Combinando Microscopia Confocal de Reflectância com Tomografia de Coerência Óptica para Diagnóstico Não Invasivo de Cânceres de Pele via Aquisição de Imagem

Resumo

Aqui, descrevemos protocolos para aquisição de imagens de boa qualidade usando novos dispositivos de imagem não invasivos de microscopia confocal de reflectância (RCM) e RCM combinado e tomografia de coerência óptica (OCT). Também familiarizamos os médicos com suas aplicações clínicas para que eles possam integrar as técnicas em fluxos de trabalho clínicos regulares para melhorar o atendimento ao paciente.

Resumo

O câncer de pele é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo. O diagnóstico baseia-se na inspeção visual e dermatoscopia seguida de biópsia para confirmação histopatológica. Embora a sensibilidade da dermatoscopia seja alta, a menor especificidade faz com que 70%-80% das biópsias sejam diagnosticadas como lesões benignas na histopatologia (falsos positivos à dermatoscopia).

A microscopia confocal por reflectância (MCR) e a tomografia de coerência óptica (OCT) podem orientar de forma não invasiva o diagnóstico de cânceres de pele. O MCR visualiza a morfologia celular nas camadas en-face . Duplicou a especificidade diagnóstica para melanoma e cânceres pigmentados de pele queratinocítica em relação à dermatoscopia, reduzindo pela metade o número de biópsias de lesões benignas. A RCM adquiriu códigos de faturação nos EUA e está agora a ser integrada nas clínicas.

No entanto, limitações como a profundidade rasa (~200 μm) dos exames de imagem, o baixo contraste para lesões cutâneas não pigmentadas e a imagem nas camadas en-face resultam em especificidade relativamente menor para a detecção de carcinoma basocelular (CBC) não pigmentado — CBCs superficiais contíguos à camada basocelular e CBCs infiltrativos mais profundos. Em contraste, a OCT não tem resolução celular, mas obtém imagens de tecido em planos verticais até uma profundidade de ~1 mm, o que permite a detecção de subtipos superficiais e profundos de CBCs. Assim, ambas as técnicas são essencialmente complementares.

Um dispositivo combinado RCM-OCT "multimodal" fotografa simultaneamente lesões cutâneas nos modos en-face e vertical. É útil para o diagnóstico e manejo dos CBCs (tratamento não cirúrgico para CBCs superficiais vs. tratamento cirúrgico para lesões mais profundas). Uma melhora acentuada na especificidade é obtida para detectar pequenos CBCs não pigmentados em relação à RCM isoladamente. Os dispositivos RCM e RCM-OCT estão trazendo uma grande mudança de paradigma no diagnóstico e manejo dos cânceres de pele; no entanto, seu uso atualmente é limitado a centros acadêmicos de atendimento terciário e algumas clínicas privadas. Este artigo familiariza os clínicos com esses dispositivos e suas aplicações, abordando as barreiras translacionais no fluxo de trabalho clínico de rotina.

Introdução

Tradicionalmente, o diagnóstico do câncer de pele depende da inspeção visual da lesão, seguida de um olhar mais atento às lesões suspeitas usando uma lente de aumento chamada dermatoscópio. O dermatoscópio fornece informações subsuperficiais que aumentam a sensibilidade e a especificidade em relação à inspeção visual para o diagnóstico de cânceres cutâneos ^1,2. No entanto, a dermatoscopia carece de detalhes celulares, muitas vezes levando a uma biópsia para confirmação histopatológica. A baixa e variável especificidade (67% a 97%) da dermatoscopia³ resulta em falsos positivos e biópsias que mostram lesões benignas na patologia. A biópsia não é apenas um procedimento invasivo que causa sangramento e dor⁴, mas também é altamente indesejável em regiões cosmeticamente sensíveis, como a face, devido a cicatrizes.

Para melhorar o atendimento ao paciente, superando as limitações existentes, muitos dispositivos de imagem in vivo não invasivos estão sendo explorados 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Os dispositivos RCM e OCT são os dois principais dispositivos ópticos não invasivos utilizados para o diagnóstico de lesões de pele, especialmente cânceres de pele. A RCM adquiriu códigos de faturamento da Terminologia Processual Atual (CPT) nos EUA e está sendo cada vez mais utilizada em centros acadêmicos de atendimento terciário e em algumas clínicas privadas ^7,8,19. RCM imagens de lesões em resolução quase histológica (celular). No entanto, as imagens estão no plano en-face (visualização de uma camada de pele por vez), e a profundidade de imagem é limitada a ~200 μm, suficiente para atingir apenas a derme superficial (papilar). A imagem RCM baseia-se no contraste de reflectância de várias estruturas na pele. A melanina confere o maior contraste, tornando as lesões pigmentadas brilhantes e fáceis de diagnosticar. Assim, a RCD associada à dermatoscopia melhorou significativamente o diagnóstico (sensibilidade de 90% e especificidade de 82%) em relação à dermatoscopia das lesões pigmentadas, incluindo o^melanoma20. No entanto, devido à ausência de contraste melanina nas lesões róseas, especialmente nos CBCs, a MCR tem menor especificidade (37,5%-75,5%)²¹. Um OCT convencional, outro dispositivo não invasivo comumente utilizado, visualiza lesões de até 1 mm de profundidade dentro da pele e as visualiza em um plano vertical (semelhante à histopatologia)⁹. No entanto, a OCT não tem resolução celular. A OCT é utilizada principalmente para o diagnóstico de lesões queratinocíticas, especialmente CBCs, mas ainda apresenta menor especificidade⁹.

Assim, para superar as limitações existentes nesses dispositivos, um dispositivo multimodal RCM-OCT foi construído²². Este dispositivo incorpora RCM e OCT dentro de uma única sonda de imagem portátil, permitindo a aquisição simultânea de imagens RCM en-face co-registradas e imagens verticais de OCT da lesão. A OCT fornece detalhes arquitetônicos das lesões e pode obter imagens mais profundas (até uma profundidade de ~1 mm) dentro da pele. Ele também tem um campo de visão maior (FOV) de ~2 mm²² em comparação com o dispositivo RCM portátil (~0,75 mm x 0,75 mm). As imagens de RCM são usadas para fornecer detalhes celulares da lesão identificada na OCT. Esse protótipo ainda não foi comercializado e está sendo utilizado como dispositivo experimental em clínicas23,24,25.

Apesar do sucesso no aprimoramento do diagnóstico e manejo dos cânceres da pele (como comprovado pela literatura), esses dispositivos ainda não são amplamente utilizados na clínica. Isso se deve, principalmente, à escassez de especialistas capazes de ler essas imagens, mas também à falta de técnicos treinados que possam adquirir imagens de qualidade diagnóstica de forma eficiente (dentro de um período de tempo clínico) à beira do leito⁸. Neste manuscrito, o objetivo é facilitar a conscientização e eventual adoção desses dispositivos nas clínicas. Para atingir esse objetivo, familiarizamos dermatologistas, dermatopatologistas e cirurgiões de Mohs com imagens de câncer de pele e pele normais adquiridas com os dispositivos RCM e RCM-OCT. Também vamos detalhar a utilidade de cada dispositivo para o diagnóstico de cânceres de pele. O foco deste manuscrito é fornecer orientações passo a passo para a aquisição de imagens com esses dispositivos, o que garantirá imagens de boa qualidade para uso clínico.

Protocolo

Todos os protocolos descritos abaixo seguem as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos da instituição.

1. Dispositivo RCM e protocolo de imagem

NOTA: Existem dois dispositivos RCM in vivo disponíveis comercialmente: RCM DE SONDA LARGA (WP-RCM) e RCM portátil (HH-RCM). O WP-RCM vem integrado com um dermatoscópio digital. Estes dois dispositivos estão disponíveis separadamente ou como uma unidade combinada. Abaixo estão os protocolos de aquisição de imagens utilizando a última geração (Geração 4) dos dispositivos WP-RCM e HH-RCM e suas indicações clínicas.

1. Seleção das lesões e indicações clínicas
   1. Procurar os seguintes tipos de lesões: dermoscopicamente rósea (CBC, carcinoma espinocelular [CEC], ceratose actínica [CA], outras lesões benignas) ou pigmentada (nevos e melanoma, lesões queratinocíticas pigmentadas); nevo recentemente alterado no exame clínico ou dermatoscópico; lesões inflamatórias para determinar padrões inflamatórios.
   2. Realizar mapeamento das margens do lentigo maligno (LM) para determinar a extensão da lesão e mapeamento e seleção de sítios de biópsia para doença com extensão subclínica, como doença de Paget extramamária (EMPD) e ML.
   3. Realizar monitoramento não invasivo do tratamento não cirúrgico, como drogas tópicas (imiquimod), radiação, terapia fotodinâmica e ablação a laser.
2. Para a seleção do dispositivo, use o dispositivo WP-RCM para lesões localizadas em superfícies relativamente planas da pele (tronco e extremidades) e o dispositivo HH-RCM para lesões em superfícies curvas (nariz, lóbulos das orelhas, pálpebras e genitália).
   NOTA: A seleção do dispositivo de imagem dependerá principalmente da localização da lesão.
3. Para exames de imagem, posicione o paciente em uma cadeira totalmente reclinável ou em uma mesa de exame plana com travesseiros ou um apoio de braço para apoio e para obter uma superfície de imagem plana.
   NOTA: Os dispositivos WP-RCM de geração mais antiga (Geração 3) levaram ~30 minutos por lesão. A obtenção de imagens de uma única lesão pode exigir ~15 minutos com o dispositivo WP-RCM de última geração (Geração 4) atualmente sendo usado em clínicas. Apesar do melhor tempo de aquisição, o posicionamento confortável do paciente garantirá o mínimo de artefatos de movimento e auxiliará na aquisição de imagens de qualidade superior. Os seguintes passos podem ajudar no posicionamento correto do paciente:
4. Para se preparar para exames de imagem, limpe a lesão e a pele circundante com um lenço com álcool para eliminar qualquer sujeira, loção ou maquiagem. Faça a barba nas superfícies pilosas da pele antes de fixar a janela de tecido para evitar bolhas de ar que possam dificultar a visualização das microestruturas teciduais.
   OBS: Para remover cosméticos pesados ou protetores solares, limpe o local com água e sabão suave antes de limpar com álcool.
5. A aquisição de imagens utilizando o dispositivo WP-RCM (Figura 1, Figura 2, Figura suplementar S1, Figura suplementar S2e Figura suplementar S3)
   NOTA: Os dispositivos WP-RCM são capazes de capturar pilhas, mosaico, vídeos ao vivo de quadro único e imagens de quadro único.
   1. Para fixar uma tampa plástica descartável à lesão (Figura 1), posicione a sonda perpendicularmente à lesão para obter as melhores imagens. Consulte a Figura 1A-F para obter um exemplo de anexo. Adicione uma gota de óleo mineral no centro da janela de plástico, espalhando-a cuidadosamente pela largura da janela (Figura 1A). Remova o suporte de papel do lado adesivo da janela de plástico. Estique a pele suavemente para evitar enrugamento e prenda a janela.
      NOTA: Use óleo mineral de grau alimentício que é seguro e tem uma alta viscosidade. Certifique-se de que a lesão esteja centrada e coberta em sua totalidade. Para lesões maiores que 8 mm x 8 mm, seja por imagem de áreas de preocupação com base na dermatoscopia ou por sessões de imagem separadas para cobrir toda a lesão.
   2. Aquisição de imagens dermatoscópicas (Figura 1C,D)
      OBS: Uma imagem dermatoscópica é adquirida para servir de guia para navegar dentro da lesão. Os passos a seguir devem ser utilizados para garantir o perfeito registro entre a imagem dermatoscópica e a imagem confocal.
      1. Passe o mouse sobre a sonda WP-RCM sobre a tampa plástica da janela e aproxime-se do melhor ângulo de inserção para a sonda (Figura 1C). Localize a pequena seta branca localizada na lateral da sonda (Figura 1C) e alinhe-a com a seta na lateral da câmera de dermatoscopia (Figura 1C).
      2. Insira a câmera de dermatoscopia na tampa plástica da janela (Figura 1D). Pressione o gatilho da câmera para adquirir uma imagem. Retire o dermatoscópio. Antes de iniciar a sessão de imagem, certifique-se de que a imagem do dermatoscópio cubra toda a superfície da lesão.
   3. Para fixar a sonda RCM à tampa plástica descartável (Figura 1E,F), coloque uma quantidade de gel de ultrassom do tamanho de uma ervilha dentro da tampa plástica descartável da janela (Figura 1E). Insira a sonda dentro da tampa até que um clique nítido seja ouvido (Figura 1F).
      NOTA: Para obter as melhores imagens, insira a sonda perpendicularmente (em um ângulo de 90°) à janela de plástico. A altura da cadeira de exame pode ser elevada para obter uma superfície mais plana, reduzir artefatos de movimento, expelir bolhas de ar (Figura 3 e Figura 4) e garantir uma fixação segura à pele.
   4. Aquisição de imagens RCM (Figura 2, Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2)
      1. Utilizar a imagem dermatoscópica (passo 5.2.) para guiar a aquisição da imagem do MMC (Figura Suplementar S1). Selecione o centro da lesão e identifique a camada mais alta (mais brilhante) da pele — a camada anucleada do estrato córneo (Figura Suplementar S1).
      2. Defina a profundidade de imagem para zero nesse nível (Figura Suplementar S1).
         NOTA: Esta profundidade serve como um ponto de referência para determinar a real profundidade z das camadas subsequentes dentro da lesão.
      3. Adquira uma pilha no centro da lesão (Figura 2 e Figura Suplementar S1) pressionando o ícone da pilha . Selecione um site anatômico no menu suspenso: rosto ou corpo. Ajuste de 4,5 μm de tamanho de passo e 250 μm de profundidade.
         NOTA: Comece as pilhas a partir do estrato córneo e termine nas camadas mais profundas visíveis na derme. A Figura suplementar S1 mostra um exemplo de como adquirir uma pilha, enquanto a Figura 2 fornece um exemplo de uma pilha.
      4. Adquira um mosaico: pegue o primeiro mosaico na junção dermoepidérmica (JDE) (Figura Suplementar S2). Identifique a camada de DEJ na pilha adquirida e, em seguida, use o mouse para selecionar um quadrado de 8 mm x 8 mm para cobrir toda a lesão. Pressione o ícone de mosaico para concluir a operação (Figura suplementar S2). Adquira pelo menos 5 mosaicos em várias profundidades: estrato córneo, estrato espinhoso, camada suprabasal, JDE e derme papilar superficial.
      5. Abra o mosaico DEJ para orientar a aquisição dos mosaicos subsequentes. Clique em qualquer estrutura no mosaico DEJ para exibir essa área na visualização ao vivo da imagem. Role para baixo para adquirir mosaicos na derme e depois para cima (do DEJ) para tirar mosaicos na epiderme.
      6. Obtenha os mosaicos adquiridos avaliados pelo leitor especialista em RCM presente à beira do leito para identificar a região de interesse e levar pilhas. Na ausência de um especialista à beira do leito, capturar 5 pilhas: uma em cada quadrante e outra no centro da lesão com padrão homogêneo à dermatoscopia (passos 1.5.2.). Para lesões heterogêneas, adquirir pilhas adicionais para cobrir todas as características da dermatoscopia.
         NOTA: Uma "pilha" (Figura 2) é uma coleção sequencial de imagens de alta resolução, de quadro único e pequeno campo de visão (FOV) (0,5mm x 0,5 mm) adquiridas em profundidade a partir da camada mais superior da epiderme até a derme superficial (~200 μm). Um "mosaico" (Figura Suplementar S2) é um grande FOV de imagens obtidas pela costura de imagens individuais de 500 μm x 500 μm em "X-Y" (plano horizontal en face ).
   5. Concluindo uma sessão de geração de imagens
      1. Clique em Imagens concluídas.
      2. Retire o microscópio da janela de plástico. Remova a janela de plástico segurando suavemente a pele do paciente e elimine-a. Limpe o óleo da pele com um cotonete com álcool.
