Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
Этот метод вводит простую технику обнаружения эндогенного высвобождения моноаминов с использованием острых срезов мозга. Установка использует 48-луночную пластину, содержащую держатель ткани для высвобождения моноамина. Высвобождаемый моноамин анализируется методом ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. Кроме того, этот метод обеспечивает метод скрининга для обнаружения лекарств.
Моноаминовые нейротрансмиттеры связаны с многочисленными неврологическими и психическими заболеваниями. Животные модели таких состояний показали изменения в динамике высвобождения и поглощения моноаминных нейротрансмиттеров. Технически сложные методы, такие как электрофизиология, циклическая вольтаметрия быстрого сканирования (FSCV), визуализация, микродиализ in vivo, оптогенетика или использование радиоактивности, необходимы для изучения функции моноаминов. Метод, представленный здесь, представляет собой оптимизированный двухэтапный подход к обнаружению высвобождения моноаминов в острых срезах мозга с использованием 48-луночной пластины, содержащей тканевые держатели для изучения высвобождения моноаминов, и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическим обнаружением (ВЭЖХ-ECD) для измерения высвобождения моноамина. Вкратце, участки мозга крыс, содержащие области, представляющие интерес, включая префронтальную кору, гиппокамп и дорсальный стриатум, были получены с использованием тканевого слайсера или вибратома. Эти области, представляющие интерес, были рассечены из всего мозга и инкубированы в насыщенном кислородом физиологическом буфере. Жизнеспособность исследовали на протяжении всего экспериментального временного хода с помощью анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Остро рассеченные области мозга инкубировали в различных условиях наркотиков, которые, как известно, индуцируют высвобождение моноамина через транспортер (амфетамин) или через активацию экзоцитотического везикулярного высвобождения (KCl). После инкубации высвобождаемые продукты в супернатанте собирали и анализировали через систему ВЭЖХ-ЭТП. Здесь базальное высвобождение моноамина обнаруживается методом ВЭЖХ из острых срезов мозга. Эти данные подтверждают предыдущие результаты in vivo и in vitro, показывающие, что AMPH и KCl индуцируют высвобождение моноаминов. Этот метод особенно полезен для изучения механизмов, связанных с моноаминным транспортер-зависимым высвобождением, и дает возможность быстро и недорого экранировать соединения, влияющие на высвобождение моноаминов.
Множество неврологических и психиатрических заболеваний связано с дисрегуляцией или недостаточным поддержанием моноаминового нейромедиатора (дофамин [DA], серотонин [5-HT], норадреналин [NE]) гомеостаза1,2,3. Эти состояния включают, но не ограничиваются ими, депрессию1,2, шизофрению2, беспокойство2, зависимость4, менопаузу5,6,7, боль8
Все эксперименты, включая обращение с животными и сбор тканей, проводились в соответствии с Университетом Флориды и Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Городского колледжа Нью-Йорка (IACUC) в соответствии с утвержденными протоколами 201508873 (UF) и 1071 (CCNY). Для реагентов и буфера, пожалуйста, обратитесь к Дополнительному файлу.
1. Подготовьте острые срезы мозга крысы
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовались взрослые самцы крыс (250-350 г). Тем не менее, эта установка функциональна для различных точек развития, самок крыс и других видов. При использовании более ....
Этот метод описывает использование срезов мозга для измерения высвобождения эндогенных моноаминов с использованием ВЭЖХ с электрохимическим обнаружением на основе 48-луночной пластины с внутренним тканевым держателем. Экспериментальная установка показана на
Измерения высвобождения моноаминов проводились в течение многих лет в ряде систем, таких как гетерологичные клетки, нейронные культуры, синаптосомы мозга, острые срезы мозга ex vivo и целые животные13,20,41,42,58,64,65,66,67,68
Авторы не раскрывают информацию.
Эта работа была поддержана грантами Fondecyt Initiation Fund N 11191049 для J.A.P. и грантом NIH DA038598 для G.E.T.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
48 Well plate | NA | NA | Assay |
Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Clarity Software | Anetc | ||
Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены