Um método de perfusão antegrada para isolamento cardiomiocócito de camundongos

Resumo

Desenvolvemos um método simple para isolar células cardíacas individuais de camundongos de alta qualidade pela técnica de perfusão antegrada. Este método é livre de Langendorff e útil para isolar miócitos ventriculares e atrial ou células intersticiais, como fibroblastos cardíacos ou progenitores.

Resumo

Em pesquisas básicas usando coração de rato, isolar cardiomiócitos individuais viáveis é um passo técnico crucial a ser superado. Tradicionalmente, cardiomiócitos isolando de coelhos, cobaias ou ratos tem sido realizado através de perfusão retrógrada do coração com enzimas usando um aparelho Langendorff. No entanto, um alto grau de habilidade é necessário quando este método é usado com um pequeno coração de rato. Um método de perfusão antegrada que não usa um aparelho Langendorff foi recentemente relatado para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Nós aqui relatamos um protocolo completo para a melhor perfusão antegrada do coração excisado para isolar células cardíacas individuais de camundongos adultos (8 a 108 semanas de idade). A perfusão antegrada é realizada injetando perfusato perto do ápice do ventrículo esquerdo do coração excisado, da qual a aorta foi presa, usando uma bomba de infusão. Todos os procedimentos são realizados em um tapete de aquecimento pré-aquecido sob um microscópio, que permite que os processos de injeção e perfusão sejam monitorados. Os resultados sugerem que miócitos ventriculares e atrial, e fibroblastos podem ser bem isolados de um único rato adulto simultaneamente.

Introdução

Geralmente, o primeiro passo do isolamento celular único do tecido dissecado envolve picar o tecido em pequenos pedaços, seguido pela digestão do tecido conjuntivo e matriz extracelular com enzimas. No entanto, os cardiomiócitos não podem ser isolados com tal método de corte, pois o enriquecimento com componentes da matriz extracelular, incluindo fibras de colágeno e elastina, torna o miocárdio muito difícil de picar, e os cardiomiócitos são altamente sensíveis à hipóxia e outras alterações no microambiente. Assim, utilizando-se o sistema de perfusão retrógrada baseado em Langendorff¹, desenvolveu-se um método de digestão da matriz extracelular com enzimas para isolar cardiomiócitos individuais do coração^2,3,4.

Em modelos de camundongos, a perfusão retrógrada baseada em Langendorff do coração com enzimas também é usada para o isolamento de cardiomiócitos individuais^5,6,7,8. No entanto, a canulação da pequena e fina aorta do rato e sua montagem no aparelho Langendorff para realizar a perfusão retrógrada requer um alto grau de habilidade, uma vez que o diâmetro da aorta no coração adulto é de aproximadamente 1,2 mm. Além disso, leva tempo para realizar vários experimentos, pois o aparelho Langendorff deve ser limpo antes de perfumar o próximo coração.

Como alternativa à perfusão retrógrada, foi desenvolvido um novo método para isolar cardiomiócitos de um coração de rato adulto sem um aparelho Langendorff. Este método de produção de época foi baseado na perfusão antegrada das artérias coronárias⁹. Recentemente melhoramos cada etapa deste protocolo antegrado, como a fixação da aorta, inserção da agulha e controle de temperatura, e monitoramos todos os procedimentos de perfusão com um microscópio¹⁰. Aqui informamos em detalhes o refinamento deste método de perfusão antegrada para encurtar o tempo de isolamento e fornecer um vídeo suplementar. Neste método, a perfusão do coração leva aproximadamente 7 minutos com 10 mL das enzimas, e este curto período de digestão aumenta a viabilidade das células. Trata-se de um método simples para isolar células cardíacas únicas em alta qualidade sem exigir a adição de produtos químicos, como monoxime de butanedione de 2,3 butanione (BDM)^6,11 ou taurina^5,8. Acreditamos que este método diminuirá o limiar de habilidade da técnica e aumentará a utilidade dos cardiomiócitos do rato na pesquisa básica.

Protocolo

Todos os experimentos em animais conformes ao Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NiH Publication No. 85-23, revisado em 1996) e foram aprovados pelo Conselho de Revisão institucional do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Shiga (aprovado nº 2019-3-7). Os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas.

1. Instrumentos e solução

NOTA: Um esboço do procedimento experimental é ilustrado em um diagrama de fluxo(Figura Suplementar 1). Uma bomba de infusão (ou bomba de seringa) deve ser usada para a perfusão antegrada do coração com um fluxo unidirecional. Uma bomba peristáltica que cria um fluxo pulsante não é recomendada.

