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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Resumo

Após infecção viral, antígeno-específicos CD8+ pilhas de T citotóxicas (CTLs) surgir e contribuir para a eliminação das células infectadas para evitar a disseminação de patógenos. Portanto, a frequência do antígeno-específicas CTLs é indicativa da força da resposta das células T contra um antígeno específico. Essa análise é importante em imunologia básica, desenvolvimento de vacinas, immunobiology de câncer e a imunologia adaptável. No campo da vacina, a resposta CTL dirigida contra componentes de um vetor viral co determina como a geração de células antígeno-específicas contra o antígeno de interesse (ou seja,, transgene) é eficaz. Antígeno-específicas CTLs também podem ser detectadas pela estimulação com peptídeos específicos, seguidos pela coloração de citocinas intracelulares ou pela coloração direta de receptores de célula T de antígeno-específicas (TCRs) e análise por citometria de fluxo. O primeiro método é um pouco demorado, pois exige o sacrifício dos animais para isolar as células dos órgãos. Além disso, ele requer isolamento de sangue de animais de pequenos porte que é difícil de executar. O último método é bastante rápido, pode ser feito facilmente com pequenas quantidades de sangue e não é dependente de funções efetoras específicos, tais como atividade citolítica. Tetrâmeros MHC são uma ferramenta ideal para detectar TCRs antígeno-específicas.

Aqui, descrevemos um protocolo para detectar simultaneamente listas de certificados confiáveis para os peptídeos imunodominantes do vetor viral VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) antígeno-específicas e transgenes (óvulos, E7 de HPV 16, eGFP) por MHC eu tetrâmero citometria de fluxo e coloração. A coloração é possível diretamente de sangue ou de suspensões de célula única de órgãos como o baço. Sangue ou única célula suspensões de órgãos são incubadas com tetrâmeros. Depois da coloração com anticorpos CD3 e CD8, CTLs antígeno-específicas são quantificados por citometria de fluxo. Opcionalmente, anticorpos contra CD43, CD44, CD62L ou outros podem ser incluídos para determinar o status de ativação do antígeno-específicos CD8+T células e discriminar entre células efetoras e ingênua.

Introdução

O objetivo desse método é avaliar a frequência das respostas dos linfócitos T citotóxicos (CTL) aos antígenos (vários) no mouse por análise de fluxo cytometric sem a necessidade de estímulo de peptídeo demorada. Esse método analisa a especificidade fenótipo e antígeno de subconjuntos de CTL, em uma única mancha. Nós aperfeiçoamos o complexo de histocompatibilidade Major eu (MHC eu) tetrâmero mancha o protocolo para analisar a eficácia de novas abordagens de vacina, tais como VSV-GP, uma nova variante do vírus da estomatite vesicular (VSV), onde a glicoproteína G de VSV foi substituída pelo glicoproteína GP da coriomeningite linfocítica (LCMV) de vírus1,2. Além da resposta humoral, uma importante leitura fora da efetividade de uma vacina é a indução de uma resposta CTL contra um ou vários antígenos. Como a consistência e a durabilidade da resposta celular são importantes neste contexto, é favorável para monitorar a cinética de respostas CTL do mesmo animal. Isso também levará a uma redução do número de animais, um aspecto importante sobre os princípios dos "3Rs"3. Portanto, análise de tão pouco como 20 µ l de sangue é ideal para esta finalidade.

Tetrâmeros foram desenvolvidos no final da década de 904 e tornou-se uma ferramenta importante no campo da imunologia celular T. Tetrâmeros são complexos fluorescente-etiquetadas de MHC quatro eu / moléculas de peptídeos, que se ligam à TCRs, específicos para um único peptídeo. Hoje em dia, podem ser também comprados pronto-a-5, personalizado-ordenados gratuitamente na instalação de núcleo de tetrâmero de NIH na Emory University6 ou produzidos no laboratório7. MHC I e tetrâmeros II estão disponíveis, , ou seja, para CD8+ e CD4 células+ T, respectivamente. A potência de manchar o tetrâmero encontra-se economia de tempo, bastante simples e fácil para padronizar protocolos de8 e sensibilidade9. Também, se trabalhar com sangue, animais não precisa ser sacrificado, e quantidades mínimas de amostra são necessárias. Uma medição não está limitada a um único antígeno, mas vários antígenos podem ser analisados em uma coloração quando combinar tetrâmeros conjugados com diferente fluorophores. Antígenos recém descobertos, por exemplo, a partir de telas de peptídeo, facilmente podem ser incorporados em tetrâmeros e usados para quantificação do subconjunto de células T.

Tetrâmero coloração não dará informações sobre a funcionalidade de lista de certificados confiáveis (ou seja., produção de citocinas, funções efetoras), mas apenas a especificidade. Para obter informações sobre a funcionalidade de células T, citocinas intracelulares coloração (ICS) ou ensaio enzima Linked Immuno Spot (ELISpot) precisa ser realizada8,10. Tetrâmero manchando e ICS/ELISpot, redundante porém não prefere se complementam. Estimulação in vitro para induzir a produção de citocinas para ICS/ELISpot irá alterar o fenótipo de células T original. Tetrâmero manchando, em contraste, deixa a célula T intocado; o fenótipo original é preservado e pode ser analisado. Além disso, outra grande vantagem de tetrâmeros é que mancha pode ser combinado com classificação magnética e enriquecimento de células antígeno-específicas11. Isto permite a análise de populações raras, bem como o cultivo de células classificadas com antígeno-especificidades definidas — um recurso que não é ser possível com outros métodos.

Usando o protocolo descrito aqui, tetrâmero coloração, bem como ICS/ELISpot pode ser realizada de um órgão, porque só muito pouco material (sangue: 20 µ l; baço: 1 x 106 células) é necessária para a coloração de tetrâmero. No entanto, dependendo da frequência das células antígeno-específicas de interesse, a força dos respectivo TCR e o contexto experimental, a quantidade de células necessário talvez precise ser ampliados ou enriquecimento magnético pode ser necessária.

Tetrâmeros são amplamente utilizados, por exemplo, para avaliar a efetividade das vacinas (antitumoral)12,13,14,15 ou imunoterapia16,17, análise fenotípica e espacial Localização de pilha de T antígeno-específicas subconjuntos18,19,20,21,22,23. O método descrito aqui é adequado para estudos, que visam incluir a quantificação e análise fenotípica de murino antígeno-específicos CD8+ T células em sua análise de forma rápida e conveniente.

Protocolo

Todos os métodos descritos foram realizados em conformidade com o austríaco Animal experimentação legislação nacional ("Tierversuchsgesetz"), e o animal experimental permissão foi concedida pelas autoridades nacionais austríacos.

1. buffer preparação e coleta da amostra

Nota: A cepa de rato usada depende o epítopo analisado. Escolha um tetrâmero apropriado que vincula um MHC tipo expressado nos ratos, por exemplo,, H - 2Kb para camundongos C57BL/6. O sexo e idade dos animais dependerá a questão científica. Para a maioria dos experimentos descritos aqui, use ratos fêmeas em 6-8 semanas de idade no início do experimento, ou seja,, primeira imunização.

  1. Preparar FACS Buffer (tampão fosfato salino (PBS) + soro fetal bezerro de 1% (FCS) + 0,1% de azida de sódio + ácido de 2mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e buffer de fixação FACS (formaldeído de 1,5% (v/v) em PBS).
    Nota: Recomenda-se que ambos os amortecedores são preparados antecipadamente. Armazenadas a 4 ° C até o uso.
  2. Sangue: Coletar 20 µ l de sangue por rato da veia da cauda do rato em tubos de EDTA-revestidos, conforme descrito anteriormente,24.
    Nota: Sangue também pode ser recolhida por outras vias, por exemplo,, vena facialis ou sinus retrô-orbital. No entanto, o método de coleta de sangue tem que estar em conformidade com a lei nacional de experimentação animal e aplicações de experimentação animais. Coleta de sangue da veia da cauda é ideal para estudos onde várias vezes pequenas quantidades de sangue são necessários. Material adicional é necessário para controles de compensação e o controle não-coradas.
  3. Baço: Isolar o órgão e, com a ajuda do êmbolo de uma seringa, pressione através um 70 nm e filtro de célula de 40 µm. Realize a lise de eritrócitos, conforme descrito na etapa 6 e contagem. Ajuste a concentração de 1 x 107 células/mL de PBS. Por exemplo, 1 x 106 células são necessárias.
    Nota: Sempre incluir alguns simulado imunizados ou controlar animais imunizado de vetor como controlo negativo. Para ovalbumina (OVA)-tetrâmero, uma amostra de ratos de OT-1 pode ser usado como controle positivo. Não se esqueça imaculado e controles de compensação no cálculo. Se necessário, amostras de diferentes animais no experimento podem ser agrupadas para isto.
  4. Após a coleta da amostra, proceda directamente com a coloração.

