Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

Riepilogo

Descriviamo l'uso di un test di inibizione della neuraminidasi basato sulla fluorescenza fenotipica per valutare la suscettibilità del virus dell'influenza A e B alla classe degli inibitori della neuraminidasi di antivirali.

Abstract

I neuraminidasi (NA) inibitori sono l'unica classe di farmaci antivirali approvati per il trattamento e la profilassi dell'influenza che sono efficaci contro i ceppi attualmente in circolazione. Oltre al loro uso nel trattamento di influenza stagionale, gli inibitori NA sono state stoccate da un certo numero di paesi per l'uso in caso di una pandemia. E 'quindi importante monitorare la suscettibilità dei virus influenzali circolanti a questa classe di farmaci antivirali. Ci sono diversi tipi di saggi che possono essere utilizzati per valutare la suscettibilità del virus dell'influenza agli inibitori NA, ma i saggi di inibizione enzimatica utilizzando sia un substrato fluorescente o un substrato chemiluminescente sono i più utilizzati e raccomandato. Questo protocollo descrive l'uso di un test basato sulla fluorescenza per valutare la suscettibilità del virus influenzale agli inibitori NA. Il saggio è basato sull'enzima NA distacco del 2 '- (4-Methylumbelliferyl) -α-D-acido -acetylneuraminic N (Munana) Substrato per rilasciare il prodotto fluorescente 4-metilumbelliferone (4-MU). Pertanto, l'effetto inibitorio di un inibitore NA sul virus dell'influenza NA è determinato sulla base della concentrazione di inibitore NA necessaria per ridurre del 50% dell'attività NA, come valore di _IC50.

Introduzione

Emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) sono i due principali glicoproteine ​​di superficie di virus dell'influenza A e B. HA lega al sialico acido-galattosio, di glicoproteine di superficie delle cellule o glicolipidi, mentre la NA rilascia il virus con l'adesione l'acido sialico dal galattosio sulla superficie cellulare ^1. Gli inibitori NA sono una classe di farmaci antivirali influenzali che sono stati razionalmente progettati per legarsi strettamente al sito attivo NA enzimatico, impedendo in tal modo il rilascio e la diffusione della progenie virus. Oseltamivir e zanamivir sono due inibitori della NA che sono stati approvati in molti paesi in tutto il mondo per il trattamento e la profilassi dell'influenza. Negli ultimi anni, due inibitori supplementari NA, peramivir e laninamivir, sono stati approvati per l'utilizzo in un numero limitato di paesi. Lo screening dei virus influenzali di suscettibilità agli inibitori della NA e l'identificazione di mutazioni che conferiscono resistenza sono importanti nel determinare e monitorare l'effectiveness di questa classe di farmaci antivirali.

Negli ultimi 16 anni, il saggio di inibizione NA basato sulla fluorescenza è stata eseguita di routine presso il Centro Collaboratore dell'OMS per riferimento e la ricerca sull'influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) per monitorare il cambiamento di tendenza della suscettibilità antivirale tra i virus influenzali circolanti. Ogni anno, più di 2.000 virus influenzali sono testati per la suscettibilità antivirale. Nella maggior parte delle stagioni influenzali,> 98% dei virus sono suscettibili a tutti e quattro gli inibitori Na ^{2, 3, 4,} anche se durante la stagione di nord nell'emisfero influenzale 2007-2008, ci fu un aumento del numero di ex (H1N1) virus stagionali A che avevano ridotto la suscettibilità ad oseltamivir ^5. Questo gruppo di virus, che conteneva la NA sostituzione aminoacidica H275Y, diffondersi al resto del mondo entro la fine del 2008, rendendo oseltamivir inapproprimangiato a livello globale per il trattamento di questo virus. La stragrande maggioranza delle attualmente circolanti dell'influenza B, influenza A (H3N2), e influenza A (H1N1) ceppi pdm09 sono sensibili a oseltamivir, anche se i cluster comunità di A (H1N1) varianti pdm09 contenenti l'aminoacido sostituzione H275Y NA che conferisce ridotto oseltamivir e peramivir suscettibilità, sono stati riportati in varie parti del mondo ^{6, 7.}

A causa della necessità di un titolo virale sufficientemente elevata, campioni clinici (compresi lavaggi nasali animale) devono essere diversi passaggi sia in coltura cellulare o embrionate uova di gallina prima del test di suscettibilità antivirale. Il saggio di inibizione NA descritto in questo articolo può essere suddiviso in tre sezioni:

Determinazione del range lineare del prodotto fluorescente 4-metilumbelliferone (4-MU) su un particolare fluorimetro
A causa delle differenze intrinseche tra fluorimetri, tegli range lineare per il prodotto finale fluorescente, 4-MU, e l'unità di fluorescenza relativa (RFU), devono essere stabiliti. Una volta stabilita la gamma lineare per 4-MU, viene selezionato il segnale bersaglio ottimale, per cui la concentrazione del virus dell'influenza viene regolato nel saggio di attività NA. Una volta completato per un particolare fluorimetro, questo non dovrebbe aver bisogno di essere ripetuto.