1. Antes do experimental
   1. Marque a agulha de injeção em um local a aproximadamente 3 mm da ponta com esmalte. Depois de permitir que o ar seque, mantenha-o no recipiente à temperatura ambiente. Uma cor vermelha ou brilhante é desejável confirmar a profundidade de inserção no miocárdio durante a perfusão.
   2. Faça o coração ficar de pé cortando as tampas de tubos de amostra de 1,5, 0,5 e 0,2 mL e anexando as tampas ao fundo de um prato de cultura de 60 mm com fita dupla face ou adesivo. A fixação de três tampas de tamanho diferente em um prato torna possível escolher a apropriada de acordo com o tamanho do coração do rato. Esta posição do coração pode ser reutilizada após a lavagem.
   3. Faça a solução de estoque como mostrado na Tabela 1. Armazene as soluções de estoque a 4 °C.
2. No dia do experimento
   NOTA: O tampão de isolamento celular (CIB) contém (em mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl₂, 0,33 NaH₂PO_4,22 glicose, 40 unidades/mL de insulina e 25 HEPES (pH ajustado para 7,4 com NaOH); e a solução Tyrode contém (em mM) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1.8 CaCl₂, 0,5 MgCl₂, 0,33 NaH₂PO_4, 5,5 glicose e 5,0 HEPES (pH ajustado para 7,4 com NaOH).
   1. Prepare o CIB. Aqueça 160 mL de água destilada (DW) usando um micro-ondas para cerca de 32 °C e, em seguida, adicione 20 mL de 10X CIB. Após a adição de 0,79 g de glicose e 10 μL de solução de insulina, ajuste o pH usando 1 M NaOH e leve para 200 mL com DW.
   2. Prepare a solução de mistura de enzimas (mistura de enzimas). Adicione 30 mg de colagenase, 1,8 mg de trippsina, 1,8 mg de protease e 90 μL de solução de estoque CaCl₂ de 100 mM para 30 mL de CIB (concentração final de Ca²⁺ é de 0,3 mM), misture e mantenha-a no gelo. Em camundongos <4 semanas de idade, reduza a trippsina e protease para 0,9 mg¹⁰. Aqueça a 37 °C em um banho de água antes de usar.
   3. Prepare a solução CIB-Ca²⁺-BSA. Adicione 30 mg BSA e 90 μL de 100 mM CaCl₂ solução de estoque a 15 mL de CIB (concentração final de Ca²⁺ é de 1,2 mM), misture, filtre através de um filtro de 20-μm e mantenha-o no gelo.
   4. Prepare a solução CIB-EGTA. Depois de fazer as soluções descritas nas etapas 1.2.2 e 1.2.3, adicione 400 mM de solução de estoque EGTA ao CIB restante em uma diluição de 1:1000 (a concentração final do EGTA é de 0,4 mM), e misture. Encha o prato de cultura de 35 mm e o prato de suporte do coração com CIB-EGTA e mantenha-os no gelo.
      1. Despeje aproximadamente 20 mL de CIB-EGTA em um copo de vidro de 30 mL e suporte uma pipeta de transferência de plástico no béquer, mantendo-a no gelo.
   5. Prepare a solução de Tyrode. Adicione 100 mL de Tyrode de 10X a 800 mL de DW e aqueça-o usando um micro-ondas a cerca de 32 °C. Depois de adicionar 0,99 g de glicose e 1,8 mL de 1 M CaCl_2,ajuste o pH usando 1 M NaOH e leve para 1000 mL com DW.
   6. Prepare a solução de resuspensão celular. Adicione 30 mg de BSA e 300 μL de antibióticos de 50X a 15 mL de solução Tyrode.
   7. Prepare seringas. Encha a seringa de 20 mL conectada com o tubo de extensão flexível e a agulha de injeção marcada com CIB-EGTA. Encha a seringa de 30 mL com a mistura de enzimas aquecidas. Segure ambos a 37 °C até pouco antes de usar.
   8. Prepare a placa de perfusão. Pré-aqueça o tapete do aquecedor sob um microscópio estereoscópico. Coloque a placa de perfusão (tampa de uma placa de cultura multi-bem) no tapete de aquecedor pré-encolhido. Pré-aquecimento do grampo vascular colocando-o na placa de perfusão até usar. Coloque o prato de cultura de 60 mm para pipetar e o coador de células no tapete de aquecedor pré-encolhido também.

2. Perfusão antegrada do coração do rato

NOTA: A pipeta de transferência de plástico usada para sugar o coração deve ser macia e não ser acentuadamente afilada em direção à ponta. Escolha um pequeno grampo vascular com serragem. Os instrumentos recomendados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Excisão do coração do rato e fixação da aorta
   NOTA: Os camundongos adultos (>8 semanas) devem ser eutanizados por uma overdose de pentobarbital de sódio (>300 mg/kg, injeção intraperitoneal [i.p.] com heparina (8000 unidade/kg).
   1. Extirpar o coração do rato rapidamente sugando.
      1. Abra a cavidade torácica rapidamente para expor o coração. Corte a pipeta de transferência de plástico, a ponta da qual é aproximadamente do mesmo tamanho que, ou ligeiramente menor do que, o coração exposto (geralmente em um local aproximadamente 1 cm da marca de 0,5 mL em direção à ponta, mas depende do tamanho do coração).
      2. Chupe o coração na pipeta, levante a pipeta para criar espaço suficiente para inserir a tesoura e extirpar o coração com uma tesoura curva do lado dorsal, evitando danificar o atria.
      3. Transfira imediatamente o coração excisado para o béquer de vidro de 30 mL contendo CIB-EGTA refrigerado ao gelo para parar a contração. Este procedimento geralmente leva < 1 min.
   2. Limpeza ao redor da aorta
      1. Transfira o coração para um prato de cultura de 35 mm cheio de CIB-EGTA refrigerado ao gelo e remova o pulmão e outros tecidos visíveis, e, em seguida, transfira o coração aproximadamente limpo para o suporte cardíaco cheio de CIB-EGTA refrigerado e colocá-lo com o ápice para baixo.
      2. Sob o microscópio estereoscópico, remova a gordura e os tecidos conjuntivos para limpar ao redor da aorta. Se o comprimento da aorta cortada for muito longo, incluindo a artéria braquiocefálica, a artéria carótida comum esquerda ou a artéria subclávia esquerda, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica para encurtá-la para prosseguir para o próximo passo. Este procedimento geralmente leva aproximadamente 4 minutos.
   3. Fixando a aorta e colocando o coração preso na placa de perfusão
      1. Sob o microscópio, coloque o coração no pé do coração. O operador deve enfrentar a superfície anterior do coração, pegar a extremidade da aorta com pinças, e fixar a aorta perto da árta com um pequeno grampo vascular enquanto empurra suavemente para baixo na aorta um pouco.
      2. Coloque o coração preso na placa de perfusão com o lado anterior para cima e cubra-o com algumas gotas de CIB-EGTA para evitar que ele seque. Este procedimento geralmente leva <20 s.
2. Perfusão antegrada do coração
   NOTA: Primeiro, perfumar o coração com CIB-EGTA para descarregar o sangue e evitar a coagulação.
   1. Insira a agulha de injeção e inicie a perfusão para descarregar o sangue
      1. Coloque a seringa de 20 mL cheia de CIB-EGTA pré-equipado conectado ao tubo de extensão flexível e uma agulha de injeção marcada na bomba de infusão. Inicie a bomba a uma velocidade lenta de 0,5 mL/min para encher cuidadosamente a agulha e o tubo com CIB-EGTA e certifique-se de impedir que qualquer ar entre no tubo.
      2. Coloque a agulha de injeção na placa de perfusão com o lado mais curto da forma diagonal na frente. Deslize a agulha em direção ao ápice do coração até que ele esteja tocando-o, e, em seguida, insira cuidadosamente a agulha perto do ápice do ventrículo esquerdo na câmara ventricular sem torcer. Não retire a agulha da placa durante a realização da inserção.
      3. Observe a marca vermelha para estimar a profundidade da inserção da agulha. Quando a inserção da agulha estiver concluída, o sangue que flui da artéria coronária deve começar a ser liberado.
      4. Fixar a agulha de injeção na placa com fita adesiva e aumentar a velocidade da bomba para 1 mL/min. Este procedimento geralmente leva aproximadamente 30 s. Se o coração for perfundido com sucesso, o fluxo do CIB-EGTA no capilar logo abaixo do epicárdio pode ser visto sob o microscópio.
   2. Perfusão do coração com mistura de enzimas
      NOTA: Durante a perfusão enzimática, a profundidade da agulha inserida pode ser monitorada verificando a marca vermelha na agulha.
      1. Depois de perfumar 2-3 mL de CIB-EGTA para descarregar completamente o sangue da artéria coronária, mude o perfusado para mistura enzimática. Evite permitir que bolhas de ar entrem no tubo. Verifique o fluxo da mistura de enzimas e certifique-se de que a agulha de injeção não saiu verificando a posição da marca vermelha.
      2. Após 1-2 mL ter sido perfundido, aumente a velocidade da bomba para 1,5 mL/min. Remova o perfusato acumulado contendo sangue que fluiu para fora do coração com uma pipeta de tempos em tempos.
         NOTA: Com o tempo, a parede do miocárdio se tornará translúcida em alguns lugares e aparecerá manchada, o que é um sinal de digestão da matriz extracelular após a perfusão bem sucedida. Outro sinal é o reinício da batida atrial causada pela presença de Ca²⁺ na mistura de enzimas.
      3. Pare a perfusão quando o volume total da mistura de enzimas perfusada for de 10 mL.

