Isolando e Imagens Ao Vivo, Regiões de Marcapasso Intacta da Pelve Renal do Rato por Vibratome Sectioning

Resumo

O objetivo deste protocolo é isolar regiões de marca-passo intactas da pelve renal do rato usando seção de vibratome. Essas seções podem então ser usadas para imagens in situ Ca²⁺ para elucidar propriedades transitórias ca²⁺ de células marcapassos e outras células intersticiais em fatias de vibratome.

Resumo

A pelve renal (RP) é uma estrutura muscular lisa em forma de funil que facilita o transporte normal de urina do rim para o ureter por contrações regulares e propulsivas. As contrações regulares de RP dependem da atividade do marca-passo, que se origina da região mais proximal do RP na junção pélvis-renal (PKJ). Devido à dificuldade de acesso e preservação de preparações intactas do PKJ, a maioria das investigações sobre o pacemaking de RP se concentrou em eletrofisiologia unicelular e experimentos de imagem Ca^2+. Embora revelações importantes sobre o pacemaking RP tenham emergido de tal trabalho, esses experimentos têm várias limitações intrínsecas, incluindo a incapacidade de determinar com precisão a identidade celular em suspensões mistas e a falta de imagens in situ da atividade do marca-passo RP. Esses fatores resultaram em uma compreensão limitada dos mecanismos que estão por trás das contrações normais de RP rítmico. Neste artigo, um protocolo é descrito para preparar segmentos intactos do PKJ do mouse usando uma técnica de secção de vibratome. Combinando essa abordagem com camundongos expressando repórteres específicos de células e indicadores ca²⁺ geneticamente codificados, os pesquisadores podem ser capazes de estudar com mais precisão os tipos e mecanismos específicos de células responsáveis pelas contrações peristálticas de RP que são vitais para o transporte normal de urina.

Introdução

A pelve renal (RP) é uma estrutura muscular lisa em forma de funil que transporta urina do rim para o ureter. O RP transporta urina gerando contrações rítmica regulares (peristalse)^1,2,3,4,5, que impulsiona um bolus de urina do rim distally para o ureter e, finalmente, para a bexiga, onde é armazenado até que ocorra a micturição^6,7. A perda dessa atividade regular tem consequências terríveis, incluindo hidronefrose e insuficiência renal^1,3,8; portanto, há uma necessidade crítica de estudar os mecanismos subjacentes às contrações regulares e rítmicas de RP. As contrações peristálticas originam-se da região mais proximal da junção pélvis-renal (PKJ)^{9,10,11,12,13,14,15} (Figura 1A-C) e propagam distalmente para empurrar urina da papila para o RP ( Figura1B). A atividade do marca-passo elétrico é registrada no PKJ como despolarizações transitórias espontâneas^{10,11,12,13,15,16,17}, que são consideradas decorrentes de células-passo especializadas. Acredita-se que essas células marca-passo, antes chamadas de células musculares lisas atípicas (ASMCs), gerem ou coordenem a atividade do marca-passo e conduzam as contrações de células musculares lisas "típicas" (SMCs)^{9,10,11,18,19,20,21,22,23}.

Os ASMCs são mais abundantes no RP proximal, no PKJ (Figura 1A-C),onde contrações peristálticas e atividade de marca-passo elétrico originam-se^{5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22}. Um estudo publicado recentemente por este grupo identificou o receptor-alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα), em combinação com a cadeia pesada de miosina muscular lisa (smMHC), como um biomarcador único para essas células intersticiciais (ICs)²⁴, um achado que foi corroborado por outros grupos²⁵. Com base em seu padrão de morfologia e expressão proteica, essas células foram chamadas PDGFRα⁺ IC tipo 1 (PIC1)^24,26. Pic1s residem na camada muscular do PKJ onde exibem transitórios ca²⁺ de alta frequência, de curta duração, pensados para fundamentar a geração de potenciais marca-passo²⁴. No entanto, existem outros tipos de células no PKJ, incluindo PDGFRα⁺ ICs (PIC2s) expressos não smMHC na camada adventienta. Relatórios anteriores sugerem que as ICs não-smMHC podem participar da regulamentação da atividade de marca-passo¹⁹. No entanto, um estudo mais aprofundado das ICs não-smHC é dificultado pela baixa distinção durante os estudos de imagem ca^2+. Normalmente, os tipos de células heterogêneas dentro das preparações de RP são indiscriminadamente carregados com corantes sensíveis ao Ca²⁺(por exemplo, Fluo-4). Para superar esses desafios e estudar uma variedade de tipos de células no RP, indicadores ca²⁺ codificados geneticamente podem ser utilizados para expressar seletivamente fluoroforos sensíveis ca^{2 em}tipos de interesse celular.

