть использован в течение одного цикла замораживания / оттаивания. 4-MU растворы и Muñana являются светочувствительными и должны быть защищены от длительного воздействия света.
5. Добавьте 50 мкл 300 мкМ Muñana в каждую лунку, слегка нажать, чтобы смешать и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин. Накройте тарелку с тарелкой герметиком, чтобы предотвратить испарение.
   Примечание: Этот шаг для учета фоновой флуоресценции в анализе ингибирования НСА.
6. Подготовка стоп-раствора путем смешивания 11 мл абсолютного этанола с 2,225 мл 0,824 М NaOH (достаточный объем для одной пластины).
7. Добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку, чтобы остановить реакцию и слегка постучите перемешать.
8. Прочитайте пластины с использованием флуориметра с настройкой длины волны возбуждения 355 нм и длине волны эмиссии параметра 460 нм, так как рег инструкции изготовителя.
9. Расчет среднего фонового сигнала с использованием сигналов флуоресценции из всех лунок, не содержащих 4-MU. Вычитание этого среднего фонового сигнала от каждого из лунок, содержащих 4-MU и рассчитать средние сигналы (РФС) для каждой концентрации 4-MU. Участок стандартной кривой РФС против концентрации 4-MU (мкМ), как показано на рисунке 1a; крупным планом линейный участок кривой показан на рисунке 1b.
10. Представьте сюжет РФС против 4-MU концентрации (мкМ), чтобы определить линейный диапазон и оптимальный целевой сигнал; линейный диапазон, где сигнал флуоресценция возрастает пропорционально возрастающие концентрации 4-MU на участке, в то время как оптимальный целевой сигнал произвольной концентрация 4-МУ в пределах линейного диапазона.
    Примечание: Линейный диапазон и оптимальный целевой сигнал являются флуориметром специфичного. Например, флуориметр в Мельбурн WHOCCRRI имеет линейный диапазон 2.5-40 мкМ 4-MU и оптимальный целевой сигнал ~ 30 мкМ 4-MU, что соответствует ~ 1500 РФС.

2. Определение NA активность вирусов

Примечание: Вирусы гриппа культивируют в достаточных титрах в Madin-Darby почки собаки (MDCK) клетках или оплодотворенных яиц куриных ^8.

1. Разливают 120 мкл на лунку неразбавленных вирусов гриппа, культивированных в колонку 1 и 60 мкл 1х буфера для анализа, содержащего 0,1% NP-40 в остальных 11 колонн 96-луночный U-нижней пластины.
2. Серийно выполняют два-кратное разведение вирусов через пластину (т.е. передать 60 мкл из колонки 1 в колонку 2 и так далее, до колонки 11) с помощью многоканальной пипетки, в результате чего колонку 12 в виде заготовки , содержащей только 1x буфера для анализа.
3. Передача 50 мкл из каждой из лунок (разведенные вирусы и заготовок) в виде прозрачного, 96-луночный, плоским дном пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не надо свисящий пипеток, если материалы, которые передаются из колонны 12 через в колонну 1.
4. Добавьте 50 мкл 300 мкМ Muñana (полученного в соответствии с шагом 1.4) на лунку и осторожно нажмите на пластину для смешивания. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 1 ч. Накройте тарелку с тарелкой герметиком, чтобы предотвратить испарение.
5. Добавьте 100 мкл стоп-раствора (полученного в соответствии с шагом 1.6) в каждую лунку, чтобы прекратить реакцию, и аккуратно нажмите на пластину, чтобы перемешать.
6. Прочитайте пластину с помощью флуориметра.
   1. Используйте настройку длины волны возбуждения 355 нм и длине волны эмиссии параметр 460 нм.
7. Определить средний фоновый сигнал на основе показаний флуоресценции в колонке 12 и вычесть средний фоновый сигнал из каждой лунки. Постройте график РФС против вируса разведений.
   Примечание: Фоновые значения для 100 мкМ Muñana на WHOCCRRI Мельбурне, как правило, между 50 и 120 РФСОМ, но это будет отличаться в зависимости от Флуорометра Beiнг используется.
8. Посмотреть сюжет РФС против вируса разведений , чтобы определить среднюю точку линейного участка кривой для каждого вируса (рис 2). Используйте оптимальный целевой сигнал (определяется на стадии 1) в качестве опорной точки.
   Примечание: Это должно соответствовать линейному диапазону 4-MU в флуорометре, определенном в разделе 1, и будет обеспечивать соответствующую концентрацию вирусов, которые будут использоваться в разделе 3.

3. Оценка чувствительности вируса Н. А. Использование ингибиторов NA Анализ ингибирования

1. Подготовить основные запасы ингибиторов NA при концентрации 300 мкМ.
   1. Готовят 300 мкМ занамивир (молекулярная масса, ММ = 332,32 г / моль) путем растворения 5,0 мг занамивира в 50 мл 2 раза буфером для анализа (66,6 мМ MES и 8 мМ CaCl _2, рН 6,5).
   2. Готовит 300 мкМ осельтамивира карбоксилата (D-тартрат; ММ = 386,44 г / моль) путем растворения 5,8 мг в 50 мл 2х буфера для анализа.
   3. Подготовить300 мкМ перамивир тригидрат (ММ = 382,45 г / моль) путем растворения 5,7 мг в 50 мл 2х буфера для анализа.
   4. Подготовьте 300 мкМ laninamivir (ММ = 346,34 г / моль) путем растворения 5,2 мг в 50 мл 2х буфера для анализа.
      Примечание: ингибитор мастер запасы NA можно хранить при -20 ° С в течение 12 месяцев. Проверьте MW ингибиторов NA, чтобы обеспечить правильные веса и объемы используются в восстановлении. Озельтамивир карбоксилат является активным соединением пролекарство озельтамивира фосфата. Таким образом, только озельтамивир карбоксилат следует использовать в анализе ингибирования НС.
2. Из основных запасов, подготовить рабочие запасы десять-кратных серийных разведений ингибиторов NA в 50 мл центрифужные пробирки при концентрации 0,03 нМ, 0,3 нМ, 3 нМ, 30 нМ, 300 нМ, 3000 нМ, и 30 000 нМ в 2х анализе буфера (66,6 мМ MES и 8 мМ CaCl _2, рН 6,5); это для использования в нескольких анализов.
   Примечание: Конечные концентрации ингибиторов NA в реакционной Volumе (50 мкл вирусного разведения + 50 мкл ингибитора NA + 50 мкл 300 мкМ), являются Muñana 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1000 нМ, и 10000 нМ, соответственно. Конечная концентрация не включает в себя 100 мкл стоп-раствора. Хранить все ингибиторы NA разведений при температуре 2-8 ° С. Срок годности такой же, как и у основных запасов.
3. Подготовьте вирусные разведений в ом буфере, содержащие 0,1% NP-40 поверхностно-активное вещество в блоке 96-глубокой скважины. Использование вирусных разведений на основе результатов анализа деятельности НС, полученных из секции 2. Использование общего объема 2 мл на вирус, чтобы испытать четыре ингибиторов NA.
   Примечание: Подготовьте две лунки (1 мл на лунку) на одного вируса в блоке 96-глубокой скважины. Примеры вирусных разведений для ВИРУСА 1, 2 и 3 представлены в таблице 1.
4. Разлить необходимый объем ингибиторов NA (полученные в соответствии с шагом 3.2) в резервуар 8 глубоких скважин. Оттуда обойтись 50 мкл ингибиторов NA при разбавлении в диапазоне от 0 нМ (2x анализа бuffer только) до 30000 нМ в строках А-Н в виде прозрачного, 96-луночный, плоским дном пластины.
   Примечание: Компоновка пластины показана на фиг.3.
5. Добавьте 50 мкл разведенного тестируемого вирусов на лунку в колонках 1-11 и 50 мкл на лунку буфера для анализа 1x только колонке 12. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 мин. Накройте тарелку с тарелкой герметиком, чтобы предотвратить испарение.
6. Добавьте 50 мкл 300 мкМ Muñana (полученного в соответствии с шагом 1.4) на лунку и осторожно нажмите на пластину для смешивания. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 1 ч. Накройте тарелку с тарелкой герметиком, чтобы предотвратить испарение.
7. Добавьте 100 мкл стоп-раствора (полученного в соответствии с шагом 1.6) в каждую лунку и осторожно нажмите на тарелку, чтобы перемешать.
8. Прочитайте пластину с помощью флуориметра.
   1. Использование длины волны возбуждения 355 нм и длине волны эмиссии 460 нм, как описано выше.

