Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

Resumo

Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrado.

Resumo

Este artigo descreve as etapas para a construção de uma biblioteca de DNA do solo, preparação e uso da célula de fluxo de nanopore e a análise das sequências de DNA identificado usando software de computador. Sequenciamento de DNA de Nanopore é uma técnica flexível que permite o sequenciamento de genoma microbiano rápido identificar espécies bacterianas e virais, para caracterizar as cepas bacterianas e para detectar mutações genéticas que conferem resistência a antibióticos. As vantagens da nanopore (NS) de sequenciamento para Ciências da vida incluem sua baixa complexidade, custo reduzido e rápida em tempo real sequenciamento de DNA genômico purificado, PCR amplicons, amostras de cDNA ou RNA. NS é um exemplo de "sequenciamento da vertente" que envolve o sequenciamento DNA, orientando uma única molécula de DNA encalhada por meio de um nanopore que é inserido em uma membrana de polímero sintético. A membrana tem uma corrente elétrica aplicada através dele, assim como as bases individuais passam a nanopore a corrente elétrica é interrompida em diferentes graus pelos quatro nucleótidos. A identificação de cada nucleotídeo ocorre através da detecção da modulação característica da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. O sistema de NS consiste de um portátil, USB powered dispositivo portátil e uma célula de fluxo descartáveis que contém uma matriz de nanopore. O dispositivo portátil conecta a um computador portátil padrão que lê e grava a sequência de DNA usando software de computador.

Introdução

O objetivo deste procedimento é para demonstrar as etapas necessárias para a preparação de uma biblioteca de DNA ambiental para sequenciamento, utilização de um dispositivo de sequenciamento de célula de fluxo nanopore e realizar a análise das sequências DNA geradas usando o software de sistema e Centro Nacional de ferramentas de Bioinformática Biotechnology Information (NCBI) para identificar a espécie microbiana no solo. Atualmente, a maioria das plataformas de sequenciamento de DNA requerem um grande investimento em formação técnica e instrumentação complexa, que não é viável em ambientes pobres de recursos ou em aplicações de campo. A plataforma de sequenciamento (NS) nanopore elimina estas questões com um custo-eficaz, simples de usar protocolo de preparação de biblioteca e um dispositivo portátil para sequenciar e analisar uma variedade de diferentes tipos de ácidos nucleicos^1,3. Nós incorporamos a plataforma de NS para várias classes de laboratório para alunos de mestrado.

Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas demonstrou aplicações largas nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos bacterianos e virais^1,2,6, biodiversidade ambiental estudos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica^3,5e caracterização da resistência antibiótica bacteriana⁴. NS é um método rápido e preciso de ácidos nucleicos de sequência que é baseado no princípio da "vertente sequenciamento" detectando perturbações eléctricas de nucleótidos individuais quando solteiro encalhado DNA passa por uma nanopore inserido uma eletrificado membrana de polímero sintético. As etapas envolvidas na preparação de DNA para NS incluem a fragmentação do genoma, reparação final e 3' dA-tailing de fragmentos genômicos, adaptador e baraço recozimento ao DNA, DNA Biblioteca purificação e carregar a biblioteca para o dispositivo de célula de fluxo nanopore. Fragmentação do genoma em tamanhos ~ 8 kb é realizada por 1-2 µ g de DNA genômico através de um tubo de fragmentação g-tubo de centrifugação. As extremidades genomic fragmentadas são reparadas e caudas com dA poli usando um kit disponível comercialmente. Sequências de adaptador único encalhado, que são compatíveis com a proteína de motor nanopore, são adicionadas às extremidades do DNA que são usadas para orientar a sequência de DNA através do nanopore (Figura 1). As sequências de baraço são necessárias para a purificação de DNA e para localizando as moléculas de DNA para a membrana dos poros. O grampo é gerado por ligar um adaptador de gancho para uma extremidade da cauda dA biblioteca. As estruturas de gancho nas extremidades do DNA permite a leitura das fibras sentido e antisentido como o DNA passa a nanopore (Figura 2). A biblioteca genômica preparada é então purificada da reação usando streptavidin grânulos usando um campo magnético, seguido por carregar a amostra dentro da célula de fluxo de nanopore para análise.