A maioria dos estudos que elucidam propriedades transitórias Ca²⁺ em PIC1s/ASMCs foram realizados por meio de preparações de tecido RP de folhas planas de imagem^19,21,27. Como pic1s são o único tipo de célula no PKJ para expressar smMHC, a expressão condicional do GECI, GCaMP, em células smMHC⁺ é apropriada para estudar PIC1s nesta configuração. No entanto, como PIC1s e PIC2s expressam PDGFRα, a expressão condicional das variantes GCaMP em células PDGFRα⁺ proíbe a distinção celular em preparações de folhas planas. Para contornar essa questão, uma abordagem de seção de vibratome foi usada para distinguir PIC1s e PIC2s através da parede de tecido PKJ²⁴. Para revelar essas populações celulares discretas, o RP foi seccionado coronally, possibilitando identificar PIC2s na adventitia e PIC1s na parede muscular com base na rotulagem imunohistoquímica conhecida e padrões de expressão GECI. Como resultado desta nova abordagem de imagem PKJ, pic1s e PIC2s foram encontrados para exibir distintas propriedades de sinalização Ca^{2+ 24}. Além disso, ao isolar as seções mais proximais da região do PKJ (Figura 2),a região do marca-passo do RP foi preservada de forma que não havia sido realizada anteriormente. Aqui, um protocolo é descrito para mostrar como isolar as preparações de PKJ do rim do rato usando seção de vibratome, como configurar essas preparações para experimentos de imagem Ca²⁺ e como distinguir os diferentes tipos de células através da parede PKJ.

Protocolo

Todos os camundongos utilizados e os protocolos descritos neste estudo foram de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e o Comitê Institucional de Uso e Cuidado animal da Universidade de Nevada, Reno, NV. Experimentos e uso de animais também se conformavam com os princípios e regulamentos descritos por Grundy²⁸.

1. Gerar ratos PDGFRα-GCaMP6f e SMCGCaMP3

1. Ratos cross GCaMP6f^lox/+ (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze}/J) com ratos PDGFRα^Cre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) para gerar ratos PDGFRα-GCaMP6f.
2. Camundongos Cross GCaMP3^lox/+ (B6.129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J) com ratos smHC^CreERT2 masculino (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ER^T2)1Soff/J) para gerar ratos SMC-GCaMP3.
   NOTA: Apenas ratos machos da cruz (ratosGCaMP3^lox/+ e camundongos smMHC^CreERT2) podem ser usados à medida que a expressão Cre é impulsionada do cromossomo Y. os ratos smMHC^CreERT2 também podem ser cruzados com ratos GCaMP6f^lox/+ para melhor relação sinal-ruído Ca²⁺ e propriedades temporais de sinal Ca²⁺ mais rápidas.

2. Prepare e injete camundongos transgênicos com tamoxifeno para induzir expressão condicional de GCaMP

1. Ative a recombinação de Cre indutível para expressão GCaMP específica de células em tipos de células específicas, como descrito anteriormente²⁹.

3.   Preparar soluções

1. Prepare 1 L de solução de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) contendo 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO₃, 1,2 mM Na₂HPO₄, 1,2 mM MgCl₂, 11,5 mM de glicose e 2,5 mM CaCl₂. No dia do uso, mantenha a solução KRB no gelo.
   NOTA: O KRB pode ser armazenado a 4 °C por até uma semana e deve ser pré-bolhado com uma mistura de 97% O₂ e 3% de CO₂ por pelo menos 10 minutos antes de usar.

4. Prepare a dissecção revestida de elastômero de silício e pratos de imagem de microscópio

1. Misture os componentes do elastômero de silício de acordo com as instruções do fabricante. Encha uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm e uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm aproximadamente um quarto cheia de elastômero de silício líquido para experimentos de imagem e dissecção, respectivamente. Polímerize o elastômero de silício a 37 °C durante 1 dia antes do uso.
   NOTA: Para melhorar o contraste das seções finas dos rins, aplique um pequeno círculo de papel preto na base da placa de Petri de imagem antes de encher com elastômero de silício.

5. Dissecção renal

1. Anestesize camundongos por inalação de 3-4% de isoflurano em um capô ventilado. Confirme a indução de anestesia profunda por perda de reflexo de dedo do dedo e/ou pinça da cauda e, em seguida, eutanize os camundongos por deslocamento cervical.
2. Aplique 70% de etanol no peito para amortecer a pele. Utilizando uma tesoura de dissecção externa, abra a cavidade abdominal através de uma incisão longitudinal, com lâminas de tesoura anguladas longe do animal para evitar danos aos órgãos internos.
3. Usando fórceps internos e tesouras internas de dissecção, belisque os intestinos e levante-os para longe da parede abdominal. Enquanto levanta os intestinos, corte a parte inferior do intestino livre do corpo no duodeno proximal e no cólon distal para ter acesso ao espaço retroperitoneal que contém os rins.
4. Uma vez que os rins são expostos, extraia-os individualmente. Belisque suavemente e levante a extremidade distal do ureter (~4mm de distância do rim) com fórceps teciduais. Usando a tesoura de dissecção, corte por baixo do ureter beliscado em direção ao rim. Continue cortando debaixo do rim até que ele se liberte do tecido conjuntivo circundante.
   NOTA: Para maximizar a integridade do tecido e a consistência de corte durante a secção do vibratome, o rim deve estar o mais intacto possível. Para garantir isso, evite beliscar ou cortar o rim com fórceps e tesouras de dissecção.
5. Coloque o rim com ureter anexado na solução KRB gelada. Repita as etapas 5.4 e 5.5 com o rim contralateral. Mantenha os rins na solução KRB no gelo.
   NOTA: Prossiga imediatamente para a próxima seção do protocolo para preservar a viabilidade do tecido PKJ. Devido à sua localização anatômica no interior do parênquimo renal, o PKJ é privado de contato com a solução KRB.

6. Prepare o rim para seção de vibratome

1. Transfira o rim para um prato de dissecção revestido de elastômero de silício (60 mm x 15 mm), e encha-o com solução de KRB gelada até que o rim esteja completamente submerso.
2. Sob um microscópio dissecando, ancorra o rim à base do prato inserindo pinos minutien no ureter proximal e através da fina cápsula renal anterior ou tecido adiposo circundante.
   NOTA: Tome cuidado para não perfurar o tecido de parenchyma renal.
3. Use uma tesoura de mola fina e fórceps internos para remover tecido adiposo da base do rim para expor o RP distal e o ureter proximal.
4. Remova o ureter proximal e uma porção do RP distal da base da RP usando uma tesoura de mola fina.
   NOTA: Tome cuidado para não cortar o parênquim do rim circundante. A linha tracejada preta na Figura 1A indica a posição aproximada deste corte. Este corte cria uma base plana no rim para seção de tecido mais uniforme. Ao dissecar o rim, deve-se estar atento à posição anatômica da região do PKJ. A Figura 1B mostra que o rim intacto pode ser cortado ao longo de um plano sagital para expor a medula, a papila (medula distal onde os dutos coletores convergem) e rp proximal e distal. Se a papila for exposta completamente, como na Figura 1C, o PKJ e o RP proximal (prox RP) podem ser visualizados. No entanto, isso não deve ser feito para a técnica vibratome; esta descrição é orientar o leitor para a localização PKJ em geral, enfatizada na diferença anatômica mostrada nas imagens de luz transmitidas da região PKJ e região mid-RP na Figura 1D,E.
5. Fure a cápsula renal externa com fórceps finos, afastando as pontas do corpo dos rins. Usando fórceps com cada mão, aperte as pontas soltas da cápsula e descasque-as. Continue a descascar a membrana restante da cápsula renal até que ela seja totalmente removida.
   NOTA: A cápsula renal é uma camada dura e fibrosa que envolve o rim. Deve ser removido antes da seção vibratome para um corte ideal.

7. Prepare e calibra o instrumento vibratome

1. Insira uma lâmina de barbear no suporte da lâmina do instrumento vibratome e ajuste o ângulo de desembaraço da lâmina para ~18°.
   NOTA: Como um passo opcional para uma seção de maior qualidade, um bloco de calibração (fornecido com alguns instrumentos de vibratome) deve ser usado para ajustar a posição da lâmina para cada nova lâmina usada de acordo com as instruções do fabricante. Isso garantirá o melhor posicionamento da lâmina e minimizará a vibração vertical.
2. Ajuste a velocidade de avanço da lâmina para 0,2 mm/s, a vibração/sheering horizontal da lâmina para uma amplitude de 2,00 mm, e o tamanho do passo Z da lâmina para ~100-150 μm. Certifique-se de que a espessura da seção renal não exceda 150 μm, pois isso afetará negativamente os experimentos de imagem Ca²⁺ (porque a parede PKJ muitas vezes rolará e dobrará em si mesma se for muito grossa).
   NOTA: O usuário deve ajustar esses parâmetros de corte, pois as configurações variam entre preparações renais individuais e instrumentos vibratome. O ajuste fino deve ocorrer durante a secção quando o usuário pode inspecionar visualmente seções sob um microscópio, conforme descrito na etapa 7.2.
3. Instale um banho de gelo e uma bandeja de tampão no instrumento vibratome. Encha o banho de gelo com gelo esmagado e encha a área interna do palco com solução KRB gelada (encha aproximadamente meio cheio). Durante a seção vibratome, monitore e substitua o gelo esmagado que derreteu.

