É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
* Estes autores contribuíram igualmente
Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.
As interações proteína-proteína são parte integrante de todos os processos biológicos das células, pois desempenham um papel crucial na regulação, manutenção e alteração das funções celulares. Essas interações estão envolvidas em uma ampla gama de fenômenos, como transdução de sinais, resposta de patógenos, interações célula-células, processos metabólicos e de desenvolvimento. No caso dos fatores de transcrição, essas interações podem levar à oligomerização de subunidades, sequestre em contextos subcelulares específicos como o núcleo, citoplasma, etc., que, por sua vez, podem ter um efeito mais profundo na expressão dos genes a jusante. Aqui, demonstramos uma metodologia para visualizar a interação tripartite in vivo usando a Complementação de Fluorescência Bimolecular (BiFC) baseada em Förster Resonance Energy Transfer (FRET) envolvendo Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Duas das proteínas selecionadas para esta demonstração interagem como parceiros do BiFC, e sua atividade de fluorescência reconstituída é usada para avaliar o FRET-FLIM com o terceiro parceiro. As plantas nicotiana benthamiana, cultivadas em quatro a cinco semanas, foram usadas como o sistema de plantas modelo para esta demonstração.
As interações proteína-proteína (PPIs) formam a base do bom funcionamento das células eucarióticas regulando vários processos metabólicos e de desenvolvimento. Alguns PPIs são estáveis, enquanto outros são transitórios na natureza. As interações podem ser categorizadas com base no número e tipo de membros na interação, como dimeric, trimeric, tetramérrico homomédico e heteromérico1. A identificação e caracterização das interações proteicas pode levar a uma melhor compreensão das funções proteicas e das redes regulatórias.
Os fatores de transcrição são proteínas que estão envolvidas em funções regulatórias. Eles regul....
1. Clonagem de genes em vetores de entrada e destino (Figura2)
Este protocolo representa um método otimizado para estudar interações proteína-proteína in vivo tripartite nas plantas. O princípio básico do protocolo é combinar duas técnicas de interação proteica marcadas por fluorescência, ou seja, BiFC e FRET, para criar um ensaio para medir a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos. Aqui, utilizamos a FLIM para medir a vida fluorescência do parceiro doador DA FRET na presença e ausência do aceitador da FRET. Esperava-se uma redução.......
O presente protocolo demonstra o uso de ensaios FRET-FLIM baseados em BiFC para verificar a formação de um complexo ternário entre dois monômeros de uma proteína de caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio. O protocolo é adaptado a partir de um relatório de Y. John Shyu et al. onde eles desenvolveram um método FRET baseado em BiFC para visualizar complexo ternário formado entre heterodimers Fos-Jun e NFAT ou p65 usando o método de emissão sensibilizado7. Anteriormente, um sistema.......
Os autores não declaram conflitos de interesse.
NB, GG, SB, KC agradecem sinceramente à Comissão de Subsídios Universitários (UGC), UGC-BSR, DBT-INSPIRE e Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR) por suas bolsas de pesquisa. Agradecemos, felizmente, o Departamento de Biotecnologia (DBT), o Governo da Índia, o Departamento de Ciência e Tecnologia (DST-FIST), o Governo da Índia pelo apoio financeiro.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 ml Syringes without needles | Dispovan | - | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Thermo Fischer Scientific | 11791020 | The vectors used in the study are Gateway based |
Gentamycin Sulphate | Himedia | CMS461 | |
Kanamycin Sulphate | Himedia | MB105 | |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Thermo Fischer Scientific | K240020 | The vectors used in the study are Gateway based |
Phusion high fidelity Taq DNA polymerase | Thermo Fischer Scientific | F530-S | Any High fidelity Polymerase can work |
Rifampicin | Himedia | CMS1889 | |
SP8 FALCON Confocal laser scanning microscope | Leica | SP8 FALCON | Any CLSM with FLIM capabilities can be used for this analysis |
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Himedia | TC034 |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados