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Resumo

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Resumo

Neurotransmissores de monoamina estão associados a inúmeras doenças neurológicas e psiquiátricas. Modelos animais de tais condições têm mostrado alterações na liberação e dinâmica de absorção de neurotransmissores de monoamina. Métodos tecnicamente complexos como eletrofisiologia, Voltammetry Ciclílica de Varredura Rápida (FSCV), imagem, microdiálise in vivo, optogenética ou uso de radioatividade são necessários para estudar a função monoamina. O método aqui apresentado é uma abordagem otimizada em duas etapas para detectar a liberação de monoamina em fatias cerebrais agudas usando uma placa de 48 poços contendo suportes teciduais para examinar a liberação de monoamina, e cromatografia líquida de alto desempenho, juntamente com a detecção eletroquímica (HPLC-ECD) para medição de liberação de monoamina. Resumidamente, seções cerebrais de ratos contendo regiões de interesse, incluindo córtex pré-frontal, hipocampo e estriado dorsal foram obtidas usando um cortador de tecido ou vibratome. Essas regiões de interesse foram dissecadas de todo o cérebro e incubadas em um tampão fisiológico oxigenado. A viabilidade foi examinada ao longo do curso de tempo experimental, por 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT). As regiões cerebrais dissecadas agudamente foram incubadas em diferentes condições de drogas que são conhecidas por induzir a liberação de monoamina através do transportador (anfetamina) ou através da ativação da liberação vesicular exociótica (KCl). Após a incubação, os produtos liberados no supernasciente foram coletados e analisados por meio de um sistema HPLC-ECD. Aqui, a liberação de monoamina basal é detectada pelo HPLC a partir de fatias cerebrais agudas. Esses dados suportam resultados in vivo e in vitro anteriores mostrando que a versão de amph e kcl induzem a liberação de monoamina. Este método é particularmente útil para estudar mecanismos associados à liberação dependente de transporte de monoamina e oferece uma oportunidade de triagem de compostos que afetam a liberação de monoamina de forma rápida e de baixo custo.

Introdução

Uma infinidade de doenças neurológicas e psiquiátricas estão associadas à desregulação ou à manutenção insuficiente do neurotransmissor de monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norrepinefrina [NE]) homeostasis1,2,3. Essas condições incluem, mas não se limitam a, depressão1,2, esquizofrenia2, ansiedade2, vício4, menopausa5,6,7, dor8 e doença de Parkinson3. Por exemplo, vários modelos de ratos da menopausa mostraram que a desregulação ou redução de monoaminas dentro do hipocampo, córtex pré-frontal e estriato podem estar associados tanto à depressão quanto ao declínio cognitivo, que é visto em mulheres que experimentam a menopausa. A desregulação das monoaminas nesses modelos tem sido extensivamente examinada por meio do HPLC-ECD, embora os estudos não discriminaram o conteúdo medido do neurotransmissor versus a liberação de neurotransmissores5,6,7. As monoaminas são liberadas clássicamente no espaço extracelular através da liberação vesicular dependente de Ca2+, e são recicladas de volta através de seu respectivo sistema de recaptação de membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)10,11. Por outro lado, os dados sugerem que esses transportadores são capazes de liberar ou monoaminas efflux, uma vez que drogas de abuso como anfetamina (ANFE) e 3,4-Methylenedioximethamfetamina (MDMA) são conhecidas por liberar DA e 5-HT, respectivamente através de seus sistemas de transporte12,13, 14,15,16,17 . Assim, uma compreensão mecanicista adequada da dinâmica de liberação de monoaminas é crucial para o desenvolvimento de farmacoterapeias específicas e direcionadas.