8. Vibratome seccionando o rim

1. Use fórceps sem corte para agarrar suavemente e remover o rim preparado da solução KRB gelada. Coloque imediatamente o rim em papel absorvente para ~2-4 s para remover o excesso de umidade externa. Role suavemente o rim através do papel absorvente para garantir que todos os lados do parênquim tenham secado para que haja uma ótima adesão do rim ao estágio vibratome.
   NOTA: Como o RP está localizado dentro do rim e, portanto, protegido pelo parenchyma externo, este curto período de secagem não seria prejudicial à integridade do tecido.
2. Aplique imediatamente uma fina camada de cola cianoacrilato (~1 cm²) na base da placa da amostra de vibratome, e use fórceps sem corte para colocar o lado rim, ureter para baixo, na área coberta de cola. Aplique suavemente pressão para baixo na parte superior do rim com a borda plana dos fórceps por aproximadamente 10-20 s para secar a cola.
   NOTA: Para estabilizar o rim durante este procedimento, use um par adicional de fórceps para manter o rim ereto à medida que a cola seca. É fundamental que o rim adere à placa da amostra em posição vertical para que as seções sejam cortadas em linha reta. Para garantir que o rim tenha aderido com sucesso à placa da amostra, empurre suavemente o lado do rim. Se o rim tiver aderido com sucesso à placa, a base do rim deve permanecer presa à placa.
3. Fixar firmemente a placa do espécime na parte inferior da bandeja de tampão. Ajuste o nível da solução KRB para que a parte superior do rim esteja totalmente imersa. Durante as etapas de secção, à medida que a lâmina vibratome se move mais profundamente na bandeja de buffer, remova a solução KRB para que o suporte da lâmina não fique imerso na solução.
   NOTA: Se a cola não tiver secado completamente antes de prosseguir com esta etapa, a cola muitas vezes se moverá da base e para o parênquim do rim. Esse excesso de cola tornará a secção mais variável. Se isso acontecer, remova o rim da placa e prossiga com uma preparação renal fresca.
4. Para seção automática de vibratome, selecione as posições de início e extremidade do ciclo de corte da lâmina vibratome. Verifique se essas posições estão ~0,5-1 cm claras do rim para garantir que, a cada avanço da lâmina, todo o plano renal seja seccionado.
5. Prepare uma placa multi-welled (24 ou 48-well) preenchendo poços com solução KRB e coloque a placa no gelo.
   NOTA: Quando geradas, seções individuais devem ser colocadas em poços separados para acompanhar a profundidade da seção.
6. Inicie o processo de corte automático. Durante a passagem inicial da lâmina, certifique-se de que a lâmina faça contato com a parte superior do rim. Se o contato não for feito, ajuste a posição Z inicial da lâmina.
7. Usando fórceps, colete seções que são liberadas do rim. Transfira imediatamente as seções para poços individuais e observe a profundidade Z das seções para medir a localização aproximada do PKJ dentro das seções renais.
   NOTA: Dependendo dos parâmetros de corte, algumas seções podem não ser cortadas livre do bloco renal. Se isso ocorrer, use cuidadosamente uma tesoura de mola fina para cortar seções do bloco renal. Os usuários também são encorajados a visualizar ativamente seções sob um microscópio leve, enquanto flutuam livremente em poços individuais para garantir configurações de corte ideais e localização do tecido. Seções contendo o PKJ serão tipicamente derivadas ~ 1000-1500 μm do topo do rim.
8. Continue o protocolo de secção até que as regiões do PKJ se tornem mais aparentes. Consulte a seção de resultados representativos para descrição das regiões do PKJ à medida que a secção prossegue.
9. Neste ponto, otimize os parâmetros de secção para garantir que as seções sejam liberadas do bloco renal uniformemente e estejam intactas. Além disso, certifique-se de que as regiões do PKJ sejam contínuas e ininterruptas porque paredes PKJ quebradas não permitirão imagens adequadas de células dentro da parede devido ao colapso. Se as paredes forem quebradas, diminua a velocidade de seção e aumente a espessura da seção e continue a observar seções sob um microscópio leve para ajustar os parâmetros de corte.
10. Armazene seções a 4°C na solução KRB até que a experimentação comece.

