Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
Этот метод вводит простую технику обнаружения эндогенного высвобождения моноаминов с использованием острых срезов мозга. Установка использует 48-луночную пластину, содержащую держатель ткани для высвобождения моноамина. Высвобождаемый моноамин анализируется методом ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. Кроме того, этот метод обеспечивает метод скрининга для обнаружения лекарств.
Моноаминовые нейротрансмиттеры связаны с многочисленными неврологическими и психическими заболеваниями. Животные модели таких состояний показали изменения в динамике высвобождения и поглощения моноаминных нейротрансмиттеров. Технически сложные методы, такие как электрофизиология, циклическая вольтаметрия быстрого сканирования (FSCV), визуализация, микродиализ in vivo, оптогенетика или использование радиоактивности, необходимы для изучения функции моноаминов. Метод, представленный здесь, представляет собой оптимизированный двухэтапный подход к обнаружению высвобождения моноаминов в острых срезах мозга с использованием 48-луночной пластины, содержащей тканевые держатели для изучения высвобождения моноаминов, и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическим обнаружением (ВЭЖХ-ECD) для измерения высвобождения моноамина. Вкратце, участки мозга крыс, содержащие области, представляющие интерес, включая префронтальную кору, гиппокамп и дорсальный стриатум, были получены с использованием тканевого слайсера или вибратома. Эти области, представляющие интерес, были рассечены из всего мозга и инкубированы в насыщенном кислородом физиологическом буфере. Жизнеспособность исследовали на протяжении всего экспериментального временного хода с помощью анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Остро рассеченные области мозга инкубировали в различных условиях наркотиков, которые, как известно, индуцируют высвобождение моноамина через транспортер (амфетамин) или через активацию экзоцитотического везикулярного высвобождения (KCl). После инкубации высвобождаемые продукты в супернатанте собирали и анализировали через систему ВЭЖХ-ЭТП. Здесь базальное высвобождение моноамина обнаруживается методом ВЭЖХ из острых срезов мозга. Эти данные подтверждают предыдущие результаты in vivo и in vitro, показывающие, что AMPH и KCl индуцируют высвобождение моноаминов. Этот метод особенно полезен для изучения механизмов, связанных с моноаминным транспортер-зависимым высвобождением, и дает возможность быстро и недорого экранировать соединения, влияющие на высвобождение моноаминов.
Множество неврологических и психиатрических заболеваний связано с дисрегуляцией или недостаточным поддержанием моноаминового нейромедиатора (дофамин [DA], серотонин [5-HT], норадреналин [NE]) гомеостаза1,2,3. Эти состояния включают, но не ограничиваются ими, депрессию1,2, шизофрению2, беспокойство2, зависимость4, менопаузу5,6,7, боль8 и болезнь Паркинсона3. Например, несколько крысиных моделей менопаузы показали, что дисрегуляция или уменьшение моноаминов в гиппокампе, префронтальной коре и полосатом теле может быть связана как с депрессией, так и с когнитивным снижением, что наблюдается у женщин, испытывающих менопаузу. Дисрегуляция моноаминов в этих моделях была широко изучена с использованием ВЭЖХ-ECD, хотя в исследованиях не проводилось различия между измеренным содержанием нейротрансмиттеров и высвобождением нейротрансмиттеров5,6,7. Моноамины классически высвобождаются во внеклеточное пространство через Ca2+-зависимое везикулярное высвобождение9 и рециркулируются обратно через соответствующую систему обратного захвата плазматической мембраны (транспортер дофамина, DAT; транспортер серотонина, SERT; транспортер норадреналина, NET)10,11. И наоборот, данные свидетельствуют о том, что эти транспортеры способны высвобождать или выбрасывать моноамины, поскольку наркотики злоупотребления, такие как амфетамин (AMPH) и 3,4-метилендиоксиметамфетамин (MDMA), как известно, высвобождают DA и 5-HT, соответственно, через их транспортные системы12,13,14,15,16,17 . Таким образом, правильное механистическое понимание динамики высвобождения моноаминов имеет решающее значение для разработки конкретных и целевых фармакотерапий.