O DNA sequenciado é avaliado pela qualidade e leituras de sequenciamento que são aceitáveis para análise são sujeito a várias ferramentas de Bioinformática para identificar os micróbios. As sequências são "convertidas" em um FASTQ de um formato de FAST5. No formato FASTQ, as sequências podem ser usadas na análise de explosão.

Protocolo

Nota: Metagenomic DNA purified do solo (Condado de Baltimore, Maryland) usando um isolamento genômico solo comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais). Usando um espectrofotômetro UV (veja a Tabela de materiais), o DNA genômico purificado deve ter uma proporção de (nm) 260/280 > 1.8 e um rácio de 260/230 entre 2.0-2.2 para assegurar que a amostra é livre de contaminantes. A quantidade de DNA genômico necessária para NS varia de 200 ng de 2 µ g.

1. método de preparação de biblioteca rápida (protocolo curto)

Nota: Este é um protocolo curto. Consulte Tabela de materiais para o kit de arranjar em sequência rápida.

1. Em um 0,2 mL tubo de paredes finas (ver Tabela de materiais) adicionar 200 ng de alto peso molecular DNA numa final do volume de 7,5 µ l de água destilada.
2. Adicione 2,5 µ l de mistura de fragmentação (FM) do kit de preparação rápida biblioteca e misture gentilmente por inversão. Centrífuga de pulso spin para baixo (1.000 x g durante 5 s).
3. Colocar a amostra em um thermocycler (ver Tabela de materiais) para uma rodada em 30 ° C por 1 min, seguido de 75 ° C por 1 min. Retire o tubo e pulso centrifugador girar a amostra.
4. Adicione 1 µ l de adaptador rápido e 0,2 µ l de mistura de mestre ligase blunt/TA e em seguida armazenar a biblioteca adaptada e amarrada no gelo.
   Nota: Se usando o protocolo curto avance para o passo 8

2. ligadura sequenciamento (protocolo longo): Fragmentação de DNA Metagenomic

Nota: Consulte Tabela de materiais para o kit de sequenciamento de ligadura.

1. Dilua 1 µ g de DNA genômico purificado até um volume final de 46 µ l em água desionizada.
2. Transferência da amostra a uma fragmentação do ADN do tubo (ver Tabela de materiais) e centrifugar durante 1 minuto na temperatura a 8.000 x g usando microcentrifuga (consulte a Tabela de materiais) para produzir fragmentos genômicos de ~ 8 kb. Certifique-se de que todo o líquido passou para o tubo de coleta.
3. Inverta o tubo de fragmentação, retorno à centrífuga e centrifugar por 1 min coletar o DNA genômico fragmentado na câmara baixa.
4. Transferir o DNA genômico fragmentado para um tubo de 1,5 mL estéril de baixo-DNA de ligação e analisar uma porção em um gel de agarose de baixo percentual (0,6%) para confirmar a fragmentação para > 30 kb.