3. Isolamento de células cardíacas individuais

1. Dissociando células cardíacas
   1. Após a perfusão com o mix de enzimas, transfira 10 mL da mistura enzimática restante na seringa para um prato de cultura de 60 mm colocado no tapete de aquecimento e adicione 20 mg de BSA (0,2% BSA no mix de enzimas). O pó BSA caído deve dissolver-se imediatamente girando suavemente com uma mão. Remova a agulha de injeção e o grampo vascular do coração.
   2. Separe os ventrículos e atria e transfira cada um para a enzima mistura suplementada com 0,2% de BSA no tapete de aquecimento.
2. Isolamento de miócitos ventriculares
   1. Pegue o epicardium com duas pinças, e rasgue suavemente e puxe os ventrículos de um lado para o outro na mistura enzimática complementada com 0,2% de BSA em pequenos pedaços. Disperse as células com tubulação suave (aproximadamente 30 vezes).
   2. Filtre os detritos não digeridos através de um coador de células de malha de 100 μm e transfira o filtrado para um tubo de centrífuga de 15 mL para centrifugação a 50 × g por 3 min. Resuspend os cardiomiócitos pelleted em solução CIB-Ca²⁺-BSA pré-equipado, incubar-o por 5 min a 37 °C, e depois centrifuá-lo a 14 × g por 3 min.
   3. Resuspende os cardiomiócitos precipitados finais na solução de resuspensão celular (a composição está listada na Tabela 2) e mantenha-a a 37 °C.
3. Isolamento de miócitos atrial
   1. Durante a centrifugação final para a fração ventricular do miócito na etapa 3.2, comece a isolar os miócitos atrial. Transfira o atria, armazenado como na etapa 3.1, para a solução CIB-Ca²⁺-BSA pré-enlasada, rasgue-a em pedaços e dissocia as células por pipetação com ponta de pipeta a 10 μL no tapete de aquecimento.
   2. Centrifugar a mistura celular a 14 × g por 3 min e resuspensar as células atrial pelleted com solução de resuspensão celular.
4. Isolamento e cultura de fibroblastos cardíacos
   1. Transfira o supernatante da primeira centrifugação na etapa 3.2 para outro tubo de centrífuga de 15 mL, e centrífuga a 190 × g por 5 min. Lave as células precipitadas duas vezes com centrifugação no DMEM (Modified Eagle Medium, meio de águia modificada) de Dulbecco e, em seguida, suspenda as células com DMEM suplementada com albumina bovina fetal de 10% (FBS) e antibióticos.
   2. Plaque a fração de célula final em um frasco de cultura (25 cm²) e permita que as células aderam ao fundo do frasco em uma atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO₂. Após 90 min de incubação, descarte as células nãoectadas e adicione meio de cultura fresco. As células devem ficar perto da confluência após aproximadamente 4 dias, momento em que devem ser amplificadas pela experimentação e semeadas em novos pratos culturais.

4. Colheita de proteínas de atria e ventrículos

1. Após a perfusão, separe a átrida e os ventrículos, e homogeneize-os em tampão de lise a uma razão de 10 mg de peso tecidual a 100 μL de tampão usando um moedor pequeno em um tubo de amostra de 1,5 mL.
2. Mantenha o homogeneado no gelo por 40 minutos com vórtice misturando a cada 10 minutos para extrair proteínas, e depois centrifugar o tubo a 15000 × g por 20 min a 4 °C. Armazene a fração supernasal a -80 °C como uma amostra de proteína.

5. Imunostaining de células cardíacas isoladas

NOTA: É necessária a imobilização de cardiomiócitos não aderentes na parte inferior da placa de imagem celular usando cola biológica.

1. Adesão de cardiomiócitos isolados a um prato de cultura de fundo de vidro
   1. Antes de iniciar o isolamento celular, cubra o prato de cultura de fundo de vidro com cola biológica (por exemplo, Cell-Tak) de acordo com a instrução do fabricante, enxágue com DW e ar seco à temperatura ambiente.
   2. Após a ressuspensão dos cardiomiócitos isolados na solução CIB-Ca²⁺-BSA, solte a suspensão celular na parte inferior dos pratos revestidos de cola e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente sem agitação.
2. Imunostaining
   1. Aplaque os cardiomiócitos isolados em um prato de fundo de vidro pré-revestido com cola biológica e mantenha-o em temperatura ambiente por 40 minutos para permitir que as células aderam ao prato. Fibroblastos cardíacos de cultura em pratos de cultura de vidro inferior.
   2. Enxágüe as células com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) e fixe-as com 4% de paraformaldeído (PFA) por 5 minutos com agitação. Lave as células fixas com PBS por 10 minutos três vezes, e incuba-as em solução de bloqueio-permeabilização por 60 minutos à temperatura ambiente com agitação.
   3. Células da sonda com anticorpo primário diluído em solução de bloqueio-permeabilização por 60 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave as células com PBS por 10 minutos três vezes, e incubar em seguida com anticorpo secundário rotulado de fluorescência por 60 minutos à temperatura ambiente.
   4. Depois de lavá-los três vezes com PBS por 10 minutos, colorir os núcleos com DAPI (diluição de 1:10000 em PBS). Analise os sinais fluorescentes usando um microscópio de varredura a laser confocal.

6. Gravações de grampo de remendo de células inteiras

1. Fabricar os eletrodos de remendo de um capilar de vidro usando um puxador de microeletrodos horizontais. A resistência do eletrodo variou de 2 a 4 MΩ quando preenchida com uma solução de pipeta k⁺rica(Tabela 2). Transfira uma alíquota de cardiomiócitos isolados para uma câmara de gravação montada no palco de um microscópio invertido superfundido com Tyrode a uma taxa de 1 mL/min a 36-37 °C.
2. Regisso potencial de ação usando o método perfurado de patch-clamp com solução de pipeta k⁺rica contendo 30 mg/mL de anfotericina B, aplicando pulsos atuais de 5-10 ms de duração a uma taxa de 1 Hz através do eletrodo de remendo.

7. Análises de manchas ocidentais

1. Neste estudo, realize uma análise ocidental de proteínas de peso molecular de pequeno porte, como o peptídeo natriurético atrial marcador atrial (ANP).
2. Dissolva a amostra de proteína na concentração final de 1X Tampão de amostra, 2% 2' mercaptoetanol, e desnaturar as proteínas por 60 min a 37 °C. Carregue 20 μg de proteína em cada poço, e realize eletroforese em tampão de corrida com 20 mA por gel por 120 min.
3. Transfira a proteína para uma membrana PVDF em tampão de transferência a 10 V por 40 min. Lave a membrana transferida duas vezes com TBST por 5 min, depois bloqueie com 5 % de leite desnatado em TBST por 60 minutos à temperatura ambiente, e teste com o anticorpo primário dissolvido em TBST durante a noite a 4 °C.
4. Lave a membrana 5 vezes com TBST por 7 minutos, e incuba-a com o anticorpo secundário diluído em TBST por 120 min a temperatura ambiente.
5. Depois de lavar a membrana 5 vezes com TBST por 7 minutos, visualize os sinais com um ensaio de quimi-luminescência e analise-os com um analisador de imagem lumino.

Resultados

O princípio deste método é simples: o perfusato flui da câmara esquerda, a válvula aórtica é aberta, e o perfusato corre para a artéria coronária na mesma direção que a corrida sanguínea, uma vez que a aorta é fechada por fixação, o que permite a perfusão profunda do miocárdio a fim de digerir a matriz extracelular.

Miócitos ventriculares recém-isolados com o método atual são mostrados na Figura 1A. A Figura 1B mostra imagens ampliadas dos miócitos ventriculares e atrial. Este procedimento de isolamento resultou em um alto rendimento (70%-80%) de miócitos ventriculares quiescentes em forma de vara de camundongos adultos (8-10 semanas), que estavam disponíveis dentro de cerca de 5 h após o isolamento(Figura 1C),um intervalo semelhante ao do uso do procedimento tradicional baseado em Langendorff⁷. No entanto, a proporção de células viáveis recém-isoladas foi menor em camundongos idosos de >2 anos de idade(Figura 1C). O número total de miócitos ventriculares obtidos por coração adulto usando este protocolo foi de aproximadamente 3 x 10⁶ células, o que foi semelhante ao valor relatado anteriormente^7,12. Os potenciais de ação registrados nos miócitos ventriculares e atrial(Figura 1D) foram semelhantes aos das células obtidas pelo método¹⁰baseado em Langendorff . Uma análise imunossuada confirmou que a estrutura sarcomerica dos miócitos ventriculares estava bem organizada com uma membrana celular claramente visível(Figura 2A). Os cardiomiócitos individuais isolados com este método podem ser usados diretamente em experimentos, como uma análise eletrofisiológica¹⁰ ou um experimento de imunossuagem.

Fibroblastos cardíacos existem em espaços intersticiais. A digestão suficiente da matriz extracelular resulta no isolamento dessas células. Os fibroblastos cardíacos isolados proliferam em condições culturais e podem ser passagemdos várias vezes ou armazenados em nitrogênio líquido em uma solução de reservatório celular apropriada. A Figura 2B mostra que a maioria dos fibroblastos cardíacos cultivados se transformou em miofibroblasts durante a subcultura, como confirmado pelo aumento da expressão de α-suave actin^{muscular 13,14}. Além disso, os progenitores cardíacos podem ser isolados com o método atual e cultivados em meio de cultura adequado, que começam a bater automaticamente^10,15.

A homogeneização do miocárdio robusto não é fácil, especialmente para tecido cardíaco de camundongos envelhecidos, que possui uma grande quantidade de fibras extracelulares. Após a perfusão antegrada, a proteína dos atria e ventrículos pode ser facilmente homogeneizada no tampão de lise com força leve para extrair proteínas. Uma análise de manchas ocidentais demonstrou a expressão específica da ANP em atria, mas não em ventrículos de camundongos adultos (20 semanas) e envelhecidos (108 semanas)(Figura 3).