4. РасчетЗначения IC ₅₀

Примечание: JASPR v1.2 криво посаженное программное обеспечение , которое позволяет рассчитать значения IC _50. Программное обеспечение было разработано Отделом по гриппу в CDC, Атланта, США. Программное обеспечение использует уравнение: V = V _макс х (1 - ([I] / (К _I + [I]))), где В _макс максимальная скорость обмена веществ, [I] обозначает концентрацию ингибитора, V является реакция ингибируется, и к _я это IC ₅₀ для кривой ингибирования.

1. Копирование и вставка необработанных данных, выводимых на флуорометре в электронную таблицу в формате пластины 12-колонке (96-луночный), начиная с ячейки A1.
   Примечание: Исходные данные из каждой последующей пластины должны быть смещены на одну пустую строку. Если каждый вирус был испытан против четырех ингибиторов NA, вставить исходные данные в наборе из четырех (с пустой строкой между каждой пластиной).
2. Откройте подходящее программное обеспечение и слИк на вкладке «Эксперимент». Выберите «Альтернатива 2 наркотиков Фтор 11 образцов.»
3. Нажмите на вкладку «Параметры» и отметьте «Создать Графы».
4. Нажмите на кнопку «Параметры» и снова нажмите на кнопку «New Key». Сохранить «inhibition_key» .csv файл в той же папке, что и файл необработанных таблиц данных.
5. В inhibition_key файла, список всех образцов имен ниже ID. Каждое имя образца должно быть уникальным.
6. Если были испытаны четыре ингибиторов NA, вставить пространства для двух дополнительных строк ниже Оселтамивира и введите «Peramivir» и «Laninamivir.» Сохраните изменения, внесенные в inhibition_key файл.
7. Возвращение к «jaspr против 1,2-Ингибирование кривой фитинг» окна и выберите файл исходных данных в качестве «эксперимента File» и inhibition_key как «файл ключа.» Выполнить анализ. Сохранение результатов в формате .csv и .pdf форматах.
   Примечание: Программное обеспечение будет автоматически построить кривую ингибирования (РФС АгаиНСТ Н.А. концентрации ингибитора), как показано на рисунке 4. Программа также вычисляет значения IC ₅₀ для каждого вируса против отдельного ингибитора NA (Рисунок 4). Кроме того, JASPR представлены значения IC ₅₀ и сигнал-фон (S / B) отношение в формате электронной таблицы. Фоновые значения могут отличаться от лаборатории до лаборатории в зависимости от используемого флуорометре. В Мельбурне WHOCCRRI, фоновые значения для 100 мкМ диапазоне Muñana от 50 до 120 РФСОВ. Для надежного значения IC _50, отношение S / B от ≥10 является предпочтительным, хотя отношение менее чем 10 по - прежнему приемлемым, особенно для мутантных вирусов , которые имеют очень низкую активность NA.
8. Проверьте значения IC ₅₀ и кривую форму , сгенерированную с помощью программного обеспечения. Все точки данных должны падать на или близко к кривой; если они не делают, повторите ингибированию NA.
   Примечание: Для вирусов , которые показывают необычно высокие значения IC _50, анализ должен быть повторред, чтобы подтвердить результат.