3. fragmentado fim-preparação de DNA genômico

1. Usando 800 ng de DNA genômico fragmentado em 45 µ l de água deionizada, adicionar a reação de preparação final 7 µ l (ver Tabela de materiais), mistura de enzima de 3 µ l de buffer (ver Tabela de materiais) e 5 µ l de nuclease água livre.
2. Mix por inversão e pulso centrifugador (1.000 x g durante 5 s).
3. Transferir a amostra para um tubo de paredes finas de 0,2 mL e incubar a amostra por 5 min a 20 ° C, seguido de incubação a 65 ° C por 5 min.
4. Centrífuga de pulso para trazer conteúdo para o fundo do tubo.
5. Transferi a amostra para um tubo de microcentrifugadora de ligação de baixa-DNA 1,5 mL.
6. Prepare-se grânulos magnéticos (veja a tabela de materiais). Adicione 60 µ l de ressuspensão grânulos para a reação de preparação final da etapa 3.5 e mistura pipetando.
7. Incube em um misturador de rotor a 100 rpm (ver Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.
8. O pulso centrifugar a amostra para granular os grânulos e, em seguida, coloque a amostra ao lado do ímã.
9. Uma vez que as contas sejam cumpridas ao ímã, pipete sobrenadante e descarte.
10. Retire o tubo dos grânulos de ímã e lavagem com 200 µ l de etanol a 70% acabadas pipetando suavemente a amostra de altos e baixos.
11. Centrífuga de pulso para granular os grânulos e retornar ao ímã.
12. Retire o sobrenadante e descarte. Repita a etapa de lavagem novamente usando 200 µ l de etanol 70%.
13. O pulso centrifugar o tubo de retorno para o ímã e remover toda a lavagem de etanol 70%.
14. Com a tampa do tubo de microcentrifuga aberto, permitir que os grânulos para o ar seco por 5 min à temperatura ambiente.
15. Retire o tubo do ímã e suspender o sedimento em 31 µ l de água estéril, livre de nuclease. Incube durante 2 min à temperatura ambiente.
16. Retorne o tubo ao ímã, até que todas as contas têm peletizado e o eluato é claro.
17. Transferi o eluato para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Usando 1 µ l de amostra, quantificar o DNA de final-preparado usando um espectrofotômetro UV a 260 nm (ver Tabela de materiais).
    Nota: A recuperação por cento deve ser ~ 70% (700 ng) de uma concentração inicial de 1 µ g de DNA genômico.

4. adaptador e Tether além de fragmentos de DNA genômico de final-preparado

1. Misture todos o ligase do blunt/TA mestre mistura tubos por inversão, e então pulse centrífuga para trazer conteúdo para o fundo.
2. Usando 30 µ l de DNA final-preparado, adicione 20 µ l do mix de adaptador e 50 µ l de mistura de mestre sem corte/TA da ligadura.
3. Misturar por inversão, centrífuga de pulso e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.

5. magnético Bead preparação

1. Vórtice os grânulos e então transferência 50 µ l de grânulos suspensos para uma microcentrífuga de 1,5 mL do tubo.
2. Coloca o tubo sobre o ímã para granular os grânulos até o eluato limpa.
3. Retire o sobrenadante e descarte.
4. Adicionar 100 µ l de tampão de ligação do grânulo (consulte Tabela de materiais para kit de) aos talões, vórtice para Ressuspender os grânulos, os grânulos sobre o ímã de Pelotas, remover o sobrenadante e descarte. Repita a lavagem com 100 µ l de tampão de ligação.
5. Adicione 100 µ l de tampão de ligação do grânulo aos talões lavados. Vórtice para Ressuspender os grânulos.

6. Biblioteca purificação

1. Utilizando uma micropipeta P200, adicione 40 µ l de grânulos da etapa anterior para o DNA genômico adaptado/amarrados. Misture a amostra cuidadosamente por pipetagem.
2. Incube a amostra em um misturador de rotor a 100 rpm durante 5 min à temperatura ambiente.
3. Colocar a amostra sobre o ímã e permitir que as contas a acertar. Pipetar fora o sobrenadante e descarte.
4. Resuspenda as contas em 140 µ l de tampão de ligação do grânulo pipetando. Colocar a amostra contra o ímã, desprezar o sobrenadante e lavar novamente com outro 140 ml de tampão de ligação do grânulo.
5. Pulso, centrifugar o tubo, colocar o tubo sobre o ímã para o buffer de vinculação do grânulo restantes 2 min. Retire a pelota.

7. eluição da biblioteca de ímã missanga

1. Resuspenda as esferas magnéticas em 15 µ l de tampão de eluição por pipetagem. Incube a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Coloque o tubo contra o ímã para granular os grânulos.

Quando a solução limpa, retire 15 µ l de eluato e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coloque a amostra no gelo.

Quantificar a biblioteca usando um espectrofotômetro UV.
Nota: A recuperação por cento deve ser ~ 25% (250 ng) de uma concentração inicial de 1 µ g de DNA genômico.

8. a partir de um controle de gerência de qualidade

1. Remova a célula de fluxo da embalagem e anexar a célula de fluxo para o sequencer portátil, em tempo real (ver Tabela de materiais).
2. Anexar o sequencer para um computador via cabo USB e inicie o software de sequenciamento (ver Tabela de materiais).
3. Clique em "Connect" dispositivo através do software de sequenciamento, selecione "NC_Platform_QC.py" e clique em "Iniciar".
4. O controle de qualidade (QC) leva aproximadamente 6-7 min para terminar; Procure por um 'mar verde' (grandes áreas de saída) na leitura do QC para confirmar que não há suficiente poros ativos (> 800) para o sequenciamento de DNA.

9. iniciando uma corrida de sequenciamento

1. Abra o programa de sequenciamento; uma caixa de diálogo será exibida. Na caixa ID de amostra, nome da amostra.
2. Clique na caixa "Identificação de célula de fluxo" e digite o código encontrado na etiqueta na parte superior da célula de fluxo.
3. Abra a tampa de célula de fluxo e então deslize a tampa de porta de amostra para a direita (sentido horário) para que a porta de amostra é visível. Uma vez que a porta está aberta, verifique por uma pequena bolha. Remova alguns microlitros de buffer incluindo a bolha.
4. Verifique se que não há reserva em todo o sistema de radar. Fazer o buffer de escorva misturando 480 µ l de tampão em execução com mistura de combustível (RBF-1, consulte a Tabela de materiais) (certifique-se de misturar primeiro) com água de nuclease livre 520 µ l.
5. Adicione 800 µ l de buffer de escorva para o porto de escorva. Levante com cuidado a tampa "SpotOn" para torná-lo acessível.
6. Depois de 5 min, adicione um adicionais 200 µ l de tampão de escorva para o porto de escorva.

10. carregar a biblioteca

1. Antes de preparar o local de biblioteca os seguintes reagentes no gelo: RBF-1 (do kit de sequenciamento), adaptado e amarrados a biblioteca e grânulos de carregamento da biblioteca (LLB; do kit de sequenciamento).
2. Para um tubo de centrifugação de 0,2 mL, adicione µ l 25.5 da RBF e 12 µ l de água livre de nuclease mantida à temperatura ambiente.
3. Misture o LLB pipetando altos e baixos. Adicione 26.5 µ l do LLB ao tubo de 0,2 µ l. Misture os reagentes pipetando altos e baixos.
   Nota: O LLB tende a resolver fora da mistura.
4. Adicione 11 µ l da biblioteca adaptada e amarrada ao tubo de 0,2 µ l. Misturar por inversão e rotação para baixo por centrifugação de pulso.
5. Adicione 75 µ l de amostra da etapa 9,4 à porta "SpotOn" gota a gota. Certifique-se de que cada gota flui na porta antes de adicionar a próxima.
6. Cuidadosamente Recoloque a tampa de porta de amostra para que a rolha entra no porto e feche a tampa do dispositivo.

11. a partir de um roteiro de protocolo de Software de sequenciamento

1. Abra o menu suspenso sob 'Select Program' e selecione "sequenciamento de 48 horas."
2. Clique no botão "Executar" para iniciar o script.
3. Verificar os resultados da Mux scan relatado no fluxo de notificação para o número de poros ativos o MUX scan.
   Nota: Este número pode ser diferente do número de poros em executar o QC e uma diferença grande pode indicar um problema.
   1. Se houver uma redução significativa dos poros ativos da execução do QC, reiniciar o software e se ainda há uma diferença significativa, reinicie o computador.
4. Verifique a temperatura do dissipador de calor é 34 ° C conforme relatado pelo script software de sequenciamento.
   Nota: Se a temperatura está não a 34 ° C e então não haverá bastante ativos poros para a corrida.
5. Verifica o histograma de leitura comprimentos para determinar se os comprimentos de sequência são esperados e apropriado para o delineamento experimental.
6. Feche o agente desktop usando 'fechar x.' Quit o software de sequenciamento por fechar a web GUI. Desconecte o dispositivo do computador.

12. análise da execução e resultados

Nota: Durante a execução de sequenciamento, os dados podem ser monitorados usando o programa "Ver relatório" usando o agente de área de trabalho. Durante ou após a execução completa, arquivos estão disponíveis em um formato de arquivo no → dados lê → passar pasta (padrão) de FAST5. Se esta pasta é aberta enquanto sequenciamento está ativo, o computador pode congelar.

1. Para exibir e manipular sequências, baixe um "HDFViewer".
2. Para exibir os arquivos de sequenciamento, diretamente aberto HDF visualizador → abrir dados pasta → selecionar que todos arquivo tipos → selecione c: unidade (padrão) → Selecione dados → selecione leituras → selecione pass.
3. Encontre e selecione o arquivo FASTQ no menu suspenso à esquerda; arquivos serão aberta e podem ser salvos no formato FASTQ.
   Nota: A experiência do aluno, com a finalidade de sequências de 350 nucleotídeos ou mais foram selecionadas para uma análise mais aprofundada. Saída da chamada base permite ao usuário classificar leituras de sequência com base no tamanho. Arquivos FASTQ podem ser analisados via BLAST (NCBI) ou outros programas de Bioinformática.

Resultados

A tecnologia de projeto e nanopore experimental forneceu um método rápido e barato para os alunos a sequência de DNA de solo. A gerência representante passados os parâmetros de controle de qualidade, com mais de 800 poros disponíveis para sequenciamento. A execução resultou em mais de 125.000 leituras disponíveis para estudo com um comprimento de sequência mediana de 5,38 kb. Sequências são dadas a um índice de qualidade e somente aquelas sequências com pontuações aceitáveis foram então analisadas. Como a saída da sequenciação de reação é no formato de FAST5, que não é aceito pelos programas tais como BLAST (NCBI), as sequências foram vistas no Visualizador de HDF, que converte as sequências em formato de FASTQ, que é compatível para análise de explosão. No futuro iterações do software, os dados estarão disponíveis como um formato FASTQ, eliminando a necessidade para o visualizador HDF. Ver complementares figuras 1, 2 e 3.

50 sequências de mais de 350 nucleotídeos de comprimento foram objecto de análise por BLASTN (nucleotídeos no banco de nucleotídeo) ou BLASTX (nucleotídeos traduzidos em sequência de aminoácidos) (NCBI) para identificar os organismos na amostra de solo. Dado o tempo restrições de classe e que o foco do curso é sobre métodos laboratoriais e não de bioinformática, temos os alunos analisar sequências dentro desses parâmetros. Nossas aulas de Bioinformática podem usar os dados para o desenvolvimento de ferramentas de análise de pipeline. Este nível de análise bioinformática não é coberto na classe de laboratório com base. A tabela 1 é uma lista dos organismos que foram identificados com valores de menos de 4 e-04. Em geral, e-valores inferiores a 4 e-04 indicam forte similaridade entre a sequência de entrada (consulta) e a sequência correspondente. Os organismos identificados por BLASTN (contra o banco de dados não-redundante (nr)) são de uma grande variedade de espécies e estão disponíveis para mais genômica e análises de proteína. Esta amostra de solo, que veio de um jardim no Condado de Baltimore, MD nunca havia sido testada, então não havia nenhum dados anteriores de que para determinar o que os organismos podem estar no solo. BLASTN (contra o banco de dados nr) análise também indicou que havia sequências com nenhum semelhanças no banco de nr. Para determinar se estas são verdadeiramente novas sequências, é necessário um estudo mais aprofundado. Análise de várias sequências por BLASTX revelou várias proteínas de organismos não representados na análise BLASTN. A tabela 2 lista várias proteínas possíveis incluindo endopeptidases e ATPase, como proteínas. Usando esta biblioteca de sequências, os alunos têm a oportunidade de usar mais sofisticadas ferramentas de Bioinformática para realizar uma análise mais aprofundada, se dirigido pelo instrutor.

Figura 1 : Preparação da biblioteca genômica. Passos para elaboração de biblioteca de DNA genômica de sequenciamento, usando a tecnologia de nanopore. Esta figura foi modificada com as permissões necessárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 . Esquemático de sequenciamento de DNA usando um nanopore. DNA, passando através de uma membrana nanopore com identificação de base e de geração de sinal elétrico. Esta figura foi modificada com as permissões necessárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Organismo	valor de e
Streptomyces sp.	3.00E-06
Nocardoides sp.	5.00E-04
Gordonia sp.	5.00E-04
Hyphomicrobium nitrativorens	1.00E-139
Starkeya novela	1.00E-31
Hyphomicrobium denitrificans	1.00E-30
Fibomicrobium sp.	5.00E-17
Pseudomonas sp.	2.00E-15
Rhodothemus marinus	1.00E-17
Turneiella parva	2.00E-24
Escherichia coli	0.00E + 00
Bradyrhizobium sp.	3.00E-30
Gemmatirosa kalamazoonesis	1.00E-20
Burkholderia sp.	8.00E-10
Sphingomonas sp.	8.00E-10
Cellumonas sp.	6.00E-11

Tabela 1: selecionados os resultados da análise BLASTN. Sequências de DNA de metagenômica de solo submetidas a pesquisa de similaridade BLASTN contra o banco de dados do NCBI nucleotídeo não-redundante. Os dados relatados possuem valores e de 4 x e-4 ou menos.

Proteína	Organismo
Proteína hipotética	Acidobacter bactéria
Metiltransferase dependente de SAM	H. denitrificans
ATPase	Jannaschia sp.
Endopeptidase	Shigella sonnei
Proteína de Lise	Escherichia coli

Tabela 2: selecionados os resultados de análise BLASTX. Sequências de DNA de metagenômica de solo submetidas a pesquisa de similaridade BLASTX contra o banco de dados do NCBI proteína não-redundante.

Suplementar Figura 1: resultados da plataforma QC. São apresentados os resultados da plataforma do QC. No canto superior direito estão os resultados do QC para poros ativos. Cada quadrante da célula de fluxo é testado para poros ativos. A página principal é dinâmica e muda conforme cada quadrante é testado. Este prazo, 1.414 poros único foram detectados.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 2: FAST5 convertendo arquivos para arquivos FASTQ. Aqui do lado direito, é a saída dos dados da corrida sequenciamento. Cada linha representa uma sequência de individual. O lado esquerdo da figura mostra a sequência de destaque do lado direito, no Visualizador de HDF que converte a sequência de um arquivo FASTQ que pode ser usado para uma análise mais aprofundada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 3: sequência de exemplo de FASTQ no Visualizador de HDF. Esta sequência (leitura 803) está em um arquivo FASTQ que converte os dados de FAST5 em nucleotídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Muitos métodos de sequenciamento de geração seguinte foram gerados e cada um depende de sequenciamento por síntese mas as plataformas de deteção para a identificação de nucleotídeos diferem. NS, a mais recente adição ao mercado, usa um método diferente inteiramente, que não exige uma reação de sequenciamento ou rotulados de nucleotídeos. Este método aproveita-se de diferenciais de carga de nucleotídeos já incorporados como eles passam através de um poro eletrificado. A identificação de cada nucleotídeo ocorre pela modulação da corrente elétrica por diferentes bases como passam através do nanopore. Este sistema multiplexado permite ao usuário sequenciar muitos fragmentos de cada vez. Por sequenciamento ambos os filamentos do DNA, a precisão da sequência é significativamente maior e o software de sequenciamento, o que pode ser carregado em um computador portátil, processa os sinais e fornece as informações de sequência que podem ser analisadas.

Em pyrosequencing, um sequenciamento pelo método de síntese (SBS), deteção da base específica incorporada o modelo varia de acordo com o ensaio do luciferase e a geração de sinais quimioluminescente⁸. No sequenciamento do semicondutor de íon, o íon de hidrogênio liberado, que diminui o pH é detectado por um sensor de íon⁹. Sequenciamento em tempo real única molécula depende o zero modo onda guia (ZMW)¹⁰, que se acende para a deteção de uma molécula fluorescente etiquetada para o nucleotídeo incorporado. SBS utiliza um método exclusivo para amplificar o DNA alvo tal que clusters de sequências únicas são gerados¹³. Detecção do nucleotide adicionado é obtida quando a fluorescência do nucleotide etiquetado é gravada. NS por outro lado tem a única vantagem sobre outros métodos em que requer recursos técnicos limitados, é portátil, produz o tempo sequenciamento leituras, requer sem prévia amplificação de DNA e pode ser operado a um custo reduzido em comparação com outros métodos. Nossos alunos encontraram o protocolo de preparação de biblioteca nova, rápida para ser simples e passível de uma classe de laboratório de três horas. Alguns dos problemas que encontramos eram bolhas na célula de fluxo que eram difíceis de remover, é necessário poder significativos do computador (um terabyte de armazenamento), a corrente de saída de dados está em um arquivo de FAST5 e a célula de fluxo de sequenciamento tem uma vida útil limitada antes se deteriora. Além disso, outras desvantagens da ligadura NS sequenciamento (protocolo longo) é que requer várias etapas de preparação de biblioteca, requer conhecimentos em técnicas de biologia molecular e gera fidelidade sequenciamento reduzido quando comparado a alguns metodologias de sequenciamento³. No entanto, recentes avanços com o novo kit de preparação rápida biblioteca requer apenas 10 min para a preparação de biblioteca e demonstrou uma taxa de erro de sequenciamento reduzida. O novo método de preparação de biblioteca foi muito favorável para uso em uma classe de laboratório.

Existem vários passos críticos no protocolo, nomeadamente o QC da célula de fluxo. Isso inclui realizando um QC inicial no prazo de cinco dias a contar da recepção da célula de fluxo e usá-los no prazo de 8 semanas. Embora nós usamos células de fluxo que eram além de 8 semanas, o número de poros aberto/ativo é muito reduzido. É importante que as experiências são planejadas para encaixar uma linha do tempo onde a utilização máxima das células de fluxo é alcançada. Nós temos usado o protocolo de limpeza e reutilizado as células de fluxo com sucesso.

Investigando a metagenômica de representam solo um reservatório genético inexplorado da diversidade microbiana. Por exemplo, um grama de solo é estimado para conter entre 10⁷ - 10⁹ células procarióticas¹⁴. Além disso, os organismos do solo são a principal fonte de novos produtos naturais, enzimas e antibióticos. Análise de sequência de DNA do solo metagenomics representa, assim, uma valiosa ferramenta instrucional para estudantes em todos os níveis da educação. A tecnologia NS facilidade de uso e baixo custo fazem deste sistema uma ferramenta muito eficaz de ensino. Os alunos podem de sequência de amostras ambientais e após a conclusão da sequência de usar ferramentas de Bioinformática disponíveis para identificar e caracterizar os micróbios e metagenômica sequências em amostras do teste. Usando a tecnologia NS, os alunos têm a verdadeira experiência hands-on, que tem até agora sido de alcance para utilização em cursos de laboratório por causa da perícia técnica avançada e custos elevados de reagente, equipamentos e manutenção em outras plataformas de sequenciamento. Recentemente, um dos nossos alunos (J. Harrison, comunicação pessoal) relatou o uso desta tecnologia em um projeto de monitoramento ambiental de solos agrícolas. Esperamos que haverá muitas mais aplicações para esta tecnologia na área de educação.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Cycler	LifeECO	BTC42096
Covaris g-TUBE	Covaris	520079
NEBNext End Repair Module	New England BioLab	E7546
Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes	Sigma-Aldrich	Z666505
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	New England BioLab	MO367
MyOne C1 Strepavidin Beads	Thermo Fisher	65001
Eppendorf microcentrifuge	Eppendorf		Model 5420
Nanodrop UV spectrophotometer	Thermo Fisher	ND-2000	Model 2000
Belly Dancer Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	Z768499
Power Soil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
Ligation Sequencing Kit 2D	Oxford Nanopore	SQK-LSK208
Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA	Oxford Nanopore	SQK-RAD002
End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)	New England BioLab	MO367
AmPure XP Magnetic Beads	Beckman Coulter	A63880
Basic Starter Pack	Oxford Nanopore		Includes MinION  Sequencing Device and Flow Cell
MinKNOW software	Oxford Nanopore
Rapid Sequencing Kit for Genomic DNA	Oxford Nanopore	SQK-RAD002	Includes Running Buffer with Fuel (RBF), Fragmentation Mix (FRM) Rapid Adapter (RAD) Library Lodaing Beads (LLB)