Figura 1. Cardiomiócitos isolados de camundongos. A. Miócitos ventriculares recém-isolados com a perfusão antegrada, com imagens adquiridas com baixa ampliação. Após a lavagem final, os cardiomiócitos foram resuspended com 2 mL de solução de resuspensão celular, dos quais 100 μL foram jogados no prato de cultura de fundo de vidro e assentamento celular aguardado. Barra, 100 μm.B. Imagens ampliadas de miócitos ventriculares isolados (superior) e miócitos atrial (inferior). Barra, 100 μm.C. Células isoladas foram suspensas na solução de resuspensão celular e armazenadas a 37°C pelo período desejado, e o número de miócitos ventriculares vivos foi contado em 10-15 campos sob um microscópio. As células arredondadas foram consideradas irreversivelmente feridas ou mortas¹⁶. Símbolos verdes, azuis e vermelhos foram obtidos de 3 ratos com 8-10 semanas de idade, e símbolos pretos eram de um rato de 106 semanas de idade. O símbolo amarelo indica a média de cada grupo. D. Potenciais de ação representativos registrados a partir de miócitos ventriculares (preto) e atrial (vermelho) de 8-10 ratos. Os dados foram obtidos das células aproximadamente 3h após o isolamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imunostaining para α-actinina em miócitos ventriculares de camundongos isolados e actina muscular α-suave em fibroblastos cardíacos de camundongos cultivados. A. Microscopia de varredura a laser confocal de imunostaining para α-actinin (verde), coloração DAPI para núcleos (azul) e uma imagem DIC de miócitos ventriculares isolados do coração do rato com perfusão antegrada. Barra, 50 μm.B. Imunostaining para actina muscular α-lisa (verde), mancha de DAPI para núcleos (azul) e uma imagem DIC de fibroblastos cardíacos isolados do coração do rato com perfusão antegrada. Os fibroblastos cardíacos foram cultivados por quatro dias. Barra, 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Análises de manchas ocidentais da ANP em atria e ventrículos. Análises de manchas ocidentais para o peptídeo natriurético atrial atrial (ANP) em atria (A) e ventrículos (V) preparados a partir de corações adultos (20 semanas) e envelhecidos (108 semanas). A ANP está presente no atria, mas ausente nos ventrículos. Use glicealdeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como uma proteína de manutenção doméstica de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Soluções de estoque para isolar células cardíacas
10X CIB (500 mL)
NaCl	37,99 g
Kci	2,01 g
1 M MgCl2	2,5 mL
NaH2PO4	0,23 g
HEPES	29,79 g
Dw	Encha até 500 mL
100 mM CaCl2 estoque soution
CaCl2	100 mM
Solução de estoque de 400 mM EGTA
EGTA	400 mM
Solução de insulina
insulina	1 unidade/mL em 0,1 M HCL
Solução de estoque de antibióticos 50X (20 mL)
penicilina	100 mgs
estreptomicina	100 mgs
Vermelho-fenol	1,5 g
Dw	20 mL e esterilizar com filtragem
Solução Tyrode 10X (1000 mL)
NaCl	81,82 g
Kcl	4,03 g
1 M MgCl2	5 mL
NaH2PO4	0,47 g
HEPES	11,92 g
Naoh	0,8 g
Dw	Encha até 1000 mL
Solutina de estoque para imunostaining
Ações da DAPI
DAPI	2 mg/mL em metanol
Soluções de estoque para manchas ocidentais
Tampão HEPES (100 mL)
NaCl	0,88 g
400 mM EGTA	0,25 mL
HEPES	0,24 g
1M Naoh	ajustar pH para 7.4
Dw	Encha até 500 mL
Coquetel de inibidores de protease
Mini completo	1 comprimido
Dw	0,4 mL

Mesa 1. Descrição das soluções de ações. Mantenha as soluções de estoque a 4 °C. Inibidores de aliquot protease coquetel para armazenamento a -20 °C.

Soluções para isoltaing células cardíacas
CIB (200 mL)
10X CIB	20 mL
Solução de insulina	0,01 mL
glicose	0,79 g
1M Naoh	ajuste de pH para 7,4
Dw	Encha até 200 mL
Solução de mistura de enzimas (30 mL)
Colagenase tipo2	30 mgs
tripsina	1,8 mg
protease	1,8 mg
Solução de estoque cacl2 de 100 mM	0,09 mL
Cib	30 mL
CIB-Ca2+-BSA (15 mL)
Bsa	30 mgs
Solução de estoque cacl2 de 100 mM	0,18 mL
Cib	15 mL
CIB-EGTA (150 mL)
Solução de estoque de 400 mM EGTA	0,150 mL
Cib	150 mL
Solução de tyrode (1000 mL)
Solução de estoque 10X Tyrode	100 mL
glicose	0,99 g
1M CaCl2	1,8 mL
1M Naoh	ajuste de pH para 7,4
Dw	Encha até 1000 mL
Solução de resuspensão celular (15 mL)
Bsa	30 mgs
Solução de estoque de antibióticos 50X	0,3 mL
Solução de tyrode	15 mL
Soluções para imunossuagem
Solução aderente de células (0,3 mL)
Tak celular	0,01 mL
0.1 M NaHCO3 (pH8.0)	0,285 mL
0.1 M Naoh	0,005 mL
Solução de bloqueio-permeabilizatina (10 mL)
Soro bovino fetal	1 mL
Tritão X-100	1 mL
PBS 10X	1 mL
Dw	7 mL
K+ solução de pipeta rica
Aspartato de potássio	70 mM
Kcl	50 mM
KH2PO4	10 mM
MgSO4	1 mM
Sal de disódio ATP	3 mM
Sal de lítio GTP	0,1 mM
EGTA	5 mM
HEPES	5 mM
Koh	ajuste de pH para 7,2
Soluções para manchas ocidentais
Tampão de lise (1 mL)
Tampão HEPES	0,86 mL
Nonidet-P40	0,1 mL
Coquetel de inibidores de protease	0,04 mL
Tampão de runnning (1000 mL)
10X TG (0,25 M Tris e 1,92 M Glycine)	100 mL
Sds	1 g
Dw	900 mL
Buffer de transferência (1000 mL)
10x TG	100 mL
metanol	200 mL
Dw	700 mL
Tampão de manchas (TBST) (1000 mL)
5M NaCl	20 mL
2M Tris-HCl (pH 7.5)	5 mL
10% Tween 20	10 mL
Dw	965 mL

Mesa 2. Descrição das soluções de trabalho para isolar células cardíacas, imunostaining e mancha ocidental. Prepare todas as soluções de trabalho pouco antes dos experimentos.