      3. Desconecte o cone protetor ao redor da lente do microscópio. Limpe a ponta da lente objetiva com um cotonete de álcool para remover o gel de ultrassom. Seque a lente objetiva com um papel toalha. Reconecte o cone de plástico à sonda do microscópio.
         NOTA: As imagens podem ser lidas e um relatório pode ser gerado e assinado à beira do leito por um médico treinado. Na ausência de um leitor especialista, um especialista remoto pode ser consultado transferindo as imagens via nuvem ou por meio de uma sessão teleconfocal ao vivo²⁶.
   6. Gerando um relatório de Avaliação Diagnóstica Confocal (Figura Suplementar S3)
      1. Clique em Nova Avaliação. Insira o diagnóstico nas opções pré-selecionadas no menu suspenso.
      2. Se outra sessão de imagem for necessária, selecione as imagens inadequadas e que precisam ser recapturadas. Se um diagnóstico descritivo for necessário, selecione outro e descreva na caixa de texto livre no final do formulário. Insira o código CPT para faturamento⁷ (Figura Suplementar S3A). Selecione os recursos aplicáveis vistos durante a geração de imagens na lista de verificação do relatório (Figura Suplementar S3B). Selecione o gerenciamento aplicável na lista de verificação.
         NOTA: Nenhum código de faturamento é aplicável para imagens HH-RCM.
      3. Clique em Concluir e assinar. Gere o relatório como PDF e imprima. Obtenha o laudo assinado por um médico e adicione-o ao prontuário do paciente para faturamento.
6. Aquisição das imagens utilizando o aparelho HH-RCM (Figura 5)
   NOTA: Os dispositivos HH-RCM são capazes de capturar pilhas, vídeos ao vivo de quadro único e imagens de quadro único.
   1. Circunde a lesão identificada pelo médico com um anel de papel. Use as etapas detalhadas na seção 3. para posicionamento do paciente e limpeza do local da lesão.
      NOTA: Selecione o tamanho do anel de papel (5-15 mm) com base no tamanho da lesão para definir o limite da lesão e garantir que a imagem seja feita dentro da lesão. Se um anel de papel não estiver disponível, use fita adesiva para definir a lesão.
   2. Remova a tampa plástica que cobre a lente do microscópio. Aplique uma quantidade de gel de ultrassom do tamanho de uma ervilha na lente objetiva do HH-RCM e cubra-a com a tampa plástica (Figura Suplementar S3A). Adicione uma gota generosa de óleo mineral ao lado da tampa plástica que estará tocando a pele.
      NOTA: Aumentar a quantidade de óleo para pele muito seca, se necessário.
   3. Pressione a sonda até o local da lesão na pele com pressão firme. Use os controles de profundidade z no dispositivo HH-RCM para se mover para cima e para baixo em várias profundidades dentro da lesão (Figura Suplementar S3B). Adquira várias imagens de quadro único e pilhas nas regiões de interesse. Pegue pilhas conforme descrito na etapa 1.5.4.3.
   4. Para lesões grandes onde o dispositivo WP-RCM não pode ser fixado, faça vídeos contínuos em várias camadas movendo a sonda HH-RCM sobre toda a superfície da lesão. Clique no símbolo de captura de vídeo para fazer isso. Registre o movimento das células sanguíneas dentro dos vasos, se necessário.
      NOTA: Esses vídeos podem ser costurados posteriormente usando software para fornecer imagens FOV grandes semelhantes a mosaicos.
   5. Pressione Done Imaging após a conclusão da sessão de geração de imagens. Limpe a lesão com um cotonete de álcool para remover o óleo. Retire o gel de ultrassom da lente objetiva da sonda limpando-o com um lenço de álcool e reconectando a tampa plástica.
      NOTA: Ao contrário do dispositivo WP-RCM, que pode ser operado por um técnico, o HH-RCM deve ser operado por um leitor RCM que possa interpretar imagens em tempo real para navegar dentro da lesão e chegar a um diagnóstico correto.