Результаты

Использование стандартизированных руководящих принципов отчетности с Рабочей группой ВОЗ по надзору за гриппом противовирусной Восприимчивость ^9, восприимчивость вирусов гриппа к ингибиторам NA, сообщаются с использованием условий нормального торможения (NI), уменьшенный ингибирования (RI), и значительно снижено ингибирование (HRI) , Вирусы NI являются те , с IC ₅₀ значения меньше , чем в 10 раз по сравнению с базовыми срединной IC ₅₀ для вирусов гриппа А (или менее чем в 5 раз на наличие вирусов гриппа В). Вирусы RI являются те , со значениями IC ₅₀ между 10- и 100-кратной выше ссылок срединной IC ₅₀ для вирусов гриппа А (или 5- и 50-кратного для гриппа B). Вирусы HRI являются те , с IC ₅₀ величины в 100 раз выше средней ссылкой IC ₅₀ для вирусов гриппа А (или выше в 50 раз на наличие вирусов гриппа В); смотри таблицу 2.

Ссылка медианный IC ₅₀ значения A (H1N1) pdm09 A (H3N2), и вирусы В Ямагата / B Victoria рассчитываются и ежегодно обновляется в Мельбурн WHOCCRRI , чтобы отразить незначительные изменения в значениях IC ₅₀ циркулирующих штаммов вируса гриппа к ингибиторам NA (Таблица 3). Средние значения IC ₅₀ в гриппа A (H1N1) pdm09 вирусы практически одинаковая для всех четырех ингибиторов NA, но средний показатель занамивир и laninamivir IC ₅₀ значения A (H3N2) вирусов от 2 до 4 раз выше по сравнению с озельтамивира и перамивир IC ₅₀ значений (таблица 3). Медианный озельтамивир IC ₅₀ , значение на наличие вирусов гриппа В , как правило , от 5 до 10 раз выше , чем занамивир, перамивиром и laninamivir значения IC ₅₀ (таблица 3).

Анализ ингибирования Н.А. является фенотипическим анализом, который не содержит информации о генетических изменениях associованные с RI или HRI. Поэтому, важно, что генетический анализ выполняется после идентификации вирусов с RI или HRI. В Мельбурне WHOCCRRI, ген NA вариантов анализируются с помощью Sanger секвенирования и пиро-секвенирование. Представитель список аминокислотных замен , которые могут быть найдены в гене NA вирусов с RI и HRI вариантов представлен в таблице 4. Более обширный список аминокислотных замен , которые могут изменить NAI восприимчивость также доступна на веб - сайте ВОЗ ^10.

Рисунок 1: РФС от концентрации 4-MU. (А) Стандартная кривая РФС против 4-MU концентрации (мкМ). Пунктирная окно показывает линейный диапазон 4-MU для флуорометра. Сигналы флуоресценции выше линейного диапазона может быть насыщенным, и, следовательно, любые sИзменения в торговый центр флуоресценции не могут быть обнаружены с помощью флуорометра. (Б) Крупный план линейный участок стандартной кривой рис 1а для идентификации «оптимального целевого сигнала.» Флуориметр в Мельбурн WHOCCRRI имеет линейный диапазон 2.5-40 мкМ 4-MU и оптимальный целевой сигнал ~ 30 мкМ 4-MU, что соответствует ~ 1500 РФС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Пример кривых активности НС вирусов гриппа. Среднее фоновое значение 50.61 РФС было вычтено из любой точки разбавления на кривых деятельности НС. Стрелки указывают соответствующее разбавление вируса для использования в анализе ингибирования НС для каждого вируса. Для облегчения приготовительноготовка вирусных разведений, один может выбрать для выполнения 1/100 разбавления для VIRUS 3 вместо 1/96 разведения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Схема плиты для установки на ингибированию НС. Каждая пластина включает в последний столбец, который действует в качестве отрицательного контроля, который не содержит вирус, но только 1x буфер для анализа (АВ), ингибитор NA, Muñana и стоп-раствор. Примечание: JASPR использует показания из колонки 12 каждой пластины , чтобы определить средний пустой сигнал , используемый при вычислении значений IC _50. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Пример кривой ингибирования и значения IC ₅₀ вируса A (H1N1), A pdm09 / Перт / 82/2015. Программное обеспечение JASPR представляет кривое ингибирование как флуоресценции (РФС) против возрастающей концентрации (нМ) ингибитора NA, с каждой точкой посадкой внутри кривой. На основании кривой ингибирования, значение IC ₅₀ определяют как концентрацию ингибитора NA , чтобы уменьшить 50% от вирусной активности НС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Вирус	требуется Вирус разбавление	1x анализируемый объем буфера (мкл)	Поверхностно-Ампер-NP-40 (10%) (мл)	Объем Вирус (мл)
1	1/20	940	10	50
2	1/40	965	10	25
3	1/100	890	10	10