9. Fatia de rim Ca²⁺ aquisição de imagem

1. Transfira uma fatia de rim individual para um prato de imagem revestido de elastômero de silício (35 mm x 10 mm), e preencha imediatamente o prato com uma solução KRB fresca e gelada.
2. Insira pinos minutien ao redor da periferia de uma fatia de rim para fixar a seção na base do prato de imagem.
   NOTA: Esta etapa é fundamental para evitar que a seção se mova quando soluções fisiológicas são perfundidas sobre a fatia durante a imagem.
3. Coloque o prato de imagem no palco de um microscópio confocal de disco giratório vertical e comece imediatamente a perfumar com a solução KRB.
   NOTA: Neste protocolo, foi utilizado um microscópio vertical equipado com uma unidade de scanner confocal de disco de alta velocidade Nipkow.
4. Mantenha a taxa de perfusão em 3 mL/min e a temperatura da solução KRB em 36 ± 1 °C. Antes da imagem, deixe a fatia equilibrar por 1h.
5. Selecione o cubo de imagem dicroica apropriado e lasers. Adquira imagens com um dispositivo acoplado a cargas multiplicadora de elétrons (EMCCD) ou câmera científica complementar de óxido de metal-semicondutor.
   NOTA: O sistema confocal neste protocolo está equipado com um laser de 488 nm para excitar GCaMP6f ou GCaMP3. As imagens foram adquiridas usando uma câmera EMCCD de 512 pixels x 512 pixels.
6. Use uma lente objetiva de baixa ampliação e imersão em água (4x ou 10x) para localizar a fatia renal. Centralizar o campo de imagem em áreas da fatia onde o PKJ está presente. Identificar marcos, como descrito na Figura 2D,para localizar o PKJ (ou seja, semicírculos de tecidos musculares suspensos entre tecido paríno).
7. Uma vez que o PKJ esteja localizado, use uma lente objetiva de imersão de água de ampliação (20x, 40x ou 60x) para ampliar a área de interesse.
   NOTA: Neste protocolo, a abertura numérica objetiva de 20x (NA) foi de 1,0, a NA 40x objetiva foi de 0,8 e a NA objetiva de 60x foi de 1,0.
8. Distingue diferentes células de interesse na parede PKJ usando camundongos transgênicos expressando GCaMP6f ou GCaMP3 em células PDGFRα⁺ ou SMCs, respectivamente. Observe os diferentes tipos de durações transitórias ca²⁺ em células PDGFRα⁺ na parede PKJ em PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ fatias de rim (Figura 3C, ver resultados representativos para descrição) e em GCaMP3⁺ SMCs em SMC GCaMP3⁺ fatias de rim(Figura 3D, ver resultados representativos para descrição).
9. Uma vez identificadas células de interesse na parede PKJ, ajuste a intensidade do laser para produzir uma boa relação sinal-ruído. Registo de imagens em uma frequência de amostragem temporal entre 16 Hz e 32 Hz usando software de aquisição adequado.
   NOTA: Dependendo da intensidade do laser utilizada durante a imagem, recomenda-se limitar o número de gravações devido aos efeitos de branqueamento em ca²⁺ fluoroforos. O usuário deve escolher o comprimento de gravação com base nos objetivos experimentais específicos.

10. Análise de imagem ca²⁺

1. Realize a análise de imagem Ca²⁺ de diferentes tipos de células nas regiões do marca-passo PKJ por mapeamento espacial, como descrito anteriormente para outras preparações de marca-passo intactas no trato gastrointestinal^29,30.

Resultados

In situ Ca²⁺ imagens do PKJ podem revelar importante atividade celular de células pacemaker RP. Usando camundongos que expressam indicadores ca²⁺ geneticamente codificados (como GCaMP), impulsionados por promotores específicos de células, informações sobre o pacemaking de RP podem ser obtidas com precisão e detalhes que não são possíveis a partir de experimentos de imagem Ca²⁺ a partir de preparações de RP de folhas planas. O início do PKJ é distinguido pelo aparecimento repentino de semi-círculos de músculo suspenso entre tecido parênco renal(Figura 2C; PKJ proximal fechado em caixa tracejada). Durante as rodadas subsequentes de secção, a medula interna torna-se distinguível do tecido cortical circundante. Sob um microscópio leve, a medula interna aparece estriada em regiões, de cor mais clara em comparação com o tecido cortical e descontínua em seu longo eixo com o resto do rim (Figura 2B,D). Neste ponto, mais regiões de PKJ começarão a aparecer. Exemplos disso são mostrados na Figura 2D (retângulos tracejados, H e G) onde 3 semi-círculos de músculo são suspensos por tecido paríno. Estas bandas musculares serão intimamente appostas à papila interna e normalmente vizinham de uma arteriola renal (Figura 2D, retângulos tracejados; Figura 2F-H, pontas de flecha preta). À medida que mais seções distais são derivadas, essas faixas musculares se integrarão para formar uma estrutura mais completa e unificada, indicando o fim da região do PKJ(Figura 2E).
Figura 3A, B mostra uma seção PKJ em baixa potência (4-10x) de um mouse expressando GCaMP em células PDGFRα⁺ (GCaMP6f expressa por Cre-recombinase indutível impulsionado por Pdgfra). Usando marcos como a arteriola renal (Figura 3A; asterisco), os experimentadores devem ser capazes de distinguir prontamente a fina parede PKJ suspensa entre tecido parenchímico(Figura 3B; asteriscos). A expressão de GCaMP6f neste tecido transgênico específico é espalhada por toda a largura do PKJ, tanto através das camadas musculares quanto aventuradas(Figura 3C).