Determinare l'attività NA dei virus
Il saggio di attività NA è un semplice metodo che prevede l'aggiunta del 2 '- (4-Methylumbelliferyl) -α-D-N acido -acetylneuraminic (Muñana) substrato di virus diluito serialmente. La quantità di fluorescenza prodotto finale 4-MU generato dalla scissione del Muñana dalla NA viene misurata utilizzando un fluorimetro. La diluizione virus opportuno utilizzare nel saggio di inibizione NA viene selezionato tracciando unità di fluorescenza contro la diluizione virus. Dalla curva sigmoidale prodotta, il punto medio della sezione lineare dovrebbe corrispondereil campo lineare 4-MU del fluorimetro determinato al punto 1 e informa la concentrazione appropriata di virus da utilizzare nella sezione 3.

Valutare la suscettibilità dei virus agli inibitori NA utilizzando il saggio di inibizione NA
Per valutare la sensibilità del virus ad un particolare inibitore NA, virus al diluizione determinato al punto 2 vengono incubate con un intervallo di concentrazioni di inibitore NA. Seguendo una successiva incubazione con Muñana, il 4-MU generato dal virus non inibite è misurata in RFU dal fluorimetro. L'effetto inibitorio dell'inibitore NA sull'attività enzimatica NA di un virus viene calcolato secondo la concentrazione dell'inibitore NA necessaria per ridurre del 50% dell'attività NA, come valore di _IC50.

Protocollo

1. Determinazione della gamma lineare del prodotto fluorescente 4-MU su un Fluorometer

1. Preparare 10 ml di 6,4 mM soluzione stock 4-MU sciogliendo 11,3 mg di 4-MU in 5 ml di etanolo assoluto. Aggiungere 5 ml di NaCl 0,9% (w / v) della soluzione di riserva per fare 10 ml. Preparare una soluzione 640 mM di lavoro diluendo 1 ml di 6,4 mM 4-MU in 9 mL di 1x tampone di saggio (acido 33,3 mM 2- (N-morfolino) etansolfonico (MES) e 4 mM CaCl _2, pH 6,5).
   NOTA: Preparare il tampone di saggio 2x aggiungendo 13 g di MES e 8 ml di 1 M CaCl ₂ a 992 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,5 ​​con 10 M di NaOH. Filtrare il tampone usando un filtro di acetato di cellulosa sterile di dimensione dei pori di 0,2 um. Attenzione! L'idrossido di sodio è caustico e può causare ustioni alla pelle e agli occhi. Assicurarsi che la piena dispositivi di protezione individuale è usurato.
2. Preparare 5 ml di un intervallo di concentrazioni 4-MU (cioè, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 e #181, M, e 320 pM) attraverso una diluizione seriale duplice di 640 pM 4-MU utilizzando tampone 1x.
3. Dispensare 50 ml di ciascuna diluizione seriale di 4-MU (cioè, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM, 320 pM e 640 pM) (due pozzetti per diluizione) in modo chiaro, 96- pozzetti a fondo piatto e 50 ml di tampone di saggio 1x nei pozzetti rimanenti (che servono come sbozzati per misurare segnali di fondo).
   NOTA: Le concentrazioni finali di 4-MU nel volume di reazione (50 microlitri 4-MU + 50 microlitri 300 uM Muñana) sono 2,5 pM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM e 320 uM .
4. Preparare una soluzione stock 2,5 mM MUNANA ricostituendo 25 mg di Muñana in 20 ml di acqua distillata. Miscela 0,72 ml di 2,5 mM MUNANA con 5,28 ml di 1x tampone per ottenere una soluzione di lavoro (volume sufficiente per una piastra) 300 uM Munana. Coprire il tubo contenente il Muñana workin 300 uMSoluzione g con foglio di alluminio e tenerlo in ghiaccio meno utilizzato immediatamente. Eliminare eventuali materiali di scarto.
   NOTA: La soluzione madre 2,5 mM MUNANA possono essere conservati a -20 ° C per 1 mese e deve essere utilizzato entro un congelamento ciclo / disgelo. Le soluzioni 4-MU e Muñana sono sensibili alla luce e devono essere protetti dall'esposizione alla luce prolungata.
5. Aggiungere 50 microlitri di 300 uM Muñana a ciascun pozzetto, delicatamente toccare per miscelare e incubare a 37 ° C per 30 min. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione.
   NOTA: Questo passaggio è di spiegare la fluorescenza di fondo nel saggio di inibizione NA.
6. Preparare la soluzione di stop miscelando 11 ml di etanolo assoluto con 2.225 ml di NaOH 0,824 M (volume sufficiente per una piastra).
7. Aggiungere 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto per arrestare la reazione e picchiettare delicatamente per mescolare.
8. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro con un'impostazione eccitazione lunghezza d'onda di 355 nm e un ambiente d'onda di emissione di 460 nm, come per le istruzioni del produttore.
9. Calcolare il segnale di fondo media utilizzando segnali di fluorescenza da tutti i pozzetti non contenenti 4-MU. Sottrarre il segnale di fondo media da ciascuno dei pozzetti contenenti 4-MU e calcolare i segnali medi (RFU) per ciascuna concentrazione 4-MU. Tracciare una curva standard di RFU contro la concentrazione 4-MU (uM), come mostrato in figura 1a; una sezione lineare primo piano della curva è mostrato in Figura 1b.
10. Visualizza la trama di RFU contro 4-MU concentrazione (pM) per determinare l'intervallo lineare ed il segnale bersaglio ottimale; il campo lineare è dove il segnale di fluorescenza aumenta proporzionalmente alle concentrazioni crescenti del 4-MU del terreno, mentre il segnale bersaglio ottimale è una concentrazione arbitrario 4-MU all'interno del range lineare.
    NOTA: Il range lineare e il segnale di destinazione ottimale sono specifici fluorimetro. Ad esempio, il fluorimetro al Melbourne WHOCCRRI ha una gamma lineare di 20,5-40 pM 4-MU e un segnale bersaglio ottimale di circa 30 pM 4-MU, che corrisponde a ~ 1500 RFU.