2. mancha de set-up

  1. Prepare um tubo de FACS para cada amostra. Rotule os tubos corretamente e transferir 100 μL da suspensão de órgão (1 x 106 células) ou 20 μL de sangue em cada tubo.
  2. Baço: Centrifugue por 5 min a 600 x g a 4 – 8 ° C e descartar o sobrenadante. Vórtice para Ressuspender as células.
    Nota: Isso resultará em um volume restante de cerca de 20 µ l, semelhante como o volume para as amostras de sangue.
  3. Para cada canal a ser usado também prepare um tubo de FACS para uma amostra de compensação. Prepare uma amostra adicional como um controle imaculado.

3. tetrâmero de coloração

  1. Para cada amostra, use 50 μL de diluição do tetrâmero. Para tetrâmeros sugeridos e diluições otimizadas, consulte a tabela 1.
    Nota: Ao trabalhar com tetrâmeros ou anticorpos, desligue a luz da segurança do armário e proteger amostras de luz.
    1. Prepare um tubo com buffer de FACS (volume = 50 μL × número de amostras mais adicional de 10% do volume total para compensar erros de pipetagem).
    2. Adicione tetramer(s) a diluição ideal, conforme listado na tabela 1. A solução de vórtice.
      Nota: Ao usar o painel todo anticorpo (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L) com fluorophores listados, dois tetrâmeros (em PE e APC) podem ser incluídos. Ambos os tetrâmeros podem ser combinados em uma única mancha, ou seja,, coloração das células com ambos os tetrâmeros pode ser executada simultaneamente.
TetrâmeroSequência do peptideAleloFluoróforoDiluição
MHC EU / ÓVULOSSIINFEKLH - 2KbAPC01:25
MHC EU/VSV-NPRGYVYQGLH - 2KbPE01:25
MHC EU / EGFPHYLSTQSALH-2KdPE01:25
MHC EU/LCMV-GPKAVYNFATCH-2DbAPC01:25
MHC EU / HPV 16 E7RAHYNIVTFH-2DbAPC01:10

Tabela 1: sugeriu tetrâmeros e diluições ideais. Tetrâmeros recomendados para alguns peptídeos imunodominantes de antígenos de modelo (ovalbumina (OVA) e proteína verde fluorescente melhorada (eGFP)) ou componentes de patógeno (estomatite Vesicular (VSV) de vírus cadeia (NP), vírus de coriomeningite linfocítica (LCMV Glicoproteína) (GP) e a oncoproteína E7 de papilomavírus humano (HPV) (E7)). Para cada um, a sequência do peptide e alelo correspondente, também como recomendado fluoróforo e otimizado de diluição está listado.

  1. Adicione 50 μL de diluição tetrâmero de cada amostra e vórtice suavemente. Adicione tampão FACS apenas (sem tetrâmero) aos controles de compensação e a amostra imaculada.
  2. Incube as amostras por 20 min a 37 ° C, protegido da luz. Para garantir uma transição suave do tetrâmero de anticorpo que mancha, prepare a mistura de anticorpo conforme descrito na etapa 4, durante o tempo de incubação.
    Nota: Para cada tetrâmero individual, condições ideais (diluição, temperatura e tempo de incubação) precisam ser ajustado.

4. preparação de anticorpos

  1. Para cada amostra, prepare-se 50 µ l de mistura de anticorpo.
    1. Prepare um tubo com buffer de FACS (volume = 50 μL × número de amostras mais adicional de 10% do volume total para compensar erros de pipetagem).
    2. Acrescente os anticorpos nas diluições, conforme listado na tabela 2.
      Nota: Dependendo da questão científica, podem ser usadas outras combinações de marcador além do descrito aqui. Certifique-se de sempre incluem anticorpos CD3 e CD8 no painel.
    3. A solução de vórtice.
AnticorpoFluoróforoDiluiçãoµ g/amostraMarcador
CD3PE-Cy71: 2000.05Listas de certificados confiáveis (CD3+CD8+)
CD8Azul do Pacífico1:7500,013
V4501: 1000.1
CD43FITC1: 1000.25Ativação (CD43+)
CD44PE-Cy51: 2500,04Naive (CD44–CD62L+) & effector (CD44+CD62L–)
CD62LAPC-Cy71: 5000.02

Tabela 2: anticorpos utilizados neste protocolo e diluições ideais. Marcadores de superfície recomendados (CD3, CD8, CD43, CD44 e CD62L) são listados na primeira coluna. Para cada um, o fluoróforo recomendado, diluição otimizada e quantidade de anticorpo/amostra estão listados. Na última coluna, o tipo de célula identificado com cada marcador é especificado.

  1. Prepare-se anticorpos para controles de compensação. Para cada controle de compensação, use um anticorpo contra CD8 na cor respectiva.
    1. Para cada canal, prepare um tubo com 200 μL de tampão de FACS e adicionar 1 μL de um anticorpo de diluição de 1: 200 contra CD8 na cor respectiva.
    2. Vórtice os tubos.
  2. Imediatamente, proceda com a coloração.

5. a coloração das amostras

  1. Lavar as amostras uma vez adicionando ~ 1 mL de tampão de FACS e centrifugar por 5 min a 600 x g , 4 – 8 ° c. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e escorra o líquido restante sobre uma pilha de toalhas de papel.
    Nota: Quando se trabalha com sangue, seja cauteloso quando a drenagem do líquido restante. Antes a lise de hemácias, sangue não vai ficar no fundo do tubo FACS. Alternativamente, Aspire o sobrenadante.
  2. Adicione 50 μL do anticorpo mix para cada centrifugado e vórtice suavemente.
  3. Adicione 50 μL de cada mistura de compensação para o centrifugado do controle correspondente compensação e vórtice suavemente.
  4. Adicione 50 μL de tampão, FACS para o centrifugado do controle imaculado e vórtice suavemente.
  5. Incube as amostras por 30 min a 4 ° C, protegido da luz.
  6. Ao trabalhar com órgãos: ignorar a etapa 6. Lave uma vez adicionando ~ 1 a 2 mL de tampão de FACS e centrifugar durante 5 min à 600 x g , 4 – 8 ° c. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e escorra o líquido restante sobre uma pilha de toalhas de papel.
  7. Quando se trabalha com sangue: avance para o passo 6 (lise de eritrócitos).

6. lise de eritrócitos

  1. Adicione 500 μL de tampão ACK (amónio-cloreto-potássio)25 para cada amostra e delicadamente o vórtice.
    Nota: Buffer de ACK vai levar a edema osmótica e lysis, especificamente das hemácias.
  2. Incube durante 5 min à temperatura ambiente no escuro.
  3. Adicionar 1 mL de tampão de FACS e centrifugar por 5 min a 600 x g , 4 – 8 ° c. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e escorra o líquido restante sobre uma pilha de toalhas de papel.
    Nota: Quando a pelota é bastante vermelha, repita a lise de eritrócitos.
  4. Lave uma vez adicionando ~ 1-2 mL FACS buffer e centrifugar durante 5 min à 600 x g , 4 – 8 ° c. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e escorra o líquido restante sobre uma pilha de toalhas de papel.

7. fluxo Cytometric medição e análise

  1. Adicionar 150-300 μL de tampão de fixação de FACS a cada tubo e misture por num Vortex. Para 20 µ l de sangue, 150 µ l de tampão é suficiente.
    Nota: Antes da fixação, certifique-se que as células são bem re-suspensas a fim de evitar a formação de aglomerados. Prossiga com a medição de fluxo cytometric tão rapidamente quanto possível.
  2. Medir os controles de compensação e corrigir quaisquer sobreposições espectrais.
  3. Configurar portas sequenciais, conforme representado na Figura 1 para selecionar para CD3+/CD8+ células.
    1. Portão em linfócitos usando dispersão para a frente e lateralmente (área) (não-logarítmica da escala).
    2. No seio da população de linfócitos, portão em únicas pilhas usando dispersão frente largura vs área (escala não-logarítmica).
    3. Traça os linfócitos única célula usando canais CD3 e CD8 (escala logarítmica). Identificar o CD8+ T células pelo gating no CD3+/CD8+ células.
    4. Plotar CD8+ vs tetrâmero+ células e portão em CD8+ + de tetrâmero células, conforme representado na Figura 2.
  4. Se possível, gravar 20.000 células (pelo menos 5.000 células do sangue) no CD3+/CD8+ portão para cada amostra e salve como um arquivo de FCS.
    Nota: A quantidade de células para gravar talvez precise ser ajustado de acordo com a frequência das células antígeno-específicas de interesse.
  5. Analise arquivos de FCS com software de análise adequada. Use a estratégia associada, como descrito acima (seção 7.3) e quantificar CD8+ + de tetrâmero células.