Таблица 1: Получение вирусных разведений для ВИРУСА 1, 2 и 3 в анализе ингибирования НСА.

Тип Вирус / подтип / родословная	Нормальное торможение	Снижение ингибирования	Сильно зауженной ингибирование
	(NI)	(Род-Айленд)	(СПЧ)
A (H1N1) pdm09	<10 раз	10-100 раз	> 100 раз
A (H3N2)	&# 60; 10 раз	10-100 раз	> 100 раз
B Ямагата и B Victoria	<5 раз	5-50 раз	> 50 раз

Таблица 2: противовирусная Рабочая группа ВОЗ рекомендовала рекомендации по классификации вирус гриппа восприимчивость к ингибиторам NA.

Тип Вирус / подтип / родословная	N	Zanamivir	Профилактически	Peramivir	Laninamivir
		Медиана (диапазон) IC 50 нМ	Медиана (диапазон) IC 50 нМ	Медиана (диапазон) IC 50 нМ	Медиана (диапазон) IC 50 нМ
A (H1N1) pdm09	1326	0.42 (0.1-3.43)	0,36 (0.01-3.48)	0.19 (0.07-1.60)	0,55 (0.05-2.29)
A (H3N2)	1654	0.9 (0.11-4.0)	0.38 (0.01-3.65)	0.33 (0.12-3.06)	1.38 (0.01-9.38)
B Ямагата и B Victoria	1115	2.2 (1.24-10.72)	15.12 (2.39-70.75)	1.36 (0.57-6.67)	2.89 (1.62-9.15)

Таблица 3: Среднее IC ₅₀ и IC ₅₀ , диапазон нормального торможения (NI) вирусы из 2015 , полученных в СЦКИГЕ ВОЗ, Мельбурн.

Амино замещение кислоты	Тип / подтип / родословная	IC 50 раз с изменением совместноmpared ссылаться медианные значения IC 50.
		Zanamivir	Профилактически	Peramivir	Laninamivir
H275Y	A (H1N1) pdm09	1	557 (СПЧ)	123 (СПЧ)	2
E119V	A (H3N2)	1	63 (RI),	1	1
H134Y	B Victoria	1	4	76 (СПЧ)	2
N151T	B Victoria	4	4	42 (СПЧ)	1
G104E	B Victoria	+1220 (СПЧ)	87 (СПЧ)	17724 (СПЧ)	701 (СПЧ)
E105K	B Victoria	3	5 (RI),	59 (СПЧ)	2
I222T	B Victoria	2	7 (RI),	8 (RI),	3
H273Y	B Ямагата	1	230 (СПЧ)	377 (СПЧ)	2
D197N	B Ямагата	4	7 (RI),	32 (RI),	3

Таблица 4: Представитель список аминокислотных замен , связанных с сокращением ингибирования (RI) или сильно зауженной ингибирования (HRI) ингибиторов NA.