Em PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ fatias de rim, uma rede de células que normalmente se estende sobre a largura da parede PKJ será fluorescente(Figura 3C) e exibirá transitórios ca²⁺ oscilantes de várias durações e frequências. As células PDGFRα⁺ na parede PKJ exibem dois tipos diferentes de durações transitórias ca^2+. Na camada aventureira (orientada mais próxima do córtex), as células PDGFRα⁺ presentes como uma rede de células e seus processos são definidos. As células Aveniitial PDGFRα⁺ apresentam transitórios de baixa frequência (4 ± 2,7 Hz) e de longa duração (1 ± 0,67 s) Ca^2+. A segunda camada de células PDGFRα^+, presente na camada muscular (orientada mais próxima da medula), exibe frequências e durações transitórias semelhantes como células SMC GCaMP3⁺ (descritas abaixo) por serem do mesmo tipo de célula.

No SMC GCaMP3⁺ fatias de rim, uma camada de células GCaMP3⁺ está presente na camada muscular(Figura 3D). Não haverá sinal fluorescente na camada aventureira(Figura 3D; asterisco). GCaMP3⁺ SMCs na camada muscular normalmente apresentam transitórios de alta frequência (10 ± 4 Hz) e de curta duração (632 ± 74 s) Ca^2+. Células PDGFRα⁺ localizadas no PKJ adventitia provocam transientes ca²⁺ de longa duração e baixa frequência(Figura 3E, Vídeo 1). No entanto, os experimentos de imagem Ca²⁺ do tecido que expressa GCaMP3 impulsionados pelo promotor Myh11 estão restritos ao aspecto muscular do PKJ (Figura 3D). Em comparação com as células PDGFRα⁺ na adventitia, os SMCs dispararam transicionários ca²⁺ de menor duração com mais frequência(Figura 3F, Vídeo 2).

Além de entender as propriedades de sinalização em PKJ PDGFRα⁺ ICs, a aplicação desta técnica para estudar outros tipos de células no rim seccionado de vibratome foi demonstrada neste artigo. Após um exame minucial da medula renal (em camundongos expressando GCaMP6f em células PDGFRα^+), observou-se uma matriz de sinais fluorescentes ca²⁺ dentro e ao redor de dutos coletores(Vídeo 3). Células PDGFRα⁺ medullary dispararam transitórios espontâneos Ca²⁺ de frequência e duração variável. Estes estudos de imagem Ca²⁺ de seções de vibratome renal também poderiam ser expandidos para o estudo de arteriolas renais (~50-80 mm de diâmetro) que muitas vezes vizinhos segmentos musculares PKJ(Figura 2F, G; setas brancas). A imagem de Ca²⁺ de arterioles renais (de tecido expressando GCaMP em células musculares lisas) demonstra transientes ca²⁺ oscilantes em SMCs(Vídeo 4).