Resultados

A Figura 1 demonstra como portão corretamente sobre as células alvo do presente protocolo, nomeadamente o CD3+/CD8+ células. É de notar que ativadas células frequentemente downregulate o receptor de células T26,27 e, portanto,baixa células CD3 também devem ser incluídas no gating. Após a retenção o CD3+/CD8+ células, tetrâmero positivo de células podem ser identificados (Figura 2). Representante borrões para um rato de controlo negativo (ingênuo), como bem como animais também vacinados com qualquer secretoras de óvulos adenovírus 5 (Adeno-óvulos) ou óvulos-expressando VSV-GP (VSV-GP-óvulos) são mostrados. Como pode ser visto nos borrões inferiores duas diferentes tetrâmeros podem ser combinados no mesmo tubo para a coloração. Isto permite a quantificação simultânea de dois diferentes especificidades CTL: vírus específico (VSV N) e CTLs transgene específicos (OVA). Confirmamos que o tetrâmero duplos e citológicas dar percentagens semelhantes de células positivas para cada tetrâmero. Usando este protocolo, outros vírus-específicas (ex.., LCMV GP, HPV 16 E7) ou específicas do transgene (ex.., GFP) célula T populações podem ser analisado (Supplemental Figura 1). Suplementar a tabela 1, são mostrados resultados para cinco animais após a imunização com OVA-VSV-GP — indicando a robustez do tetrâmero de coloração.

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Figura 1: Representante gating estratégia para analisar CD8+ T células no sangue. Representação esquemática da estratégia usada para análise de fluxo cytometric associada. Após tetrâmero manchando e fluxo cytometric medição, os dados foram analisados. Linfócitos foram identificados com dispersão para a frente e lateralmente (área) (não-logarítmica da escala). Daqueles, células únicas foram identificadas por aplicando a dispersão frente largura vs área (escala não-logarítmica). CD8+ T células foram identificadas pelo gating no CD3+/CD8+ células (escala logarítmica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Representante gating estratégia para quantificar o CD8 específicas de óvulos e N+ T células no sangue. Representação esquemática da estratégia associada usada para quantificação de fluxo cytometric de células tetrâmero+ . CD3+/CD8+ células foram utilizadas para análise de tetrâmero. Painel superior e médio: o marcador CD8 foi plotado contra respectivo tetrâmero (escala logarítmica). Painel inferior: ambos os tetrâmeros foram plotados contra o outro (escala logarítmica). Esquerda: rato de controle (ingênuo); médio: rato foi imunizado com óvulos secretoras adenovírus 5 (Adeno-óvulos); direito: rato foi imunizado com ovalbumina (OVA)-expressando VSV-GP (VSV-GP-OVA). Sangue foi coletado da veia da cauda no 7º dia após a imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Suplementar Figura 1: Resultado representativo de CD3+/CD8+ células tetrâmero+ após a vacinação. Representação esquemática de quantificação de fluxo cytometric de células tetrâmero+ . CD3+/CD8+ células foram utilizadas para análise de tetrâmero e o marcador CD8 foi plotado contra respectivo tetrâmero (escala logarítmica). Esquerda: ratos eram ingênuas, direito: ratos foram imunizados com VSV-GP (painel superior), reforçada com proteína fluorescente verde (eGFP)-expressando VSV-GP (painel central) ou VSV-GP expressando a oncoproteína E7 de papilomavírus humano (HPV) (E7) (painel inferior). Sangue foi coletado da veia da cauda no 7º dia após a imunização e manchado com tetrâmeros (LCMV-GP, eGFP e E7 do HPV). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma grande vantagem do protocolo descrito aqui é que as respostas de células T do mouse mesmo podem ser seguidas ao longo do tempo como apenas pequenas quantidades de sangue são necessários para cada medição. A Figura 3 mostra resultados exemplares para respostas de célula T, ao longo do tempo. Além de quantidades de antígeno-específicas CTLs, seu fenótipo também pode ser analisado usando esse protocolo (Figura 4).