Figura suplementar 1. Esboço do isolamento celular. Diagrama de fluxo do isolamento de miócitos ventriculares e atrial e fibroblastos cardíacos de um único coração. Clique aqui para baixar este número.

Discussão

Uma vez que o coração é altamente suscetível à isquemia, o tempo necessário para extirbir o coração e imergi-lo no CIB-EGTA gelado para parar a contração deve ser mantido aquém possível (<1 min). Este é o primeiro passo crítico deste método. O segundo passo crítico diz respeito à direção do coração. A orientação particular do coração excisado na etapa 2.1.2 torna mais fácil ver e remover a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da aorta. Após a limpeza ao redor da aorta, coloque o coração preso com o lado da superfície anterior sobre a placa de perfusão. O passo crítico final envolve a inserção da agulha de injeção. Ao avançar a agulha em direção ao coração, a agulha de injeção não deve ser separada da placa de perfusão, a fim de manter uma distância constante da placa. A posição da inserção está próxima ao ápice do ventrículo esquerdo. Insira a agulha cuidadosamente sem torcer, pois tal torção pode aumentar o orifício. A profundidade da inserção da agulha pode ser estimada observando a marca vermelha. Se a agulha for inserida muito profunda, a ponta pode perfurar através do septo ventricular e entrar no ventrículo direito ou embora a válvula mitral e entrar no átrio esquerdo. Depois de confirmar o desaparecimento do sangue da artéria coronária, a agulha deve ser fixada com fita adesiva na placa de perfusão.

Um comprimento maior da aorta dificulta a fixação da aorta na posição certa. Se o grampo estiver muito distante da ária, o coração pode girar após a infusão perfusada. Para evitar isso, corte a aorta logo abaixo da artéria braquiocefálica para encurtar a aorta antes de fixar.

Se o sangue não começar a descarregar após a perfusão a uma velocidade inicial de 0,5 mL/min, aumente a velocidade para 1 mL/min. Se isso não ajudar, a agulha de injeção pode ser posicionada incorretamente, como no ventrículo direito, septo ventricular ou parede do miocárdio esquerdo. Nesse caso, remova a agulha imediatamente e tente reinseri-la perto do ápice do ventrículo esquerdo. Ao inserir a agulha várias vezes, as células digeridas podem fluir dos orifícios abertos. Note que isso geralmente não afeta seriamente o isolamento celular.

Os operadores podem monitorar todo o processo de perfusão antegrada do coração usando um microscópio estereoscópico para observar as mudanças de cor e transparência e reiniciar a batida da ária junto com a digestão. Um total de 10 mL de mistura de enzimas deve ser o máximo necessário, mesmo para um coração velho. Em corações mais jovens (5-7 semanas de idade), reduzimos o volume para 9 mL, o que é semelhante à abordagem via perfusão retrógrada com a mesma mistura enzimática.

O supernatante na centrifugação final contém detritos, células sanguíneas e não miócitos, enquanto que a pelota contém principalmente cardiomiócitos e contaminando não-miócitos, como fibroblastos e células endoteliais. Para purificar os cardiomiócitos, mais passos são necessários. Em geral, a pelota deve ser resuspended no meio de cultura celular apropriada e pré-platado por 2h a 37°C em um prato de cultura de células teciduais, e, em seguida, remover suavemente os cardiomiócitos por pipetação e pré-chapa para cultura.

A mistura de enzimas contém uma baixa concentração de Ca²⁺ (0,3 mM). Incubamos, portanto, células digeridas em CIB-Ca²⁺-BSA (1,2 mM Ca²⁺) antes da ressuspensão final com a solução de resuspensão celular (1,8 mM Ca²⁺), e o aumento gradual do Ca²⁺ evita causar danos celulares⁷. Enquanto os cardiomiócitos isolados estiverem intactos (células quiescentes sem contração) este procedimento de adaptação ca²⁺não afeta a viabilidade celular em camundongos. Como as células danificadas estão morrendo durante esta incubação, consequentemente obtemos um grupo celular saudável. Da mesma forma, miócitos atrial intactos isolados (células quiescentes sem contração irregular) podem ser armazenados na mesma solução de resuspensão celular. No entanto, os miócitos atrial tendem a ser mais delicados a serem armazenados em comparação com os miócitos ventriculares.

Em laboratório, este método de isolamento é quase sempre bem sucedido a menos que a inserção da agulha no ventrículo esquerdo falhe. Também conseguimos isolar células do coração hipertrófico preparado pela constrição aórtica transversal cirúrgica. No entanto, em camundongos envelhecidos, que muitas vezes têm pequenos infartos do miocárdio, a perfusão cessa em alguns lugares, resultando em digestão incompleta e, portanto, um baixo rendimento(Figura 1C),semelhante ao método retrógrado baseado em Langendorff. Nesses casos, a forma distorcida do coração pode ser observada mesmo no início da perfusão.

