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Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
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Resumo

Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.

Resumo

As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.

Introdução

As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.

Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regul....

Protocolo

1. Clonagem de genes em vetores de entrada e destino (Figura2)

  1. Amplie a sequência de codificação (CDS) dos genes de interesse (genes M e C em nosso caso) por PCR e clone-os em vetores de entrada apropriados (por exemplo, vetor pENTR/D-TOPO; ver Tabela 1 para vetores usados neste experimento).
  2. Cresça os clones em placas contendo antibióticos. Validar clones selecionados nos antibióticos por restrição de digestão e sequenciamento de DNA22,23.
  3. Mobilize os CDS reconstituídos dos clones de entrada....

Resultados

Este protocolo representa um método otimizado para estudar interações proteína-proteína in vivo tripartite nas plantas. O princípio básico do protocolo é combinar duas técnicas de interação proteica marcadas por fluorescência, ou seja, BiFC e FRET, para criar um ensaio para medir a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos. Aqui, utilizamos a FLIM para medir a vida fluorescência do parceiro doador DA FRET na presença e ausência do aceitador da FRET. Esperava-se uma redução.......

Discussão

O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema.......

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml Syringes without needlesDispovan -
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
Gateway  LR Clonase II Enzyme mixThermo Fischer Scientific11791020The vectors used in the study are Gateway based
Gentamycin SulphateHimediaCMS461
Kanamycin SulphateHimediaMB105
MES hydrateSigma-AldrichM2933
MgCl2Sigma-AldrichM2670
pENTR/D-TOPO Cloning KitThermo Fischer ScientificK240020The vectors used in the study are Gateway based
Phusion high fidelity Taq DNA polymeraseThermo Fischer ScientificF530-SAny High fidelity Polymerase can work
RifampicinHimediaCMS1889
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscopeLeicaSP8 FALCONAny CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateHimediaTC034

Referências

  1. Grove, C. A., Walhout, A. J. M. Transcription factor functionality and transcription regulatory networks. Molecular Biosystem. (4), 309-314 (2008).
  2. Amoutzias, G. D., Robertson, D. L., Van de Peer, Y., Oliver, S. G. ....

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