проблема	Возможная причина (ы)	Решение (s)
Нет или низкая активность NA	Ни один вирус не присутствовал или низкий уровень вируса выход.	Клинические образцы должны культивироваться в клеточных линиях (т.е. Madin-Darby Canine Почечных клетки) или в оплодотворенных куриных яйцахк более высокой вирусной нагрузке для использования в анализе ингибирования НСА.
	Некоторые мутантные вирусы имеют крайне низкую активность NA, несмотря на большой вирусной нагрузке.	Используйте опрятную концентрацию вируса для тестирования. Может быть использован для анализа Нижней рН буфер (например , рН 5,3). Тем не менее, осторожность необходимо соблюдать осторожность при сравнении данных.
Отсутствие или низкая активность в НС ингибированию Н.А.	Вирус не был добавлен.	Повторно разбавить вирус. Убедитесь, что вирус добавляются непосредственно в буфер ого анализа.
	был использован вирус Неправильный разбавление.	Повторить анализ активности NA.
	Недостаточное время инкубации.	Убедитесь, что время инкубации следует.
Точки данных выходят за пределы кривой IC 50	Перекрестное загрязнение ингибитора NA более высокой концентрации.	Убедитесь в том, что советы не в контакте с inhibi Н.А.тор при дозировании разбавленных вирусов для 96-луночного планшета.
		Если 8 скважины глубиной резервуара был использован, выбросить и повторно дозировать NA концентрации ингибитора в свежую 8 глубокого резервуара скважины.
	Объем ингибитора NA или Muñana или разбавленного вируса не добавляли одинаково в каждую лунку.	Повторите анализ с помощью калиброванной многоканальной пипетки. Обеспечить равный объем каждого реагента разливают в каждую лунку.
Необычно высокие значения IC 50	была добавлена ​​Слишком высокая концентрация вируса.	Повторить анализ активности NA и NA Анализ ингибирования.
	Тестовый образец содержал смеси гриппа А и гриппа В.	Выполните ПЦР в реальном времени для выявления присутствия вируса смесей.
	Бактериальное загрязнение в образце	Вирус культуры в стерильных условиях с наличием антибиотика,
флуоресцентный сигнал высокого фона	Muñana субстрат может со временем ухудшаться.	Используйте новую партию Munana subtrate.
	Обнаружение флуоресценции из соседних скважин.	Используйте черные 96-луночные плоскодонные пластины

Таблица 5: Устранение потенциальных проблем в анализе ингибирования НС.

Обсуждение

Глобальный мониторинг вирус гриппа восприимчивость к ингибиторам NA в настоящее время проводится рядом лабораторий с использованием либо флуоресцентные или хемилюминесцентным ингибирования Н.А. анализов ^{11, 12.} Флуоресцентный анализ чаще используются, чем хемилюминесцентный анализ. Хотя оба анализы надежные и воспроизводимые, значение IC ₅₀ , полученное из флуоресцентного анализа на основе часто выше , чем в анализе на основе хемилюминесценции, что делает прямое сравнение данных из двух анализов сложных ^13. Даже при использовании одного и того же протокола, данные, полученные из одной лаборатории, может варьироваться в зависимости от другого. Из-за этих различий между лабораториями, Рабочая группа ВОЗ по надзору за гриппом противовирусной Восприимчивость подготовила руководство для оказания помощи в межлабораторных сравнений. Вместо того , чтобы сравнивать абсолютные значения IC _50, эта директива использованияСравнение са на основе кратной разницы IC ₅₀ к медиане IC ₅₀ из вирусов гриппа NI испытанных в каждой конкретной лаборатории. Возможность сравнения данных из пяти сотрудничающих центров привела к ежегодной публикации глобального гриппа противовирусные данных восприимчивости ^{2, 3, 4.} Наличие большого количества данных , восприимчивость гриппа в общественном достоянии позволяет исследователям сравнивать IC ₅₀ данных из этих исследований , с тем, что создается в своих собственных лабораториях.

Другие анализы ингибирования NA, которые принимают подобную концепцию также коммерчески доступны. Эти коммерческие наборы, которые содержат готовые к использованию реагентов (ингибиторы НС не включен) в равной степени воспроизводимы. Тем не менее, в доме Н. А. Анализ ингибирования существенно дешевле, чем коммерческие наборы, потому что большинство реагентов может быть сделано в доме вбольшие количества и подложка Munana, которые ранее составляли основную стоимость анализа, теперь можно приобрести из различных источников по конкурентоспособным ценам. Стоимость тестирования одного изолят гриппа на лекарства составляет около $ 1 (USD). В Melbourne WHOCCRRI, улучшения были сделаны к НСУ ингибированию в доме после включения роботизированной платформы для обработки жидких компонентов анализа. Помимо ручного приготовления вирусных разведений, большинство процедур выполняются с использованием жидкостной обработки робота. Это не только свести к минимуму ручной обработки, но также увеличивает количество анализов, которые могут быть запущены в день.

Хотя ингибирование анализ НСА является весьма надежным, существует целый ряд критических шагов, которые должны быть выполнено с дополнительной помощью. Во- первыхи, какие - либо нарушения в концентрации ингибитора NA может сместить кривые ингибирование и значение IC _50; Поэтому, особое внимание должно бытьзаплатил при подготовке концентраций ингибитора NA. Во-вторых, точные пипетирующие и точные периоды инкубации имеют решающее значение для поддержания результатов различных анализов; это может быть достигнуто с помощью калиброванных пипеток и таймеры. Включение вирусов контроля в каждом анализе также позволяет контролировать производительность анализа от анализа к анализу и в течение длительных периодов времени. В-третьих, потому что активность фермента Н.А. вирусов сезонного гриппа является оптимальным при рН 6,5, правильный рН буфера для анализа имеет важное значение. Некоторые отчеты обнаружили , что использование более низких значениях рН может улучшает идентификацию вариантов гриппа, такие , как вариант А (H7N9) , содержащий мутацию R292K ^{14, 15.} Тем не менее, модификации рН буфера для анализа сместится значения IC _50, и это может осложнить сравнение данных в лабораториях , так и между лабораторий. Другие модификации и поиска неисправностей, которые могут быть рerformed приведены в таблице 5.

Ингибиторы NA являются единственным классом утвержденного противовирусными, которые в настоящее время эффективны против циркулирующих вирусов гриппа. Пока другие противовирусные классы становятся доступными для клинического использования, чувствительность к противовирусным препаратам наблюдения циркулирующих вирусов гриппа будет сфокусировано на ингибиторы NA в одиночку. Из-за простоты и воспроизводимости результатов, использование анализа ингибирования для оценки NA вируса гриппа, восприимчивость к ингибиторам NA будет продолжаться.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Influenza A and B viruses		Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Biosynth AG	M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Sigma	M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU)	Sigma	M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)	Sigma	M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)	APS AJAX Finechem	127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)	Thermo Fisher Scientific	PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)	APS AJAX Finechem	482-2.5KG
Absolute Ethanol	APS AJAX Finechem	214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates	NUNC	456537
96-well U-bottom plates	Greiner Bio-one	4650101
8 channel deep well block	Pacific Laboratory Products	RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells	Pacific Laboratory Products	P-2ML-SQ-C
Plate sealers	Thermo Fisher Scientific	236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL)	Sigma-Aldrich	CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)	8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)	Greiner Bio-one	P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller	Eppendorf	4430000018
Centrifuge tubes 50 mL	BD Bioscience	352070
Racked tubes	Scientific Specialties, Inc.	1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm	TermoFisher Scientific	ASCENT FL 374
Ascent software	TermoFisher Scientific	5185410CD
Incubator set at 37 °C	Lab Supply	Biocell 1000
Zanamivir	GlaxoSmithKline	Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate	Roche
Peramivir (BCX-1812)	BioCryst
Laninamivir (R-125489)	Daiichi-Sankyo
JASPR v1.2	Influenza Division at the CDC Atlanta, USA	freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)