2. Determinazione del NA attività dei virus

NOTA: I virus influenzali sono coltivate a titoli sufficienti a Madin-Darby Canine Kidney cellule (MDCK) o uova embrionate di pollo ^8.

1. Dispensare 120 microlitri per pozzetto di virus influenzali coltura diluiti in colonna 1 e 60 ml di tampone di saggio 1x contenente 0,1% NP-40 nei restanti 11 colonne di pozzetti 96, piastra U-bottom.
2. Serialmente eseguire diluizione duplice dei virus attraverso la piastra (cioè, trasferire 60 microlitri dalla colonna 1 alla colonna 2 e così via, fino a colonna 11) usando una pipetta multicanale, lasciando colonna 12 come bianco contenente tampone solo 1x.
3. Trasferire 50 ml di ciascuno dei pozzetti (virus diluito e spazi vuoti) in una, 96 pozzetti, piastra a fondo piatto chiaro.
   NOTA: Non è necessario cHa hange pipette se i materiali vengono trasferite dalla colonna 12 attraverso la colonna 1.
4. Aggiungere 50 ml di 300 mM Munana (preparato secondo passo 1.4) per pozzetto e toccare delicatamente la piastra per miscelare. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 h. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione.
5. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto (preparata secondo passo 1.6) per pozzetto per bloccare la reazione e delicatamente toccare la piastra per miscelare.
6. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro.
   1. Utilizzare un'impostazione lunghezza d'onda di eccitazione di 355 nm e un ambiente d'onda di emissione di 460 nm.
7. Determinare il segnale di fondo media sulla base delle letture di fluorescenza nella colonna 12 e sottrarre il segnale di fondo media da ciascun pozzetto. Tracciare un grafico della RFU contro diluizioni di virus.
   NOTA: I valori di fondo per 100 micron Muñana al WHOCCRRI Melbourne sono in genere tra i 50 ei 120 RFU, ma questi saranno diverse a seconda del bei fluorimetrong utilizzato.
8. Visualizzare la trama di RFU contro diluizioni di virus per determinare il punto medio della sezione lineare della curva per ciascun virus (Figura 2). Utilizzare il segnale bersaglio ottimale (determinato nella fase 1) come punto di riferimento.
   NOTA: Questo dovrebbe corrispondere alla gamma lineare 4-MU del fluorimetro determinata al punto 1 e fornirà la concentrazione appropriata di virus da utilizzare nella sezione 3.

3. Valutare Virus suscettibilità alle NA inibitori Usando il NA Inibizione Assay

1. Preparare le scorte maestri di inibitori della NA a concentrazioni di 300 micron.
   1. Preparare 300 uM zanamivir (peso molecolare, PM = 332.32 g / mole) sciogliendo 5,0 mg di zanamivir in 50 ml di tampone di saggio 2x (66,6 mM MES e 8 mM CaCl _2, pH 6,5).
   2. Preparare 300 uM oseltamivir carbossilato (D-tartrato; PM = 386,44 g / mol) sciogliendo 5,8 mg in 50 mL di tampone 2x.
   3. Preparare300 uM peramivir triidrato (MW = 382,45 g / mol) sciogliendo 5,7 mg in 50 mL di tampone 2x.
   4. Preparare 300 uM laninamivir (MW = 346.34 g / mole) sciogliendo 5,2 mg in 50 mL di tampone 2x.
      NOTA: Le scorte maestro inibitori NA possono essere conservati a -20 ° C per 12 mesi. Controllare la MW degli inibitori NA per garantire i pesi e volumi corretti sono utilizzati in ricostituzione. Il carbossilato nell'uomo è il composto attivo del profarmaco fosfato oseltamivir. Pertanto, solo il carbossilato nell'uomo deve essere utilizzato nel saggio di inibizione NA.
2. Dalle scorte master preparare scorte di dieci volte diluizioni seriali degli inibitori NA in 50 provette per centrifuga ml lavorare a concentrazioni di 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM e 30.000 nM nel saggio 2x tampone (66,6 mM MES e 8 mM CaCl _2, pH 6,5); questo è per l'uso su più saggi.
   NOTA: Le concentrazioni finali di inibitori NA nel volum reazionee (50 microlitri di diluizione virus + 50 ml di inibitore NA + 50 ml di 300 mM Munana) sono 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 10.000 nM, rispettivamente. La concentrazione finale non include i 100 ml di soluzione di stop. Conservare tutti gli inibitori diluizioni NA a 2-8 ° C. La data di scadenza è la stessa di quella degli stock maestri.
3. Preparare le diluizioni del virus in tampone di saggio 1x contenente 0,1% NP-40 tensioattivo in un blocco 96-pozzetti profondi. Utilizzare diluizioni del virus sulla base dei risultati del test NA attività derivate dalla sezione 2. utilizzare un volume totale di 2 ml per virus per testare quattro inibitori NA.
   NOTA: allestire due pozzetti (1 ml per pozzetto) per virus in un blocco di 96-deep-bene. Esempi di diluizioni di virus per il virus 1, 2, e 3 sono riportati nella Tabella 1.
4. Erogare il volume di inibitori NA (preparati secondo passo 3.2) richiesto in un serbatoio 8 profondo bene. Da lì, dispensare 50 ml di inibitori NA a diluizioni che vanno da 0 nM (2x dosaggio bSolo Uffer) a 30.000 nM nelle righe A a H in una, 96 pozzetti, piastra a fondo piatto chiaro.
   NOTA: Il layout di piastra è illustrata nella figura 3.
5. Aggiungere 50 ml di virus di prova diluiti per pozzetto alle colonne 1-11 e 50 microlitri per pozzetto di tampone 1x soltanto colonna 12. Agitare gentilmente la piastra per miscelare ed incubare a temperatura ambiente per 45 min. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione.
6. Aggiungere 50 ml di 300 mM Munana (preparato secondo passo 1.4) per pozzetto e toccare delicatamente la piastra per miscelare. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 h. Coprire la piastra con un foglio sigillante per evitare l'evaporazione.
7. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto (preparata secondo passo 1.6) a ciascun pozzetto e picchiettare delicatamente la piastra per miscelare.
8. Leggere la piastra utilizzando un fluorimetro.
   1. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 355 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm, come descritto in precedenza.

4. CalcoloIC ₅₀ valori

NOTA: La v1.2 JASPR è un software curva-montaggio che consente il calcolo dei valori di _IC50. Il software è stato sviluppato dalla Divisione Influenza al CDC, Atlanta, Stati Uniti d'America. Il software utilizza l'equazione: V = V _max x (1 - ([I] / (K _I + [I]))), dove V _max è la massima velocità del metabolismo, [I] è la concentrazione dell'inibitore, V è la risposta inibita, e K _i è _l'IC50 per la curva di inibizione.