Figura 1: Anatomia renal básica e localização da região do marca-passo PKJ. (A) Diagrama do rim intacto mostrando a orientação do RP e ureter. A artéria renal e a veia renal são exibidas em vermelho e azul, respectivamente. (B) O rim intacto pode ser cortado ao longo de um plano sagital para expor o aspecto interno do rim, incluindo a medula, a papila (medula distal onde os dutos coletores convergem), e rp proximal e distal. (C) A medula e a papila podem ser extirpadas para expor completamente o PKJ e prox RP. (D e E) representam imagens de luz transmitidas da região do marca-passo PKJ e rp distal, respectivamente. A secção sequencial para a extremidade distal da pelve resulta nos semicírculos do músculo na região PKJ(Di)combinando em um anel muscular mais espesso(Ei) que encapsula toda a papila. Retângulos pretos e tracejados em Di e Ei mostram áreas aproximadas em seções de rim coronal onde imagens de luz transmitidas foram adquiridas. Orientação das imagens D e E são 90° no sentido anti-horário para os respectivos insets(Di e Ei). Barras de escala em D e E = 20 μm. Abreviaturas: RP = pélvis renal; prox RP = pélvis renal proximal; PKJ = junção pélvica-renal; PICs = fator de crescimento derivado de plaquetas receptor-alfa-positiva células intersticiais; SMC = célula muscular lisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A seção de vibratome de rins inteiros para gerar seções finas. (A) Os rins são montados lado ureter até a base do instrumento vibratome, e uma lâmina padrão (presa à cabeça do vibratome) é usada para cortar seções sequenciais da extremidade proximal e distal do rim. (B) Representação diagramática de uma seção fina cortada de todo o rim com marcos anotados. Segmentos musculares PKJ (retângulo preto) são frequentemente encontrados suspensos entre tecido parênquimo. (C) Imagem microscópica leve de uma seção renal proximal. O aparecimento de faixas musculares suspensas entre tecido parenchímico indica o início das projeções proximais de PKJ (indicadas dentro do retângulo branco tracejado). (D) Imagem microscópica leve representando a região ideal onde podem ser encontrados múltiplos (2-3) segmentos de PKJ (áreas dentro de retângulos brancos). As tiras musculares finas do PKJ são suspensas entre o parenchyma renal e se alinham estreitamente com as artérias renais e a medula. (E) Imagem microscópica leve de uma seção renal distal. Segmentos musculares individuais fundiram-se para formar uma única faixa muscular contínua (retângulo branco tracejado) que envolve a papila interna (não presente nesta imagem). Barras de escala C-E = 500 μm. F-H As regiões ampliadas (20x) do painel D indicam a localização do PKJ (pontas de flecha preta), arterioles renais (pontas de flecha branca) e locais de corte para isolar o PKJ (linhas brancas tracejadas). Barras de escala F-H = 100 μm. Abreviação: PKJ = junção pélvica-renal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagem ca²⁺ de seções de vibratome. (A) Imagem representativa de baixa potência (4x) de uma seção vibratome denotando a localização da artéria renal (asterisco). Barra de escala = 200 μm. (B) Imagem representativa ampliada (20x) do PKJ (rotulado) suspensa entre tecido parcário renal denotando locais do músculo PKJ (ponta de flecha branca), arteriole renal (asterisco). Barra de escala = 50 μm. (C) Imagem de alta potência (40x) do PKJ expressando GCaMP em células PDGFRα⁺ . Barra de escala = 20 μm. (D) Imagem de alta potência (20x) do PKJ expressando GCaMP em células musculares lisas. Barra de escala = 20 μm. (E) Mapa espacial de transitórios Ca²⁺ amostrados de uma célula GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicada no painel C. Procure a tabela codificada para F/F₀. (F) Mapa espesso de transintes Ca²⁺ amostrados de uma célula GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicada no painel D. Procure a tabela codificada para F/F₀. (G) Dados representativos para ca²⁺ frequência transitória (Hz) para células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ e células GCaMP⁺ smMHC. (H) Dados representativos para ca²⁺ duração transitória (s) para células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ e células GCaMP⁺ smMHC. Abreviaturas: PKJ = junção pélvico-renal; PDGFRα⁺ = fator de crescimento derivado da plaqueta receptor-alfa-positivo; smMHC = músculo liso myosin cadeia pesada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Transitórios espontâneos Ca²⁺ em células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ em seções de vibratome PKJ. Abreviaturas: PKJ = junção pélvico-renal; PDGFRα⁺ = fator de crescimento derivado da plaqueta receptor-alfa-positivo. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Vídeo 2: Transitórios espontâneos Ca²⁺ em GCaMP⁺ células musculares lisas em seções vibratome de junção pélvica-renal. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Vídeo 3: Transitórios espontâneos Ca²⁺ em células GCaMP⁺ PDGFRα⁺ em seções de vibratome medular renal. Abreviação: PDGFRα⁺ = fator de crescimento derivado de plaquetas receptor-alfa-positivo. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Vídeo 4: Atividade transitória Ca²⁺ de baixa amplitude nas seções vibratome da arteriola renal. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do download.)

Discussão

O RP consiste em uma população heterogênea de células com densidades celulares diferenciadas observadas em várias regiões de RP. Pic1s (anteriormente referidos como ASMCs) são mais abundantes no PKJ, onde a atividade do marca-passo se origina²⁴. O protocolo, descrito aqui, permite que os investigadores isolem a região do marca-passo do resto do rim do rato. Ao cortar seções de PKJ usando um vibratome, as regiões de marca-passo do RP (identificadas como faixas musculares ligadas ao parenchyma) são mantidas intactas, permitindo assim o uso de imagens in situ para estudar com precisão células marcapassos RP quando combinadas com repórteres de fluorescência específicas de células.

Embora essa abordagem possa fornecer novas informações sobre o pacemaking de RP, existem algumas considerações com as que os experimentadores devem estar familiarizados para melhorar os resultados de imagem e a eficiência de secção. Para um usuário destreinado, este método de isolamento e imagem PKJ é mais fácil de aprender do que a dissecção afiada típica de preparações de RP de folhas planas. Dissecção acentuada de RP de rins inteiros requer semanas de prática consistente para isolar com sucesso tecidos viáveis para experimentos de fisiologia. Como este protocolo de secção vibratome requer pouco conhecimento de dissecção nítida, é acessível a usuários que não têm experiência em dissecar outras estruturas musculares lisas.