Uma ampla gama de técnicas foram empregadas para estudar a liberação de monoaminas como a Voltammetry Ciálica de Varredura Rápida (FSCV)18, in vivo microdiálise13, imagem19, pré-inincubtação com monoaminas radiolabeled20, optogenética e, mais recentemente, sensores fluorescentes geneticamente codificados e fotometria21,22 . A microdiálise FSCV e in vivo são as principais técnicas utilizadas para o estudo da liberação de monoaminas. O FSCV é usado para estudar a liberação exocitomática estimulada de, principalmente, DA em fatias cerebrais agudas e in vivo23. Como o FSCV usa eletrodos para estimular ou evocar a liberação, a principal fonte de liberação de neurotransmissores é a liberação vesicular dependente de Ca218,24,25,26,27,28,29,30,31 . A microdiálise in vivo juntamente com o HPLC mede mudanças nos níveis de neurotransmissor extracelular usando uma sonda colocada em uma área cerebral de interesse13,32. Semelhante ao FSCV, uma grande limitação à microdiálise in vivo é a dificuldade em determinar a fonte de liberação de neurotransmissores: liberação vesicular dependente de Ca2+ ou dependente de transporte. Vale ressaltar que ambos os métodos permitem a medição direta da liberação de monoamina. Através do recente avanço da optogenética, pesquisas demonstram a detecção da liberação de 5-HT e DA em um curto espaço de tempo com especificidade requintada do tipo celular21,22. No entanto, essas estratégias requerem técnicas e equipamentos complexos e caros, e medem indiretamente a liberação de monoamina, especificamente através da monoamina que liga aos receptores. Além disso, as monoaminas radiolabeladas também são usadas para estudar a dinâmica da monoamina. As monoaminas radiolabeladas podem ser pré-carregadas em vários sistemas de modelo, como células heterólogas que superexpressam cada transporte monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neurônios primários20, sinapstos33,39,41, 42, e cortes cerebrais agudas43,44. No entanto, a radioatividade representa danos potenciais ao experimentador, e os analitos rotulados com trítio podem não recapitular fielmente a dinâmica endógena da monoamina45,46. Sistemas de superfusão combinados com métodos de detecção off-line, como o HPLC-ECD, permitiram a detecção de monoaminas de múltiplas fontes de tecido. Aqui, este protocolo fornece como um método otimizado e de baixo custo, simples e preciso usando fatias cerebrais agudas para medir diretamente a liberação de basal endógeno e estimulada.

As fatias cerebrais agudas permitem testar hipóteses mecanicistas, principalmente porque preservam o microambiente anatômico in vivo, e mantêm sinapses intactas47,48,49,50,51,52. Em alguns estudos, fatias cerebrais agudas ou tecido cerebral picado têm sido usados em conjunto com uma técnica de superfusão usando KCl para estimular a liberação mediada ca2+53,54,55,56. Os sistemas de superfusão têm sido fundamentais para avançar a compreensão do campo sobre os mecanismos de liberação de neurotransmissores, incluindo as monoaminas. No entanto, esses sistemas são relativamente caros, e o número de câmaras disponíveis para análise de tecidos varia de 4 a 12. Em comparação, o método aqui apresentado é barato, permite a medição de 48 amostras de tecido, podendo ser refinado para usar até 96 amostras de tecido. Cada poço dentro da placa de 48 poços contém suportes de tecido que usam filtros para separar o produto liberado do tecido, e as monoaminas liberadas são então coletadas e analisadas pelo HPLC-ECD. É importante ressaltar que este método permite a medição simultânea de 5-HT, DA e NE de diferentes áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal, o hipocampo e o estriado dorsal após o tratamento com agentes farmacológicos que modulam a liberação de monoamina. Assim, o experimentador pode responder a várias perguntas usando um sistema multi-poço barato que aumenta o número de amostras testadas e, assim, reduzindo o número de animais utilizados.

Protocolo

Todos os experimentos, incluindo manejo de animais e coleta de tecidos, foram realizados de acordo com a Universidade da Flórida e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), seguindo o protocolo aprovado 201508873 (UF) e 1071 (CCNY). Para reagentes e tampão, consulte o Arquivo Suplementar.

1. Prepare fatias agudas do cérebro de ratos

NOTA: Neste experimento foram utilizados ratos machos adultos (250-350 g). No entanto, essa configuração é funcional para diferentes pontos de desenvolvimento, ratos fêmeas e outras espécies. Se usar um animal menor, como ratos, o experimentador pode ajustar-se para otimizar o protocolo usando um número diferente de fatias cerebrais ou socos por condição. O buffer de dissecção será referido como Buffer 1; o buffer efflux será referido como Buffer 2.

  1. Prepare o Buffer 1 conforme mencionado no Arquivo Suplementar. Tampão saturado 1 com oxigênio borbulhando com 95%/5% (O2/CO2) por 20 min no gelo. Remova 50 mL de Buffer 1 e esfrie no gelo em um pequeno béquer ou uma placa de Petri. Este tampão é usado para segurar o cérebro inteiro colhido agudamente.
  2. Anestesiar um ou dois ratos adultos (250-350 g) com 1%-2% de isoflurane, decapitá-los usando uma guilhotina e remover rapidamente seus cérebros. Coloque imediatamente o cérebro no tampão oxigenado gelado 1 no recipiente a partir do passo 1.1.
    NOTA: Certifique-se de que isoflurano e guilhotina sejam usados com segurança. Isoflurano aberto sob um capô de fumaça.
  3. Usando um vibratome ou compresstome, corte 300 μm de seções cerebrais coronais de cada região de interesse (Figura 1). Tampão borbulhante 1 deve estar presente enquanto as seções estão sendo feitas. Usando uma espátula de aço inoxidável, transfira cuidadosamente e imediatamente fatias cerebrais em uma nova placa de Petri cheia de tampão oxigenado gelado 1 (Figura 2).
  4. Mais dissecar fatias cerebrais (por exemplo, socos, corte) movendo cuidadosamente as fatias para lâminas de vidro (Figura 1G) usando atlas cerebral de rato57. Por exemplo, identifique o estriado dorsal baseado em sua estrutura escura e estriada, e identifique o hipocampo com base em sua proximidade com o córtex e estrutura espiral única. Os hemisférios direito e esquerdo podem ser separados para usar como controle e fatias experimentais (Figuras 2G - H). Aqui, o estriado dorsal foi ainda dissecado em socos de 2 mm (Figura 1G).
  5. Usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada, transfira fatias ou socos cerebrais em pequenos recipientes imersos em buffer 1 gelado oxigenado com borbulhante de oxigênio. Estes recipientes podem ser de malha de aço inoxidável, ou pequenas placas de Petri cheias de tampão (Figura 1H).

2. Liberação de monoamina endógena ex-vivo de fatias cerebrais ou socos

NOTA: O dispositivo utilizado para esta seção consiste em uma placa de 48 poços e um suporte de tecido feito de seis unidades de filtro de microcentrifuuagem sem os filtros de inset conectados a uma linha de carbogen (Figura 2). Para fazer o suporte, use uma haste de plástico resistente (por exemplo, de um raspador de célula) e super cole as unidades do filtro de microcentrifuagem sem os filtros de entrada para ele. Deixe secar por 1-2 dias. O tempo necessário para o experimento de liberação endógena da monoamina e concentrações de anfetamina, fluoxetina e cocaína são baseados na literatura atual e protocolos anteriores13,20,58.

  1. Ativação tecidual
    1. Transfira o tecido cerebral da etapa 1.1.5 para cada poço da câmara efflux e permita a recuperação por 30-50 min a 37 °C em um aquecedor de slides em 0,5-1 mL de Buffer 2 oxigenado, com borbulhamento constante e suave (Figura 2B1).
    2. Durante esta incubação, diluir as drogas à concentração desejada para o experimento. Todas as drogas devem ser dissolvidas no Buffer 2, e as concentrações são baseadas na literatura atual.
  2. Primeira incubação
    1. Mova o suporte tecidual com tecido cerebral para poços contendo 500 μL de Buffer oxigenado 2 e incubar por 20 min a 37 °C. Certifique-se de que o mínimo para nenhum buffer seja transportado tocando no suporte na borda do poço até que não haja excesso de buffer no suporte.
    2. Em experimentos com agentes farmacológicos, como inibidores de transporte de monoamina, incubar as amostras de tecido com as drogas diluídas no Buffer 2 oxigenado (por exemplo, 10 μM fluoxetina, 40 μM de cocaína; ver Figura 2B2). O volume final em cada poço será de 500 μL.
  3. Segunda incubação
    1. Mova o suporte com o tecido para um novo conjunto de poços contendo 500 μL total Buffer 2 com ou sem a concentração desejada de cada droga. Certifique-se de que não há excesso de sobra de buffer. Cada poço representa um n = 1 para condições experimentais. Cada condição experimental é realizada em triplicado.
    2. Um poço inclui um Buffer 2 oxigenado, o próximo 10-30 μM AMPH, e o poço final inclui 10-30 μM AMPH mais inibidores de transporte de monoamina. Cada droga é dissolvida em Buffer 2 oxigenado.
    3. Incubar o tecido por 20 min a 37 °C com 500 μL da condição da droga.
      NOTA: Poços adicionais podem incluir um buffer K+ alto Oxigenado com ou sem os inibidores do transporte de monoamina. Dissolva cada droga no Buffer oxigenado 2 (500 μL).
    4. Durante esta segunda incubação de 20 min, colete a solução dos poços da primeira incubação na etapa 2.2.1 e transfira para tubos de microcentrifuuge contendo 50 μL de ácido polelorico de 1 N ou ácido fosfórico (dependente do tipo de HPLC, concentração final 0.1 N). O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha tubos de microcentrifuuge no gelo e rotule os tubos #1.
    5. Após a segunda incubação de 20 minutos, mova o suporte de tecido com seções cerebrais ou socos para um poço vazio e mantenha a placa no gelo. Transfira o supernatante para tubos de microcentrifuuge contendo 50 μL de ácido per polemérico de 1 N ou ácido fosfórico. O volume final da amostra será de 550 μL. Mantenha tubos de microcentrifuuge no gelo e rotule os tubos #2.
    6. Adicione 1 mL de tampão gelado 1 a cada tecido que contenha poços. Colete todo o tecido usando pinças pequenas e transfira para limpar tubos de microcentrifuuuagem.
    7. Mantenha tubos com tecido cerebral a -80 °C. Descarte os 1 mL de Tampão 1 (Figura 2B4).
    8. Soluções de filtro obtidas a partir de cada incubação utilizando tubos de filtro de microcentrifuuge (0,22 μm) a 2.500 x g por 2min. Use o filtrado para determinar o teor de monoamina usando HPLC com detecção eletroquímica (Figura 2B5).

3. Viabilidade tecidual

  1. Ensaio MTT
    NOTA: Uma preocupação significativa em relação a esta configuração experimental é a viabilidade tecidual, pois o tecido pode ser usado por até várias horas59. Um ensaio MTT60,61 é usado para determinar a viabilidade tecidual até o final da experimentação. Este ensaio baseia-se na conversão do sal de tetrazolium amarelo MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo) em cristais de formazan roxo por células viáveis com metabolismo adequado.
    1. O experimento pós-experimento mantém um grupo separado de amostras de tecido e as separa em dois grupos.
    2. Incubar um grupo por 20 min a 37 °C em Tritão X-100 (1%) dissolvido no Buffer 2 como controle. O tratamento triton X-100 resulta em morte celular. Mantenha o segundo grupo no Buffer 2 e não incubar em Triton X-100 (controle de viabilidade tecidual).
    3. Adicionar MTT (solução de estoque 5 mg/mL em PBS, pH 7.4) a ambos os grupos no Buffer oxigenado 2 a uma concentração final de 0,5 mg/mL.
    4. Incubar as amostras de tecido por 20 min a 37 °C, lavar com PBS e transferir para tubos de microcentrifuuge contendo 250 μL de uma mistura de SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) e água para dissolver os cristais formazan.
    5. Incubar as amostras por 24 h.
    6. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 10 min e medir a absorvência do supernante (200 μL) a 562 nm e 690 nm usando um leitor de microplape. A viabilidade tecidual é calculada da seguinte forma: (A562-A690)/peso tecidual.

4. Análise HPLC de monoaminas

  1. Quantifique a liberação de monoamina de cada condição experimental usando o HPLC-ECD de acordo com protocolos anteriores13,44, usando uma coluna de fase inversa.
    1. Prepare a fase móvel necessária para detecção. Este é composto por ácido fosfórico de 100 mM, ácido cítrico de 100 mM, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L ácido octanesulfônico, 8% v/v acetonitrila (pH final 6.0). A composição da fase móvel depende do tipo de HPLC e coluna utilizada.
    2. Defina o potencial do detector eletroquímico (eletrodo de carbono de 2 mm glassy,) para 0,46 V, e defina a vazão para 0,05 mL/min.
    3. Carregar 5 μL de cada amostra, incluindo padrões de neurotransmissores no HPLC para autoinjeção e detecção. A quantidade de cada amostra adicionada depende do tipo de HPLC utilizado.
    4. Uma vez que o HPLC tenha concluído a execução, use o software de análise HPLC dado para adquirir e analisar os dados do cromatógrafo.
    5. Analise o teor de monoamina usando uma curva padrão composta por cada monoamina (Dopamina: DA, Norepinephrine: NE e Serotonina: 5-HT; Figura 2C). Use os cromatógrafos resultantes para obter a área sob a curva (AUC) com base nas diretrizes do fabricante.