1. Copiare e incollare i dati grezzi in uscita dal fluorimetro in un foglio in un formato di piastra a 12 colonne (96 pozzetti), iniziando con cella A1.
   NOTA: grezzo dati da ciascuna piastra successivo deve essere sfalsati da una riga vuota. Se ogni virus è stato testato contro quattro inibitori NA, incollare i dati grezzi in un insieme di quattro (con una riga vuota tra ciascuna piastra).
2. Aprire il software di montaggio e click sulla scheda "Experiment". Scegliere "Alternativa 2-droga Fluoro 11 campioni."
3. Fare clic sulla scheda "Opzioni" e spuntare "generare grafici."
4. Clicca su "Opzioni" di nuovo e fare clic sulla scheda "Nuova chiave". Salvare il file .csv "inhibition_key" nella stessa cartella del file foglio di calcolo di dati grezzi.
5. Nel file inhibition_key, elencare tutti i nomi dei campioni di sotto della ID. Ogni nome del campione deve essere univoco.
6. Se quattro inibitori NA sono stati testati, inserire spazi per due righe aggiuntive sotto Oseltamivir e digitare "Peramivir" e "Laninamivir". Salvare le modifiche apportate al file inhibition_key.
7. Ritorno al "jaspr v 1.2-inibizione Curve fitting" finestra e selezionare il file di dati grezzi come il "File Experiment" e inhibition_key come il "file chiave." Eseguire l'analisi. Salvare i risultati in formato .csv e .pdf.
   NOTA: Il software tracciare automaticamente una curva di inibizione (RFU against NA concentrazioni di inibitore), come mostrato in Figura 4. Il programma calcola anche valori di _IC50 per ciascun virus contro un individuo NA inibitore (Figura 4). Inoltre, JASPR presenta i valori di IC ₅₀ e il segnale-fondo (S / B) il rapporto in formato foglio. I valori di fondo possono differire da un laboratorio all'altro a seconda del fluorimetro utilizzato. Al Melbourne WHOCCRRI, valorizza lo sfondo per la gamma Muñana 100 micron da 50 a 120 RFU. Per un certo valore _IC50, un rapporto S / B di ≥10 è preferito, anche se un rapporto inferiore a 10 è ancora accettabile, in particolare per i virus mutanti che hanno molto bassa attività NA.
8. Controllare i valori di IC ₅₀ e le forme delle curve generate dal software. Tutti i punti di dati dovrebbero cadere su o vicino alla curva; se così non fosse, ripetere il test di inibizione NA.
   NOTA: Per i virus che mostrano insolitamente alti valori di IC _50, il dosaggio dovrebbe essere di ripetizioneEd a confermare il risultato.

Risultati

Utilizzando linee guida di rendicontazione standardizzate dal gruppo di lavoro dell'OMS sulla sorveglianza dell'influenza antivirale suscettibilità ^9, la suscettibilità dei virus influenzali alle inibitori NA sono riportati utilizzando i termini normali di inibizione (NI), ridotta inibizione (RI), e fortemente ridotta inibizione (HRI) . Virus NI sono quelli con valori di _IC50 inferiore a 10 volte rispetto al riferimento mediana _IC50 per i virus dell'influenza A (o meno di 5 volte di virus dell'influenza B). Virus RI sono quelli con valori di _IC50 tra 10 e 100 volte sopra il riferimento mediana _IC50 per i virus dell'influenza A (o 5- e 50 volte per l'influenza B). Virus HRI sono quelli con valori di _IC50 di 100 volte sopra il riferimento mediana _IC50 per i virus dell'influenza A (o superiore a 50 volte di virus dell'influenza B); vedere Tabella 2.

Il riferimento mediana _IC50 valori di A (H1N1) pdm09, A (H3N2), ei virus B Yamagata / B Victoria sono calcolati e aggiornati annualmente al Melbourne WHOCCRRI per riflettere le modifiche minori dei valori di IC ₅₀ di ceppi influenzali circolanti agli inibitori NA (Tabella 3). I valori mediani di IC ₅₀ di influenza A (H1N1) virus pdm09 sono quasi uguali in tutte le quattro inibitori NA, ma la zanamivir mediana e laninamivir valori di _IC50 per A (H3N2) sono da 2 a 4 volte superiore rispetto a oseltamivir e peramivir valori di IC ₅₀ (Tabella 3). La mediana oseltamivir _IC50 valore di virus dell'influenza B è generalmente da 5 a 10 volte superiore alla zanamivir, peramivir e laninamivir valori di IC ₅₀ (Tabella 3).