2. Dispositivo combinado RCM-OCT e protocolo de imagem

NOTA: Existe apenas um protótipo do dispositivo RCM-OCT. Este dispositivo tem uma sonda portátil e pode ser usado em todas as superfícies do corpo, semelhante ao dispositivo HH-RCM. Ele adquire pilhas RCM (semelhante ao dispositivo RCM) e rasters OCT (um vídeo de imagens sequenciais e transversais²²). As imagens RCM e OCT estão em escala de cinza. As imagens RCM têm um FOV de ~200 μm x 200 μm, enquanto a imagem OCT tem um FOV de 2 mm (em largura) x 1 mm (em profundidade). A seguir, o protocolo de aquisição das imagens com o aparelho RCM-OCT, bem como suas indicações clínicas. A Figura 6 mostra uma imagem do dispositivo RCM-OCT, enquanto a Figura 7 mostra o sistema de software do dispositivo RCM-OCT.

1. Seleção das lesões
   1. Procure lesão dermoscopicamente equivocada rósea ou pigmentada para descartar CBC.
   2. Avaliar a profundidade do CBC para manejo e avaliar o CBC residual após o tratamento.
2. Posicionamento do paciente para exames de imagem: A obtenção de imagens de uma única lesão pode exigir até 20 minutos com o dispositivo RCM-OCT. O dispositivo também é uma sonda portátil semelhante ao dispositivo HH-RCM e, portanto, pode ser movido livremente sobre a lesão. Para detalhes sobre o posicionamento do paciente, consulte a seção 1.4. acima.
3. Preparo do local para exames de imagem: Ao usar esta sonda, certifique-se de que o limite da lesão esteja livre de pelos excessivos e impurezas tópicas e esteja claramente definido. Consulte a etapa 1.4.1. acima para mais detalhes.
4. Aquisição de imagens utilizando o aparelho RCM-OCT (Figura 6 e Figura 7)
   1. Prepare a sonda de forma semelhante à utilizada para o HH-RCM (passos 1.6.1-1.6.2.)
   2. Adquira imagens no modo de imagem de linha e no modo raster .
      1. Clique nas configurações de imagem (Figura 7A). Selecione o modo de imagem de linha para adquirir uma imagem RCM (resolução celular) (Figura 7B). Defina o tamanho do passo para 5 μm e o número de passos para 40 (Figura 7A).
      2. Clique em Agarrar. Adquira pilhas seguindo a etapa 1.5.4.3. Depois de concluído, clique no botão Congelar .
      3. Clique em configurações de imagem. Selecione o modo raster para adquirir um vídeo correlativo da OCT para a arquitetura da lesão (Figura 7B). Alterne para a guia técnico (Figura 7C). Depois de concluído, clique no botão Grab (Figura 7A) e pressione imediatamente o botão salvar .
      4. Adquira várias pilhas e vídeos com base no interesse do médico.
      5. Limpar a lesão e a máquina conforme descrito no passo 1.6.5.

Resultados

Microscopia confocal de reflectância (RCM)
Interpretação de imagem em RCM:
As imagens de RCM são interpretadas de forma a mimetizar a avaliação das lâminas histopatológicas. Os mosaicos são avaliados primeiro para obter o detalhe arquitetônico geral e identificar áreas de preocupação, semelhante à avaliação de seções histológicas na ampliação da varredura (2x). Segue-se o zoom no mosaico para avaliação dos detalhes celulares, semelhante à avaliação de lâm...

Discussão

Neste artigo, descrevemos protocolos para aquisição de imagens utilizando dispositivos in vivo de RCM e RCM-OCT. Atualmente, existem dois dispositivos RCM disponíveis comercialmente: um dispositivo de RCM (WP-RCM) de sonda larga ou montado no braço e um dispositivo RCM (HH-RCM) portátil. É crucial entender quando usar esses dispositivos em ambientes clínicos. O tipo e a localização do câncer são os principais fatores que determinam a seleção do dispositivo.

O dispositivo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystal Plus 500FG mineral oil	STE Oil Company, Inc.		A food grade, high viscous mineral oil used with our various devices during in vivo imaging.
RCM-OCT	Physical Science Inc.	-	A “multi-modal” combined RCM-OCT device simultaneously images skin lesions in both horizonal and vertical modes.
Vivascope 1500	Caliber I.D.	-	A wide-probe RCM (WP-RCM) device that attaches to the skin to campture in vivo devices.
Vivascope 3000	Caliber I.D.	-	A hand-held RCM (HH-RCM) device that is moved across the skin to capture in vivo images.