Este método de perfusão antegrada é útil para isolar células cardíacas de camundongos de várias idades, mas não animais maiores, como coelhos e cobaias. Pode ser possível aplicar este método a ratos neonatais ou juvenis antes do desmamar.

Uma das vantagens deste método de perfusão antegrada é que ele diminui os obstáculos técnicos associados ao uso do método de perfusão retrógrada baseado em Langendorff para pequenos corações de camundongos. O tempo necessário para a perfusão é de aproximadamente 7 minutos com 10 mL das enzimas, este curto período de digestão aumenta a viabilidade das células. Além disso, permite que a perfusão seja realizada através da circulação coronária do coração, mesmo após a digestão das válvulas aórticas. O isolamento dos miócitos atrial geralmente requer perfusão retrógrada baseada em Langendorff e incubação adicional com enzimas¹⁷. Esta abordagem de perfusão antegrada, no entanto, pode perfusar profundamente o tecido com a enzima para isolar miócitos atrial.

Em experimentos usando vários camundongos, o aparelho Langendorff deve ser limpo antes de perfumar o próximo coração. No entanto, no método antegrade atual, desde que o número desejado de conjuntos de instrumentos (por exemplo, agulhas de seringa e placas de perfusão) sejam preparados com antecedência, a perfusão pode ser realizada continuamente.

Nós aqui relatamos a metodologia básica da perfusão antegrada do coração do rato usando as mesmas soluções que o método de perfusão retrógrada baseado em Langendorff sem produtos químicos adicionais. A composição do perfusato pode ser alterada para se adequar ao propósito do experimento, como o uso de um detergente contendo EGTA em vez das enzimas para fazer um coração descelularizado¹⁸.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Wako Pure Chemical Industries, Japan
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody	Molecular Probes, USA	A11001	Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-α-actinin (ACTN)	Sigma-Aldrich, USA	A7811	Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)	Merck-Millipore, USA	AB5490-I	Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	Cell Signaling Technology, USA	2118	Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)
Anti-smooth muscle actin (SMA)	Dako, Denmark	M0851	Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)
Anti-rabbit IgG antibody	Amersham, GE Healthcare, USA	NA934	Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)
ATP disodium salt	Sigma-Aldrich, USA	A26209
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A9418
Cell-Tak	Corning	354240	Biological material for adhesion of the cell or tissues
Chemi-Lumi One Super	Nacalai Tesque, Japan	02230-14	Chemiluminescent reagent used for western blotting.
Collagenase Type 2	Worthington Biochemicals, USA	LS004176	Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.
Complete Mini	Roche, Germany	11836153001	A mixture of several protease inhibitors.
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Nacalai Tesque, Japan	11034-56	Used for cell-impermeant nuclear stainig
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Nacalai Tesque, Japan	08458-45	including 4.5 g/L gluose
Extension tube	Top, Japan	X1-50	Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.
EPC-8 patch-clamp amplifier	HEKA, Germany
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, USA	F7524-500ML
Glass capillaries	Narishige Scientific Instrument Lab., Japan		outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm
GTP lithium salt	Sigma-Aldrich, USA	G5884
Horizontal microelectrode puller	Germany)	P-97
Heater mat	Natsume Seisakusho, Japan	KN-475-3-40	Equipment to warm the perfusion plate.
Infusion pump	TERUMO, Japan	TE-311	Infusion syringe pump for antegrade perfusion.
Injeciton needle (27 gauge)	TERUMO, Japan	NN-2719S	Needle for insertion into the left ventricle.
Insulin (from bovine pancrease)	Sigma-Aldrich, USA	I5500	Dissolve in 0.1 M HCl.
Mini cordless grinder	Funakoshi, Japan	cG-4A	Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)	Nacalai Tesque, Japan	09154-85
Penicillin G potassium	Nacalai Tesque, Japan	26239-84
Phenol Red	Nacalai Tesque, Japan	26807-21
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)	Nacalai Tesque, Japan	27575-31
Plastic multi-well culture plate	Falcon, USA	353226	Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.
Plastic syringe (20 mL)	TERUMO, Japan	SS-20ES	Use for infusion of CIB-EGTA.
Plastic syringe (30 mL)	TERUMO, Japan	SS-30ES	Use for infusion of Enzyme-mix
Plastic transfer pipette	Sarstedt, Germany	86.1171	Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck-Millipore, USA	IPVH00010	Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)
Protease	Sigma-Aldrich, USA	P5147	A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.
4X Sample buffer solution	Fuji Film, Japan	198-13282	Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB
SDS polyacrylamide gel  (15%)	Fuji Film, Japan	193-14991
Streptomycin sulfate	Nacalai Tesque, Japan	32237-14
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)	Nacalai Tesque, Japan	09422-81	Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)
Trypsin	Sigma-Aldrich, USA	T8003	Trypsin from bovine Type 1.
Vascular clamp	Karl Hammacher GmbH, Germany	HSE 004-35	Small straight vascular clamp used for clamping aorta.
All other reagents	Nacalai Tesque, Japan