Il saggio di inibizione NA è un saggio fenotipico che non fornisce informazioni sui cambiamenti genetici Associated con RI o HRI. Pertanto, è importante che l'analisi genetica viene eseguito dopo l'identificazione del virus con RI o HRI. Al Melbourne WHOCCRRI, il gene NA di varianti viene analizzato utilizzando il sequenziamento Sanger e piro-sequenziamento. Un elenco rappresentativo di sostituzioni di amminoacidi che si possono trovare nel gene NA del virus con RI e HRI varianti è presentato nella tabella 4. Un elenco più completo delle sostituzioni di amminoacidi che può alterare la suscettibilità NAI è disponibile sul sito web dell'OMS ¹⁰ anche.

Figura 1: RFU contro di concentrazione 4-MU. (A) curva standard di RFU contro 4-MU concentrazione (pM). La casella tratteggiata mostra il campo lineare di 4-MU per il fluorimetro. I segnali di fluorescenza di sopra del range lineare possono essere saturi, e quindi, qualsiasi svariazioni nella fluorescenza centro commerciale non possono essere rilevati dal fluorimetro. (B) sezione lineare Primo piano della curva standard di figura 1a per l'identificazione della "ottimale del segnale bersaglio." Il fluorimetro al Melbourne WHOCCRRI ha una gamma lineare di 2,5-40 pM 4-MU e un segnale bersaglio ottimale di circa 30 pM 4-MU, che corrisponde a ~ 1500 RFU. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio delle curve di attività NA del virus dell'influenza. Il valore medio di sfondo 50,61 RFU è stato sottratto da tutti i punti di diluizione sulle curve di attività NA. Le frecce indicano la diluizione virus appropriato da utilizzare nel saggio di inibizione NA per ogni virus. Per facilitare la preparazionearazione di diluizioni di virus, si può scegliere di eseguire una diluizione 1/100 per il virus 3 invece di una diluizione 1/96. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: layout di piastra per l'installazione del saggio di inibizione NA. Ciascuna piastra comprende l'ultima colonna, che agisce come un controllo negativo che non contiene alcun virus ma solo tampone del saggio 1x (AB), NA inibitore, Muñana, e soluzione bloccante. NOTA: JASPR utilizza letture dalla colonna 12 di ciascuna piastra per determinare il segnale medio vuoto utilizzato nel calcolo dei valori di _IC50. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di curva di inibizione e _IC50 valore di un virus pdm09 A (H1N1), A / Perth / 82 / il 2015. Il software JASPR presenta la curva di inibizione come fluorescenza (RFU) contro la crescente concentrazione (nM) di NA inibitore, con ogni forma punto all'interno della curva. Sulla base della curva di inibizione, il valore _IC50 è determinato come la concentrazione di NA inibitore di ridurre del 50% del virus attività NA. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Virus	diluizione Virus richiesto	1x volume di tampone di saggio (microlitri)	Tensioattivo-Amp-NP-40 (10%) (ml)	il volume Virus (ml)
1	1/20	940	10	50
2	1/40	965	10	25
3	1/100	890	10	10

Tabella 1: Preparazione di diluizioni di virus per il virus 1, 2, 3 e nel saggio di inibizione NA.

virus di tipo / sottotipo / lignaggio	l'inibizione normale	l'inibizione ridotta	l'inibizione altamente ridotta
	(NI)	(RI)	(HRI)
A (H1N1) pdm09	<10 volte	10-100 volte	> 100 volte
A (H3N2)	&# 60; 10 volte	10-100 volte	> 100 volte
B Yamagata e B Victoria	<5 volte	5-50 volte	> 50 volte

Tabella 2: l'antivirale gruppo di lavoro dell'OMS raccomanda linee guida per la classificazione della suscettibilità virus influenzale agli inibitori NA.

virus di tipo / sottotipo / lignaggio	N	zanamivir	oseltamivir	peramivir	Laninamivir
		Mediana (range) IC 50 nM	Mediana (range) IC 50 nM	Mediana (range) IC 50 nM	Mediana (range) IC 50 nM
A (H1N1) pdm09	1.326	0.42 (0,1-3,43)	0,36 (0,01-3,48)	0,19 (0,07-1,60)	0,55 (0,05-2,29)
A (H3N2)	1.654	0,9 (0,11-4,0)	0,38 (0,01-3,65)	0,33 (0,12-3,06)	1,38 (0,01-9,38)
B Yamagata e B Victoria	1.115	2.2 (1,24-10,72)	15.12 (2,39-70,75)	1,36 (0,57-6,67)	2,89 (1,62-9,15)

Tabella 3: mediana _IC50 e _IC50 gamma di inibizione normale (NI) virus dal 2015 deriva in OMS CCRRI, Melbourne.

sostituzione amminoacidica	Tipo / sottotipo / lignaggio	IC50 armadio cambiamento compared fare riferimento mediani valori di IC50.
		zanamivir	oseltamivir	peramivir	Laninamivir
H275Y	A (H1N1) pdm09	1	557 (HRI)	123 (HRI)	2
E119V	A (H3N2)	1	63 (RI)	1	1
H134Y	B Victoria	1	4	76 (HRI)	2
N151T	B Victoria	4	4	42 (HRI)	1
G104E	B Victoria	1.220 (HRI)	87 (HRI)	17.724 (HRI)	701 (HRI)
E105K	B Victoria	3	5 (RI)	59 (HRI)	2
I222T	B Victoria	2	7 (RI)	8 (RI)	3
H273Y	B Yamagata	1	230 (HRI)	377 (HRI)	2
D197N	B Yamagata	4	7 (RI)	32 (RI)	3

Tabella 4: lista Rappresentante del sostituzioni di amminoacidi legati alla ridotta inibizione (RI) o inibizione altamente ridotta (HRI) agli inibitori NA.

Problema	Possibile causa (s)	Soluzione (s)
No o scarsa attività NA	Nessun virus era presente o bassa resa virus.	Campione clinico devono essere coltivate in linee cellulari (cioè le cellule renali Madin-Darby Canine) o in uova embrionate di polload una carica virale superiore per l'utilizzo nel saggio di inibizione NA.
	Alcuni virus mutanti hanno estremamente bassa attività NA nonostante ad alta carica virale.	Utilizzare concentrazione di virus pulito per il test. Tampone di saggio pH più basso (ad esempio, pH 5.3) può essere utilizzato. Tuttavia, la cautela deve essere presa quando si confrontano i dati.
No o bassa attività NA nel test di inibizione NA	è stato aggiunto Nessun virus.	Re-diluire il virus. Assicurarsi che il virus viene aggiunto direttamente nel tampone 1x.
	diluizioni di virus sbagliato è stato utilizzato.	Ripetere il saggio di attività NA.
	tempo di incubazione insufficiente.	Garantire il tempo di incubazione è seguito.
I punti dati rientrano la curva IC50	La contaminazione incrociata di NA inibitore di maggiore concentrazione.	Assicurarsi che le punte non sono in contatto con l'INHIBI NAtor durante l'erogazione virus diluito nella piastra da 96 pozzetti.
		Se è stato utilizzato un serbatoio 8 pozzo profondo, scartare e ri-dispensare la NA inibitore concentrazioni in un fresco 8 serbatoio pozzo profondo.
	Il volume dell'inibitore NA o Muñana o virus diluito non è stato aggiunto equamente in ogni pozzetto.	Ripetere l'analisi con una pipetta multicanale calibrato. Garantire uguale volume di ciascun reagente viene erogato in ciascun pozzetto.
Insolitamente elevati valori IC50	è stato aggiunto troppo alta concentrazione di virus.	Ripetere il saggio di attività NA e saggio di inibizione NA.
	Prelievo del campione conteneva miscele di influenza A e l'influenza B.	Eseguire PCR in tempo reale per identificare la presenza di miscele virus.
	contaminazione batterica nel campione	virus coltura in condizioni sterili con la presenza di antibiotico.
segnale di fluorescenza ad alta sfondo	Munana substrato può degradare nel tempo.	Utilizzare un nuovo lotto di Munana subtrate.
	Rilevamento della fluorescenza da pozzi vicini.	Usa Black 96 pozzetti a fondo piatto

Tabella 5: Risoluzione dei problemi per i potenziali problemi nel saggio di inibizione NA.

Discussione

Il monitoraggio globale del virus dell'influenza suscettibilità agli inibitori della NA è attualmente in corso da un certo numero di laboratori usando sia saggi fluorescenti o chemiluminescente inibizione NA ^{11, 12.} Il test di fluorescenza è più comunemente usata di saggio chemiluminescente. Sebbene entrambi i saggi sono robusti e riproducibili, i valori di IC ₅₀ ottenuti dal saggio basato sulla fluorescenza sono spesso superiori al chemiluminescenza a base, facendo un confronto diretto dei dati dei due saggi difficili ^13. Anche con l'uso dello stesso protocollo, dati generati da un laboratorio possono variare da un altro. A causa di queste variazioni tra laboratori, il gruppo di lavoro dell'OMS sulla sorveglianza dell'influenza antivirale suscettibilità ha prodotto una linea guida per aiutare nel confronto inter-laboratorio. Piuttosto che confrontando i valori di _IC50 assoluti, questo uso orientamentoconfronto sa in base alla _IC50 differenza piega alla mediana _IC50 dei virus influenzali NI testati in ogni particolare laboratorio. La possibilità di confrontare i dati provenienti dai cinque centri che collaborano ha portato alla pubblicazione annuale di Global Influenza dati antivirali suscettibilità ^{2, 3, 4.} La disponibilità della grande quantità di dati influenza suscettibilità di dominio pubblico permette ai ricercatori di confrontare _IC50 dati provenienti da questi studi con quello generato nei propri laboratori.