No entanto, há alguns pontos críticos a serem observados para este protocolo. A adesão com sucesso dos rins à placa do espécime vibratome requer destreza e paciência. Se o rim for orientado incorretamente e inclinar-se para um lado, oblíquo em vez de seções retas será cortado. Devido à natureza delicada do PKJ, o ângulo oblíquo pode muitas vezes destruir as faixas musculares da região do marca-passo. Além disso, a imagem de seções oblíquas resulta em má aquisição de imagens, pois as redes celulares não estão tipicamente no mesmo plano focal. O procedimento também é demorado, com a secção de um único rim muitas vezes levando até uma hora para ser concluída, período durante o qual a configuração requer monitoramento.

Enquanto o movimento do vibratome pode ser acelerado, se a velocidade for aumentada demais (>20% do que o recomendado no protocolo), a lâmina vai rasgar em vez de cortar o rim de forma limpa, resultando na perda de delicadas estruturas PKJ. Da mesma forma, uma velocidade de corte muito baixa pode fazer com que a seção fique irregular. A otimização da velocidade de corte e da amplitude da lâmina é essencial. Deve-se também ter cuidado no manuseio de seções vibratome. Devido à sua natureza delicada, os músculos PKJ são facilmente interrompidos durante o manuseio e podem rasgar. Um usuário bem treinado será capaz de colher aproximadamente 1-2 regiões PKJ por 4 fatias de rim que são adequadas para experimentos de imagem Ca^2+. Normalmente, seções PKJ que não atendem aos critérios de imagem Ca²⁺ têm: 1) má expressão GCaMP, 2) uma parede PKJ contorcida, ou 3) uma parede PKJ quebrada. Para análise de dados, aproximadamente 3-4 células por campo de visão (FOV) poderiam ser amostradas.

Embora existam muitas células no FOV das seções PDGFRα-GCaMP6f e SMC-GCaMP3 PKJ, pequenos movimentos teciduais frequentemente excluem as células da análise. Isso geralmente pode ser resolvido aplicando um protocolo de estabilização às imagens. Em condições em que as preparações não se movam, pelo menos 3-5 células podem ser amostradas das seções PDGFRα-GCaMP6f e 5-6 células das seções SMC-GCaMP3. Normalmente, o tempo retirado do sacrifício animal (idade ideal para camundongos é de 8 a 16 semanas) para realizar experimentos de imagem Ca²⁺ é de 2-3 h, o que é adequado para garantir a integridade do tecido, se os tecidos forem incubados em soluções geladas durante todo o procedimento quando necessário. Em resumo, um protocolo de corte de vibratome foi descrito aqui para gerar preparações intactas das regiões RP PKJ do rim do rato. Esta técnica permite a preservação de regiões de marca-passo RP para estudos de imagem in situ Ca²⁺ para investigar mecanismos de marca-passo RP.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	ThermoFisher Scientific	142485	To store kidney slices in
35 mm x 10 mm Petri dishes	Sigma Aldrich	CLS430165	Kidney slice calcium imaging dish
48-well culture plate	ThermoFisher Scientific	152640	To store kidney slices in
60 mm x 15 mm Petri dish	Sigma Aldrich	P5481	Kidney sharp dissection dish
Absorbent paper	Fisher Scientific	06-666A	To dry the kidney before applying glue
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	13148	GCaMP3 Mice
B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J	The Jackson Laboratory	24105	GCaMP6f Mice
B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	The Jackson Laboratory	19079	smMHC-CRE Mice
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	The Jackson Laboratory	13148	PDGFRa-CRE Mice
Cyanoacrylate glue	Amazon	B001PILFVY	For adhering the kidney to the specimen plate
Ethanol	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	For dissection
Extra-Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14083-08	Used for internal dissecting scissors
Fine scissors	Fine Science Tools	14060-09	Used for external dissecting scissors
Fine-tip forceps	Fine Science Tools	11254-20	Used for fine dissection of kidney
Gillette Silver Blue double-edge blades	Amazon	B009XHQGYO	For insertion into blade holder of vibratome
ImageJ	NIH		For calcium imaging analysis
Isoflurane	Baxter	NDC 1001936060	For anesthesia
Minutien pins	Fisher Scientific	NC9677548	Pins were cut in half to reduce their length
Silicon elastomer	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12	For gently holding and moving the kidney
Student Dumont Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Used for internal dissecting forceps
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03	For sharp dissection and cleanup of isolated kidney
Vibrocheck	Leica	14048142075	Optional component for calibrating blade movement during cutting
VT1200 S Vibrating Blade Microtome	Leica	14912000001	Configuration 1 is used in our protocol