Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

Resumo

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com ¹³C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de ¹³C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica ^{de 31}P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Resumo

O metabolismo é a base de processos importantes na vida celular. Caracterizar como as redes metabólicas funcionam nos tecidos vivos fornece informações cruciais para a compreensão do mecanismo das doenças e a concepção de tratamentos. Neste trabalho, descrevemos procedimentos e metodologias para estudar a atividade metabólica intracelular em um coração de camundongo retrógrado perfundido em tempo real. O coração foi isolado in situ, em conjunto com parada cardíaca para minimizar a isquemia miocárdica e foi perfundido dentro de um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto no espectrômetro e sob perfusão contínua, o [1-13 C]piruvato hiperpolarizado foi administrado ao coração, e as subsequentes taxas de produção de [1-13 C]lactato e [¹³C]bicarbonato hiperpolarizadas serviram para determinar, em tempo real, as taxas de produção de lactato desidrogenase e piruvato desidrogenase. Esta atividade metabólica do [^1-13C]piruvato hiperpolarizado foi quantificada com espectroscopia de RMN de forma livre usando a abordagem de aquisição de saturação seletiva de excitações do produto. ³¹ anos A espectroscopia de P foi aplicada entre as aquisições hiperpolarizadas para monitorar a energia cardíaca e o pH. Este sistema é excepcionalmente útil para estudar a atividade metabólica no coração de rato saudável e doente.

Introdução

Alterações no metabolismo cardíaco estão associadas a uma variedade de cardiomiopatias e muitas vezes formam a base dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes¹. No entanto, existem inúmeros obstáculos para estudar o metabolismo em tecidos vivos, já que a maioria dos ensaios bioquímicos requer a homogeneização do tecido e lise celular e / ou rastreamento radioativo. Portanto, há uma necessidade premente de novas ferramentas para investigar o metabolismo miocárdico em tecidos vivos. A ressonância magnética (RM) de substratos hiperpolarizados marcados com ¹³C permite medições em tempo real do metabolismo em tecidos vivos

Protocolo

O comitê conjunto de ética (IACUC) da Universidade Hebraica e do Hadassah Medical Center aprovou o protocolo de estudo para o bem-estar animal (MD-19-15827-1).

1. Preparação do tampão de Krebs-Henseleit

1. Um dia antes do experimento, prepare uma versão modificada do buffer de Krebs-Henseleit (KHB)²⁶. Inicialmente, dissolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO₃ e 1,2 mM KH 2 PO₄ em H₂O de destilação dupla.
2. Borbulhe esta mistura com 95%/5% O 2/CO 2 por 20 min e, em seguida, adicione 1,2 ....

Resultados

Os espectros ^{de 31}P registrados a partir de um coração de rato perfundido com KHB e do tampão isolado são mostrados na Figura 1A. Os sinais de α, β e γ-ATP, PCr e Pi foram observados no coração. O sinal Pi foi composto por dois componentes principais: no campo superior (lado esquerdo do sinal), o sinal Pi foi principalmente devido ao KHB a um pH de 7,4; no campo inferior (lado direito do sinal), o sinal Pi foi mais amplo e menos homogêneo devido ao ambiente mais ácido. .......

Discussão

Demonstramos uma configuração experimental projetada para investigar o metabolismo hiperpolarizado do [^1-13C]piruvato, a energia tecidual e o pH em um modelo isolado de coração de camundongo.

As etapas críticas dentro do protocolo são as seguintes: 1) garantir que o pH do tampão seja de 7,4; 2) assegurar que todos os componentes da reserva sejam incluídos; 3) evitar a coagulação do sangue nos vasos cardíacos por injeções de heparina; 4) evitar danos isquêmicos ao cora?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments	52-ZNP91000	HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer	RS2D		NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump	Cole-Parmer	07554-95
Temperature probe	Osensa	FTX-100-LUX+	NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system	Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes	Cole-Parmer	HV-96119-16	L/S 16 I.D. 3.1 mm
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines	Upchurch Scientific		id. 0.040”
Intravenous catheter	BD Medical	381323	22 G
Silk suture	Ethicon	W577H	Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-8077-1
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074	CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	CAS: 50-99-77
Heparin sodium	Rotexmedica	HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37%	Sigma-Aldrich	258148	CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog)	Novo Nordisk
Isoflurane	Terrel
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	793612	CAS: 7487-88-9
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504	CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate	Gadot Group		CAS: 144-55-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625	CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	655104	CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S7907	CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate	Merck	6345	CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade)	Amresco	0826	CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063	GE Healthcare AS	NC100136	OX063
NMR standards
13C standard sample	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-72A	40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample	Made in house		105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016	Microsoft
MNova	Mestrelab Research