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Figura 3: Resultado representativo de CD8+ T cell cinética no sangue após a vacinação. Representação esquemática da estratégia associada usada para quantificação de fluxo cytometric de células tetrâmero+ . CD3+/CD8+ células foram utilizadas para análise de tetrâmero e ambos tetrâmeros foram plotados contra o outro (escala logarítmica). Os painéis superiores: rato foi imunizado com óvulos secretoras adenovírus 5 (Adeno-óvulos); painéis de baixa: rato foi imunizado com ovalbumina (OVA)-expressando VSV-GP (VSV-GP-OVA). Sangue foi coletado da veia da cauda no dia 3, 7, 10 e 14 após a imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Resultado representativo de CD8+ T celular ativação e diferenciação em células efetoras e ingênua após a vacinação. Representação esquemática da estratégia associada usada para quantificação de fluxo cytometric do ativado (CD43+), ingênuo (CD44–/CD62L+) e efetoras (CD44+/CD62L–) CD3+/CD8+ células ( escala logarítmica). Esquerda: rato de controle (ingênuo); médio: rato foi imunizado com óvulos secretoras adenovírus 5 (Adeno-óvulos); direito: rato foi imunizado com ovalbumina (OVA)-expressando VSV-GP (VSV-GP-OVA). Sangue foi coletado da veia da cauda no 7º dia após a imunização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mouse #CD43%+Tetrâmero de VSV-N %+Tetrâmero de óvulos %+
zombar de11.70.450,41
20,770,690.15
31.340.350.31
41.680,830,26
50,840,470.23
VSV-GP-OVA12313.23,69
232,615,93.54
322.111,72.43
415.18.891.79
529.114,75.64

Suplementar tabela 1: Percentagens de CD3 ativado e antígeno-específicas+/CD8+ células após a vacinação. Ratos ou ingênua ou imunizados com ovalbumina (OVA)-expressando VSV-GP (VSV-GP-OVA) (n = 5). Sangue foi coletado da veia da cauda no 7º dia após a imunização e manchado com tetrâmeros (VSV-N e óvulos). Ativado (CD43+) e CD3 de antígeno-específicas (tetrâmero+)+/CD8+ células foram quantificadas por citometria de fluxo.

Discussão

Tetrâmero coloração é um protocolo bastante simples e descomplicado para analisar o fenótipo e peptídeo especificidade de um linfócito T. O uso de sangue para análise, conforme descrito aqui, é minimamente invasivo e permite o monitoramento contínuo, por exemplo em estudos de vacinação. No campo da vacinação, a quantificação das respostas de vetor antígeno-específicas e é de interesse, como respostas específicas do vetor podem dificultar uma resposta imune eficaz contra o antígeno de vacina28. Digno de nota é que com o protocolo descrito aqui, ambas as populações possam ser quantificadas simultaneamente em um único tetrâmero de coloração, reduzindo a variabilidade de coloração e quantidades de amostra. No entanto, algumas etapas precisam ser feito cuidadosamente para garantir a adequada medição e dados fiáveis. Se usar o sangue da veia da cauda para análise, um deve se certificar pré-aquecer os animais para induzir vasodilatação24. Desse modo, suficiente sangue pode ser coletado em um curto espaço de tempo, estresse nos animais é reduzido e a análise é muito melhor, comparado a se o sangue é colhido lentamente. Também, após a coleta de amostra (sangue ou órgãos), coloração directa é recomendado para evitar resultados falsos negativos devido a downregulation TCR. O mesmo se aplica para todas as etapas subsequentes: o procedimento não deve ser interrompido e todas as etapas de lavagem reduziram para o número mínimo (como indicado no protocolo). Para garantir uma coloração adequada, deve ter cuidado ao vórtice todas as soluções e amostras antes e após a incubação. Isto é especialmente importante antes de fixar as amostras para evitar a aglutinação das células.