Altri saggi di inibizione NA che adottano un concetto simile sono anche disponibili in commercio. Questi kit commerciali che contengono i reagenti pronti per l'uso (NA Non inibitori incluso) sono altrettanto riproducibili. Tuttavia, l'in-house test di inibizione NA è sostanzialmente più conveniente che i kit commerciali, perché la maggior parte dei reagenti può essere fatta in casa ingrandi quantità e il substrato Munana, che in precedenza costituito il maggiore costo del saggio, possono essere acquistati da varie fonti a prezzi competitivi. Il costo dei test per l'influenza un isolato di droga è di circa $ 1 (USD). Al Melbourne WHOCCRRI, sono stati apportati miglioramenti al saggio di inibizione interno NA dopo l'incorporazione di una piattaforma robotica per i componenti di manipolazione di liquido del saggio. A parte la preparazione manuale di diluizioni del virus, la maggior parte delle procedure sono eseguite utilizzando il robot liquido di gestione. Non solo questo ridurre al minimo la movimentazione manuale, ma aumenta anche il numero di test che possono essere eseguiti in un giorno.

Anche se il test di inibizione NA sia molto robusto, ci sono una serie di passaggi critici che devono essere completati con cura supplementare. In primo luogo, qualsiasi irregolarità nelle concentrazioni di inibitore NA possono spostare le curve di inibizione ei valori di IC _50; Pertanto, particolare attenzione dovrebbe essereversato nel preparare le concentrazioni di inibitore NA. In secondo luogo, i periodi di pipettatura e incubazione precisa accurati sono cruciali per mantenere risultati costanti attraverso saggi; questo può essere realizzato utilizzando pipette e timer calibrate. L'inclusione di virus di controllo in ogni dosaggio consente anche il monitoraggio delle prestazioni del saggio da dosaggio a dosaggio e per lunghi periodi di tempo. Terzo, perché l'attività enzimatica NA del virus dell'influenza stagionale è ottimale a pH 6,5, il corretto pH del tampone è importante. Alcuni studi hanno trovato che l'uso di condizioni di pH inferiore può migliorare l'identificazione delle varianti influenza, come la variante A (H7N9) contenente la mutazione R292K ^{14, 15.} Tuttavia, la modifica del pH del tampone di saggio sposterà i valori di IC _50, e questo può complicare il confronto dei dati nei laboratori e tra laboratori. Altre modifiche e problemi che possono essere performed sono elencati nella Tabella 5.

Gli inibitori NA sono l'unica classe di farmaci antivirali approvati che sono attualmente efficaci contro i virus influenzali circolanti. Fino a quando altre classi antivirali diventano disponibili per l'uso clinico, alla sorveglianza suscettibilità antivirale dei virus influenzali circolanti sarà focalizzata su inibitori della NA solo. Grazie alla semplicità e riproducibilità dei risultati, l'uso del saggio di inibizione NA per valutare la suscettibilità del virus influenzale agli inibitori NA continuerà.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Influenza A and B viruses		Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Biosynth AG	M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Sigma	M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU)	Sigma	M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)	Sigma	M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)	APS AJAX Finechem	127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)	Thermo Fisher Scientific	PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)	APS AJAX Finechem	482-2.5KG
Absolute Ethanol	APS AJAX Finechem	214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates	NUNC	456537
96-well U-bottom plates	Greiner Bio-one	4650101
8 channel deep well block	Pacific Laboratory Products	RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells	Pacific Laboratory Products	P-2ML-SQ-C
Plate sealers	Thermo Fisher Scientific	236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL)	Sigma-Aldrich	CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)	8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)	Greiner Bio-one	P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller	Eppendorf	4430000018
Centrifuge tubes 50 mL	BD Bioscience	352070
Racked tubes	Scientific Specialties, Inc.	1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm	TermoFisher Scientific	ASCENT FL 374
Ascent software	TermoFisher Scientific	5185410CD
Incubator set at 37 °C	Lab Supply	Biocell 1000
Zanamivir	GlaxoSmithKline	Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate	Roche
Peramivir (BCX-1812)	BioCryst
Laninamivir (R-125489)	Daiichi-Sankyo
JASPR v1.2	Influenza Division at the CDC Atlanta, USA	freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)