5. Preparar tecidos para quantificação de proteínas

  1. Ensaio de proteína
    1. Adicione tampão de lise gelada mais inibidores de protease (0,1 g/1 mL) a cada tubo de microcentrífuga contendo seções/socos cerebrais e homogeneize usando um homogeneizador de pilão. Os tubos de microcentrifuuge devem ser mantidos no gelo enquanto homogeneizam para evitar a degradação da proteína.
    2. Incubar o tecido homogeneiza por 1h a 4 °C com rotação de luz.
    3. O tecido centrífuga homogeneiza a 16.000 x g por 15 min a 4 °C e recupera o sobrenante.
    4. Determine a concentração de proteínas nos supernantes, com albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
    5. Normalize o teor de monoamina em cada amostra cerebral para o teor total de proteína (μg) medido em 250 μL de tecido cerebral lysed. Use a fórmula abaixo para determinar a proteína nmol monoamina/g. df = fator de diluição.

figure-protocol-11412

6. Análise estatística

  1. Analise a liberação de monoamina (nmol/g) usando ANOVA unidirecional seguido do teste de comparações múltiplas de Sidak para comparações pós-hoc.
  2. Analise a viabilidade do tecido usando o teste t de um aluno não remunerado para grupos independentes (Controle vs. 1% Triton X-100).
  3. Para todas as análises estatísticas, coloque o nível alfa para ≤ 0,05.

Resultados

Esta técnica descreve o uso de fatias cerebrais para medir a liberação de monoaminas endógenas usando HPLC com detecção eletroquímica baseada em uma placa de 48 poços com um suporte interno de tecido. A configuração experimental é retratada na Figura 1 e Figura 2. Inicialmente, para garantir a viabilidade tecidual até o final da experimentação, foi realizado um ensaio de MTT (4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difenilt...

Discussão

As medidas de liberação de monoaminas têm sido realizadas durante anos em vários sistemas como células heterólogas, culturas neuronais, sinapstosas cerebrais, fatias cerebrais agudas ex vivo e animais inteiros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68

Divulgações

Os autores não têm revelações.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Fondecyt Initiation Fund N 11191049 a J.A.P. e NIH grant DA038598 à G.E.T.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
48 Well plateNANAAssay
AcetonitrileFischer ScientificA998-1Mobile Phase
Calcium Chloride AhydrousSigma AldrichC1016Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity SoftwareAnetc
Citric AcidSigma AldrichMobile Phase
D-(+)-GlucoseSigma1002608421Dissection Buffer
DMFSigma AldrichD4551MTT Assay
EDTA-Na2Sigma AldrichMobile Phase
GraphPad SoftwareGraphpad Software, IncStatistical Analysis
GlycerolSigma AldrichG5516Lysis buffer
HEPESSigma AldrichH3375Lysis buffer
HPLC, Decade AmperometricAnetcHPLC, LC-EC system
HPLCAmuzaHPLC HTEC-510.
L-Asrobic AcidSigma AldrichA5960Dissection Buffer
Magnesium SulfateSigma7487-88-9KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFreeMilliporeC7554Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTTThermo FisherM6494MTT Assay
NanosepVWR29300-606Assay; protein assay
Octanesulfonic acidSigma AldrichV800010Mobile Phase
Pargyline ClorohydrateSigma AldrichP8013Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric AcidSigma AldrichMobile Phase
Potassium ChlorideSigma12636KH Buffer
Potassium Phosphate MonobasicSigma1001655559KH Buffer
Precisonary VF-21-0ZPrecissonaryCompresstome
Protease Inhibitor CocktailSigma AldrichP2714Lysis buffer.
Sodium BicarbonateSigmaS5761Dissection Buffer
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761Dissection Buffer
Sodium ChlorideSigmaS3014KH Buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma AldrichL3771Lysis buffer
Triton X-100Sigma AldrichT8787MTT Assay / Lysis buffer

Referências

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