Em termos de modificar o protocolo, outros marcadores de superfície e tetrâmeros podem ser usados, dependendo do objetivo da análise. No entanto, todos os reagentes Então precisam ser titulado, otimamente em combinação com toda a coloração do painel. Para alguns de tetrâmeros especificados aqui, otimização revelou que podemos aumentar a diluição recomendada pelo fabricante (01:10 recomendado, otimizado 01:25) (tabela 1). Para compensar a sobreposição espectral, contas de compensação podem ser usadas em vez de células manchadas. Sobre a escolha do fluorocromo tetrâmero acoplados, um deve prever para usar fluorochromes brilhantes, como isso facilita a detecção - especialmente quando o sinal é baixo. Como Dolton e colegas29, preferimos usar tetrâmeros PE ou APC-acoplados, que podem ser perfeitamente combinados em uma única mancha e CD8+ T células com uma especificidade de antígeno único podem ser bem detectada (Figura 2). Sobre tempos de incubação e temperatura, existe uma variedade de tetrâmero manchando as condições. Em nosso processo de otimização, nós abordou esta questão e executada tetrâmero coloração em condições diferentes (4 ° C, temperatura de 37 ° C). Partir dos resultados obtidos, recomendamos a mancha por 20 min a 37 ° C, que está em concordância com a literatura de30,31. Incubação prolongada deve ser evitada, pois isso pode levar à interiorização do tetrâmero30 e falsos resultados negativos.

A escolha do anticorpo certo para a deteção de CD8+ células é outra questão importante, que tem que cuidadosamente considerada (e potencialmente adaptado). Isto surge do fato de que certos anticorpos anti-CD8 clones bloquear ligação de tetrâmeros de TCR, no humano32 , bem como amostras de33 de rato. Para nosso tetrâmero mancha o protocolo, selecionamos clone 53 – 6,7 a mancha para CD8 murino+ células — um clone que não bloqueia, mas melhora bastante tetrâmero de coloração.

Tetrâmero coloração é bastante descomplicado quando analisando proeminentes respostas imunes no auge da resposta das células T, por exemplo. No entanto, pode haver populações que são um pouco mais 'problemáticas'. Tais exemplos incluem células específicas para antígenos de baixa afinidade (tumor, auto), recentemente registrados células que posteriormente para baixo-regulado seus receptores ou subconjuntos de células raras (ex.. ingênuo precursor ou memória populações de células). Nesses casos, o tetrâmero clássico que mancha o protocolo talvez precise ser melhorado ou combinado com outros métodos. Por exemplo, a proteína quinase inibidor (PKI) dasatinib inibe a internalização de TCR e pode ser incluído antes da coloração do tetrâmero. Tetrâmeros também podem ser estabilizados por incluindo antifluorocromo unconjugated primário Abs depois tetrâmero da coloração. Além disso, a intensidade de fluorescência pode ser aumentada pela adição de um segundo anti-Ab conjugados a fluorocromo Ab29,34,35,36. Nós otimizadas as condições seletivamente para os tetrâmeros especificados no presente protocolo e não incluem PKI ou Abs adicional. No entanto, para qualquer outro tetrâmero, as condições ideais tem que ser ajustado individualmente. No que se refere a populações raras, tetrâmero coloração talvez precise ser combinado com enriquecimento magnético11.

Para facilitar e validar a análise de FACS do tetrâmero coloração, controles negativos e positivos devem ser incluídos. Como um controle negativo, nós sempre manchar as células de um rato de ingênuo da mesma estirpe com nosso tetrâmero de interesse. Alternativamente, as amostras podem ser manchadas com tetrâmeros com peptídeos irrelevantes, mas com o fluorocromo mesmo como o tetrâmero de interesse. Esses controles são essenciais para excluir sinais positivos falsos, por exemplo., originários de células morrendo. Além disso, é recomendável incluir uma mancha ao vivo/morto, como o iodeto de propidium (PI). Isto é de especial importância se as células não estão manchadas diretamente após o isolamento. Outra estratégia para remover fundo de autofluorescência pode ser para incluir vários marcadores de células não-T em um canal. Excluindo células positivas neste canal, populações de células não-T podem ser excluídas. Como um controle positivo, uma amostra de um mouse de OT-1 pode ser usada para tetrâmero de óvulos, por exemplo. Para outros tetrâmeros, isso tem que ser escolhido individualmente (por exemplo., amostra de um mouse, que foi imunizado várias vezes). Tanto os outros37, também observamos uma regulação para baixo do receptor CD8 durante a ativação do CTL no dia 7 da resposta das células T efetoras. Portanto, para evitar a perda de células efetoras T de tetrâmero ativado+ , recomendamos incluir células CD8baixa na análise (pelo menos se medindo na fase efetora).

A qualidade e a quantidade de informação que um pode recuperar do presente protocolo é dependente do conhecimento sobre o antígeno a ser estudado, a disponibilidade e a especificidade do tetrâmero e a qualidade da máquina FACS (número de lasers e detectores disponíveis). Se trabalhar com amostras de animais, a variação na resposta imune é natural e inevitável. Portanto, para obter resultados significativos de tetrâmero de coloração, devem ser analisados pelo menos 3-5 animais. Se fez isso, o protocolo descrito aqui dará resultados confiáveis e reprodutíveis (exemplar resultado de um experimento podem ser encontrados na Tabela complementar 1). Como mencionado anteriormente, este método é perfeitamente adequado para quantificar o fenótipo e a especificidade do antígeno de CD8+ T células (Figura 3, 4; Suplementar a Figura 1), não só no mouse mas também em seres humanos. No entanto, para analisar o CD8+ células T efetoras as funções, como morte celular induzida por granzime, ICS e/ou ELISpot precisam ser executadas. No entanto, um deve ter em mente que funções de células T, como medido por estimulação in vitro podem não representar a situação real em que vivo. In vivo, um ambiente supressora pode impedir que as funções de células T que são medidas em vitro.

Na sua própria, tetrâmero coloração não fornece todas as informações, mas evoluiu para se tornar um método essencial para caracterizar respostas de células T e quantificar subconjuntos de célula T in vitro em uma maneira muito sensível,38. Tetrâmeros só não podem ser usados para quantificar certos subconjuntos, mas também para isolar os39, localize-os por hibridação in situ19,20 e estudar a antígenos de baixa afinidade, tais como tumor-associados40, 41. desde a descoberta do tetrâmero tecnologia4, tetrâmero coloração tornou-se uma ferramenta essencial na análise de células T e a gama de aplicações.

Divulgações

Dorothee von Laer é um inventor de VSV-GP e minoria compartilha da empresa de biotecnologia ViraTherapeutics GmbH, que detém os direitos de propriedade intelectual de VSV-GP. Para outros autores, sem interesses financeiros concorrentes existem.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pelo fundo de ciência austríaco FWF (número do projeto P 25499-B13) e da União Europeia Horizonte 2020 programa de pesquisa e inovação sob concessão de contrato n º 681032. O reagente a seguir foi obtido através da instalação de núcleo do tetrâmero NIH: tetrâmero MHC de classe I para cadeia de vírus estomatite vesicular (RGYVYQGL).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Safety cabinet class 2VWRLBCP302411030
Flow cytometer (e.g. FACSCanto II)BD338962
Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo)Fisher Scientific Co. L.L.C.NC0887833
Binocular microscopes, VisiScope 100VWR630-1553
Vortex mixerPhoenix InstrumentRS-VA 10
Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R)Hettich5660
Sterile Scalpel Blades Nr. 10BraunBB510
Cell strainer 40 µmSigmaCLS431750
Cell strainer 70 µmSigmaCLS431751
Neubauer counting chamberVWR630-1506
Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL)Eppendorf4924000037, 4924000061, 4924000088
Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL)Biozym770050, 770200, 770400
Pipet BoyIntegra155 000
Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL)Sarstedt86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Multistep Pipette, HandyStep SBRAND705110
12.5 mL Combitips for Multistep PipetteBrandTech Scientific702378
Microvette CB 300 K2ESarstedt16.444
Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL)Sarstedt72.692.005, 62.547.254
FACS tubes (non-sterile)Szabo ScandicBDL352008
PBSLonzaLONBE17-516F
Heat-inactivated FCSThermoFisher Scientific10500064
FormaldehydeRoth4979.1
Sodium azideRothK305.1
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular ComplexBD560591Clone 17A2; Lot # 7235504
Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8aBD558106Clone 53-6.7; Lot # 5058904
V450 Rat anti-Mouse CD8aBD560469Clone 53-6.7; Lot # 5205945
FITC anti-mouse CD43BioLegend121206Clone 1B11; Lot # B233778
PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44BD553135Clone IM7; Lot # 85660
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62LBD560514Clone MEL-14; Lot # 7215801
OVA-tetramer/APCMBLTB-5001-2SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008
VSV NP-tetramer/PEMBLTS-M529-1RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007
EGFP-tetramer/PEMBLTS-M525-1HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004
LCMV-GP-tetramer/APCMBLTB-5002-2KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006
HPV 16 E7-tetramer/APCMBLTB-5008-2RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003

Referências

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