Для изучения высвобождения моноаминов был использован широкий спектр методов, таких как циклическая вольтамперметрия с быстрым сканированием (FSCV)18, микродиализ in vivo13, визуализация19, преинкубация с радиомаркированными моноаминами20, оптогенетика и, в последнее время, генетически закодированные флуоресцентные датчики и фотометрия21,22 . FSCV и микродиализ in vivo являются основными методами, используемыми для изучения высвобождения моноаминов. FSCV используется для изучения стимулированного экзоцитотического высвобождения, в первую очередь, DA в острых срезах мозга и in vivo23. Поскольку FSCV использует электроды для стимуляции или вызова высвобождения, основным источником высвобождения нейротрансмиттера является Ca2+-зависимое везикулярное высвобождение18,24,25,26,27,28,29,30,31 . Микродиализ in vivo в сочетании с ВЭЖХ измеряет изменения уровней внеклеточных нейротрансмиттеров с помощью зонда, помещенного в интересующую область мозга13,32. Подобно FSCV, основным ограничением микродиализа in vivo является трудность определения источника высвобождения нейротрансмиттера: Ca2+ зависимое везикулярное высвобождение или транспортер-зависимый. Примечательно, что оба метода позволяют проводить прямое измерение высвобождения моноаминов. Благодаря недавнему прогрессу оптогенетики исследования демонстрируют обнаружение высвобождения 5-HT и DA за короткий промежуток времени с изысканной специфичностью клеточного типа21,22. Однако эти стратегии требуют сложных и дорогостоящих методов и оборудования и косвенно измеряют высвобождение моноаминов, в частности, через связывание моноаминов с рецепторами. Кроме того, радиомаркированные моноамины также используются для изучения динамики моноаминов. Радиомаркированные моноамины могут быть предварительно загружены в различные модельные системы, такие как гетерологичные клетки, сверхэкспрессирующие каждый транспортер моноаминов20,33,34,35,36,37,38,39,40, первичные нейроны20, синаптосомы33,39,41, 42, и острые мозговые срезы43,44. Однако радиоактивность представляет потенциальный вред для экспериментатора, и меченые тритием аналиты могут не точно повторять эндогенную динамику моноаминов45,46. Суперфузионные системы в сочетании с автономными методами обнаружения, такими как ВЭЖХ-ECD, позволили обнаруживать моноамины из нескольких тканевых источников. Здесь этот протокол обеспечивает как оптимизированный и недорогой, простой и точный метод с использованием острых срезов мозга для непосредственного измерения эндогенного базального и стимулированного высвобождения моноаминов.
Острые срезы мозга позволяют проверять механистические гипотезы, прежде всего потому, что они сохраняют in vivo анатомическую микросреду и поддерживают неповрежденные синапсы47,48,49,50,51,52. В нескольких исследованиях острые срезы мозга или измельченная мозговая ткань использовались в сочетании с техникой суперфузии с использованием KCl для стимуляции опосредованного высвобождения Ca2+53,54,55,56. Суперфузионные системы имеют решающее значение для продвижения понимания в этой области механизмов высвобождения нейротрансмиттеров, включая моноамины. Однако эти системы относительно дороги, а количество камер, доступных для анализа тканей, колеблется в пределах 4-12. Для сравнения, метод, представленный здесь, является недорогим, позволяет измерять 48 образцов тканей и может быть усовершенствован для использования до 96 образцов тканей. Каждая скважина в 48-луночной пластине содержит тканевые держатели, которые используют фильтры для отделения высвобождаемого продукта от ткани, а высвобождаемые моноамины затем собираются и анализируются с помощью ВЭЖХ-ECD. Важно отметить, что этот метод позволяет одновременно измерять высвобождение 5-HT, DA и NE из различных областей мозга, таких как префронтальная кора, гиппокамп и дорсальное полосатое тело после лечения фармакологическими агентами, которые модулируют высвобождение моноаминов. Таким образом, экспериментатор может ответить на несколько вопросов, используя недорогую многолуночную систему, которая увеличивает количество тестируемых образцов и тем самым уменьшает количество используемых животных.
Все эксперименты, включая обращение с животными и сбор тканей, проводились в соответствии с Университетом Флориды и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Городского колледжа Нью-Йорка (IACUC) в соответствии с утвержденными протоколами 201508873 (UF) и 1071 (CCNY). Для реагентов и буфера, пожалуйста, обратитесь к Дополнительному файлу.
1. Подготовьте острые срезы мозга крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовались взрослые самцы крыс (250-350 г). Тем не менее, эта установка функциональна для различных точек развития, самок крыс и других видов. При использовании более мелкого животного, такого как мыши, экспериментатор может настроиться на оптимизацию протокола, используя различное количество срезов мозга или ударов по каждому условию. Буфер рассечения будет называться Буфером 1; буфер efflux будет называться буфером 2.
2. Высвобождение эндогенного моноамина Ex-vivo из мозговых срезов или ударов
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство, используемое для этой секции, состоит из 48-луночной пластины и тканевого держателя, изготовленного из шести фильтрующих блоков микроцентрифуги без вставок-фильтров, соединенных с карбогенной линией (рисунок 2). Чтобы изготовить держатель, используйте прочный пластиковый стержень (например, из скребка ячеек) и супер приклейте к нему фильтрующие блоки микроцентрифуги без вставок-фильтров. Дайте высохнуть в течение 1-2 дней. Время, необходимое для эксперимента по эндогенному высвобождению моноаминов, и концентрации амфетамина, флуоксетина и кокаина основаны на текущей литературе и предыдущих протоколах13,20,58.
3. Жизнеспособность тканей
4. ВЭЖХ-анализ моноаминов
5. Подготовка тканевых лизатов для количественной оценки белка
6. Статистический анализ
Этот метод описывает использование срезов мозга для измерения высвобождения эндогенных моноаминов с использованием ВЭЖХ с электрохимическим обнаружением на основе 48-луночной пластины с внутренним тканевым держателем. Экспериментальная установка показана на
Измерения высвобождения моноаминов проводились в течение многих лет в ряде систем, таких как гетерологичные клетки, нейронные культуры, синаптосомы мозга, острые срезы мозга ex vivo и целые животные13,20,41,42,58,64,65,66,67,68
Авторы не раскрывают информацию.
Эта работа была поддержана грантами Fondecyt Initiation Fund N 11191049 для J.A.P. и грантом NIH DA038598 для G.E.T.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
48 Well plate | NA | NA | Assay |
Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Clarity Software | Anetc | ||
Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены