Caracterização da cicatrização de feridas epiteliais in vivo utilizando o organismo modelo cnidário Clytia hemisphaerica

Resumo

Este trabalho descreve um método para criar feridas no epitélio de uma Clytia hemisphaerica medusa viva e obter imagens de cicatrização de feridas em alta resolução in vivo. Adicionalmente, uma técnica para introduzir corantes e drogas para perturbar processos de sinalização nas células epiteliais e matriz extracelular durante a cicatrização de feridas é apresentada.

Resumo

Todos os órgãos dos animais, da pele aos olhos e intestinos, são cobertos com folhas de células epiteliais que lhes permitem manter a homeostase, protegendo-os de infecções. Portanto, não é surpreendente que a capacidade de reparar feridas epiteliais seja crítica para todos os metazoários. A cicatrização de feridas epiteliais em vertebrados envolve processos de sobreposição, incluindo respostas inflamatórias, vascularização e reepitelização. A regulação desses processos envolve interações complexas entre células epiteliais, células vizinhas e matriz extracelular (MEC); a MEC contém proteínas estruturais, proteínas reguladoras e pequenas moléculas ativas. Essa complexidade, aliada ao fato de a maioria dos animais possuir tecidos opacos e MEC inacessíveis, dificulta o estudo da cicatrização de feridas em animais vivos. Muitos trabalhos sobre cicatrização de feridas epiteliais são, portanto, realizados em sistemas de cultura de tecidos, com um único tipo de célula epitelial plaqueado como uma monocamada sobre uma matriz artificial. Clytia hemisphaerica (Clytia) fornece um complemento único e emocionante a esses estudos, permitindo que a cicatrização de feridas epiteliais seja estudada em um animal intacto com uma autêntica MEC. O epitélio ectodérmico de Clytia é uma camada única de grandes células epiteliais escamosas, permitindo imagens de alta resolução usando microscopia de contraste interferente diferencial (CIVD) em animais vivos. A ausência de fibroblastos migratórios, vasculatura ou respostas inflamatórias permite dissecar os eventos críticos na reepitelização in vivo. A cicatrização de vários tipos de feridas pode ser analisada, incluindo microferidas unicelulares, feridas epiteliais pequenas e grandes e feridas que danificam a membrana basal. Formação de lamelipodes, contração de cordas em bolsa, alongamento celular e migração celular coletiva podem ser observados neste sistema. Além disso, agentes farmacológicos podem ser introduzidos via MEC para modificar interações célula:MEC e processos celulares in vivo. Este trabalho mostra métodos para criar feridas em Clytia vivo, capturar filmes de cicatrização e sondar mecanismos de cicatrização por microinjeção de reagentes na MEC.

Introdução

Folhas de células epiteliais cobrem a superfície externa de todos os metazoários, revestem os órgãos internos e dividem o corpo animal em compartimentos discretos. O epitélio também separa o corpo interno do ambiente externo e o protege de danos e infecções. Assim, o advento das camadas epiteliais foi parte essencial da evolução dos animais multicelulares, e as camadas epiteliais são vistas em todos os animais, desde vertebrados até os metazoários mais^basais1. O epitélio de alguns órgãos é uma única monocamada, como nos sacos aéreos pulmonares, vasos sanguíneos e intestino², bem como na epiderme de invertebrados como planários e cnidários³. Em outros tecidos, como a pele⁴ e córnea⁵ de vertebrados, o epitélio é estratificado, ou seja, há múltiplas camadas de células epiteliais². Em todos os casos, a camada epitelial mais basal está afixada à membrana basal, uma folha proteica que forma uma região especializada da matriz extracelular (MEC)^6,7,8.

Rupturas no epitélio devem ser rapidamente reparadas para recriar uma lâmina epitelial contínua. O dano ao epitélio ocorre durante processos naturais, como a eliminação de células epiteliais no ^{intestino9,10} e como resultado de inflamação ou trauma físico. Quando uma única célula epitelial é lesada, ela deve reparar-se ou ser eliminada para permitir que as células vizinhas se fixem umas às outras e fechem o orifício^11,12. Em feridas maiores que o tamanho de uma única célula, as células epiteliais devem se mover para alcançar umas às outras e reparar a lâmina¹³. Isso pode ser conseguido por espalhamento celular se as lacunas forem pequenas ou podem exigir a migração de células epiteliais das margens de uma ferida para fechar a lacuna da ferida; este último processo é chamado de reepitelização^14,15. Nos tecidos embrionários, as células epiteliais se espalham e migram para o fechamento de feridas ou são tracionadas através da lacuna pela contração dos cabos de actomiosina que se formam entre as células na margem da ferida, em um mecanismo semelhante a um cordão em bolsa¹⁶. Em muitos tecidos adultos, a reepitelização envolve a migração de lâminas celulares coerentes, onde as células mantêm suas junções com as células vizinhas14,17,18. Em outros tecidos, as conexões célula:célula são desmontadas e as células epiteliais comportam-se mais como células mesenquimais, movendo-se de forma coordenada, porém independente, para a região da ferida durante a reepitelização 14,19,20,21.

Os movimentos das células epiteliais são regulados por interações complexas entre as células em migração e entre as células e a MEC. Embora haja uma enorme quantidade de literatura experimental abordando mecanismos de ativação de células epiteliais e subsequente migração, muito ainda precisa ser descoberto. Por exemplo, o sinal inicial que ativa as células epiteliais para migrar em resposta a uma ferida não foi definitivamente identificado 22, nem é completamente compreendido como a actina é reimplantada para criar lamelípodes no lado das células epiteliais mais próximas da ferida 22,23,24,25,26,27. A migração celular coletiva requer que as informações das células da ferida sejam compartilhadas com as células distais à ferida, e a via de comunicação ainda não está^clara28. As junções célula:célula e os anexos célula:ECM devem ser desmontados e reformados à medida que as células da folha se rearranjam, mas a regulação desse processo é pouco compreendida^14,29. Avançar nessas e em outras questões relacionadas não é apenas importante como um problema biológico fundamental, mas também devido à importância clínica da cicatrização correta de feridas. Doenças que comprometem a capacidade das células epiteliais de migrar corretamente resultam em feridas crônicas; um exemplo é a doença genética epidermólise bolhosa, onde genes envolvidos na ligação das células epiteliais à MEC sofrem mutações, resultando em pele frágil que descasca e emperra. A reepitelização também está comprometida nos tecidos naturalmente envelhecidos^30,31. Uma melhor compreensão é, portanto, essencial para o desenvolvimento de intervenções que melhorem os resultados da cicatrização de feridas.

A migração de células epiteliais na cicatrização de feridas tem sido estudada tanto por abordagens in vitro quanto por organismos modelo. A maioria dos estudos sobre cicatrização de feridas e mecanismos de migração celular tem sido realizada em cultura de tecidos, onde monocamadas de um único tipo de célula epitelial são cultivadas sobre substrato que substitui a MEC. As monocamadas celulares são riscadas ou cultivadas com estênceis para criar lacunas de formas e tamanhos específicos e então observadas^32,33,34. O modelo in vitro permite uma visualização ideal do comportamento celular, bem como a oportunidade de alterar qualidades do substrato, expor células a fármacos e fatores abióticos e bióticos e transfectar células com construtos que expressam ou suprimem vários genes de interesse. No entanto, essa abordagem reducionista pode falhar em capturar alguns dos parâmetros importantes envolvidos no comportamento das células epiteliais em um contexto in vivo, incluindo a comunicação entre vários tipos celulares e eventos de sinalização que ocorrem na MEC¹¹. Os modelos in vivo fornecem o contexto autêntico de uma ferida, com vários tipos de células, vias de sinalização sobrepostas e uma ECM complexa³⁵. Um desses modelos para estudos de cicatrização de feridas é o camundongo¹⁹, no qual avanços recentes permitiram aos pesquisadores observar células epidérmicas durante a cicatrização de feridas de espessura total em animais vivos³⁶. No entanto, o camundongo e outros sistemas in vivo apresentam desafios para o estudo da reepitelização. Em primeiro lugar, a grande vantagem de observar o comportamento celular em um contexto natural é equilibrada pela complexidade dos eventos de sobreposição temporal que ocorrem durante a cicatrização de feridas de vertebrados, incluindo coagulação sanguínea, recrutamento de células imunes e inflamação, recrutamento de fibroblastos e desdiferenciação celular, revascularização e remodelamento da MEC. Além disso, tecidos opacos dificultam a obtenção de imagens. Os sistemas de epiderme de larvas de Drosophila e Zebrafish ^37,38 têm superado algumas dessas dificuldades devido à sua relativa simplicidade³⁹.

Recentemente, nosso laboratório introduziu um novo modelo para o estudo da cicatrização de feridas epiteliais: a forma medusa (água-viva) do cnidário hidrozoário Clytia hemisphaerica (Clytia)⁴⁰. Clytia é um organismo modelo emergente com genoma⁴¹ totalmente sequenciado e anotado, transcriptoma RNAseq⁴² de célula única e protocolos para modificação do genoma (mutagênese e transgênese)^43,44,45. Os cnidários são uma das linhagens mais antigas existentes a ter camadas epiteliais, portanto, a compreensão da cicatrização de feridas cnidárias fornece informações sobre as vias ancestrais que garantiram a integridade epitelial. Para aquelas vias que foram conservadas ao longo da árvore da vida, Clytia oferece um novo sistema emocionante para estudar a dinâmica das células epiteliais e a regulação funcional da cicatrização de feridas in vivo.

O epitélio que recobre a superfície superior da Clytia medusa (exumbrella) é uma monocamada de células epiteliais escamosas transparentes com aproximadamente 50 μm de largura por 1-2 μm de espessura (Figura 1). Eles estão ligados a uma ECM chamada mesoglea – a "água-viva" das águas-vivas. A mesoglea é composicionalmente semelhante à MEC encontrada em outros animais 46,47,48 incluindo vertebrados^, possui membrana basal ⁴⁰ e é completamente transparente. A camada epitelial na Clytia medusa pode ser facilmente arranhada ou ferida (veja abaixo). A simplicidade e transparência do epitélio e da MEC permite imagens de alta resolução das células e seus movimentos durante a cicatrização. Recentemente, Kamran e col. caracterizaram detalhadamente a cicatrização de pequenas feridas no epitélio de Clytia40. Foi demonstrado que a cicatrização em Clytia ocorre através do rastreamento celular baseado em lamellipodia, disseminação celular e migração celular coletiva, bem como fechamento de cordas em bolsa, que é mais típico de sistemas embrionários (embora visto anteriormente em estruturas animais adultas, como a córnea⁴⁹). A cicatrização de feridas por Clytia é extremamente rápida, assim como em outros sistemas que carecem de resposta inflamatória^40,50. A cicatrização no ex-guarda-chuva de Clytia é completamente dependente dos movimentos das células epiteliais existentes — nenhuma célula prolifera ou migra através da MEC para o local da ferida (Supplemental Movie 1). Todos estes achados sugerem que o Clytia é um sistema modelo útil para estudar a cicatrização de feridas epiteliais. De fato, a facilidade de obtenção de imagens de células epiteliais em Clytia durante a cicatrização de feridas levou à descoberta de que as lamelípodas de células epiteliais se estendem e se espalham por áreas de MEC expostas, desde que haja uma membrana basal intacta; Se a membrana basal estiver danificada, a cicatrização epitelial muda para um mecanismo de corda em bolsa⁴⁰. Esta foi a primeira demonstração de um mecanismo subjacente à decisão de fechar por rastreamento à base de lamellipodia versus fechamento de corda de bolsa, destacando a importância de interações célula:ECM específicas na cicatrização e na observação de células em seu contexto natural.

Abaixo, são descritos protocolos para criação e imagem de microferidas unicelulares, pequenas feridas que se fecham principalmente por disseminação celular e grandes feridas que requerem migração celular coletiva para fechar. Além disso, é descrito um protocolo para a introdução de pequenas moléculas na MEC e células epiteliais, permitindo perturbações experimentais de possíveis vias regulatórias de cicatrização de feridas.

Protocolo

1. Cultura animal

1. Manter colônias de pólipos de Clytia em lâminas de microscópio e medusas em água do mar artificial (ASW) a 18 °C em um sistema de peixe-zebra, com tanques de peixe-zebra de 2 L para colônias de pólipos e tanques de pseudo-kreisel de 5 L feitos sob medida para medusas (Figura Suplementar 1)⁵¹. O ASW consiste em 4% de Oceano Instantâneo em H₂O deionizado (DI).
2. Alimentar os animais diariamente com artemia de 2-3 dias de idade, conforme descrito⁵¹.
   NOTA: A imagem de cicatrização de feridas é mais fácil se os animais não tiverem sido alimentados recentemente, pois há menos detritos liberados do intestino para o campo de visão.
3. Coletar medusas bebês das colônias de pólipos estabelecidas, conforme necessário, colocando colônias em um copo de 2 L preenchido com 1 L de ASW durante a noite. Use medusas fêmeas de 2-3 semanas de idade para todos os experimentos de cicatrização de feridas. A propagação de Clytia foi descrita em detalhes em outras publicações⁵¹.

2. Ferimento

1. Criação de microferidas dentro e entre células (20-500 μm²)
   1. Crie uma pipeta de transferência modificada cortando a ponta com tesoura para fazer uma abertura maior (0,5-0,7 cm de diâmetro).
      OBS: A abertura na pipeta deve ser larga o suficiente para evitar qualquer dano ao animal.
   2. Usando a pipeta de transferência modificada, coloque a medusa em uma lâmina de depressão com o ex-guarda-chuva de medusa voltado para cima, com apenas ASW suficiente para cobrir o animal.
   3. Coloque uma tampa sobre o animal e a imagem imediatamente (veja abaixo a descrição das imagens). O lamínulo comprime a mesoglea, e o rebote do tecido comprimido cria uma força que afasta ligeiramente as células⁵². Isso aparece imediatamente como lacunas entre cada célula e dano dentro de algumas células (Figura 1B,B', Figura 2 e Figura 3A-C).
2. Criação de pequenas feridas epiteliais (0,02-0,125 mm²)
   1. Usando uma pipeta de transferência modificada (como acima), coloque a medusa em uma lâmina de depressão com o ex-guarda-chuva da medusa voltado para cima.
   2. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, risque suavemente a superfície da medusa. Arranhões suaves também podem criar rasgos na membrana basal, que são prontamente aparentes²². Cubra o animal com uma lamínula para obtenção de imagens. Alternativamente, a colocação da lamínula às vezes é suficiente para criar pequenas feridas epiteliais mesmo sem coçar (Figura 1C,C', Figura 2 e Figura 3A-C).
      NOTA: Não pressione para baixo ao riscar a superfície da medusa, pois isso danifica a MEC e cria uma superfície irregular — as células epiteliais que migram em uma superfície irregular são mais difíceis de manter em foco.
3. Criação de grandes feridas epiteliais (0,5-0,9 mm²)
   1. Efectuar uma agulha de microinjeção utilizando um extrator de micropipeta e um tubo capilar de vidro (passo 5.2). Coloque a agulha de microinjeção vazia em um suporte de microinjetor afixado a um micromanipulador. Corte a ponta da agulha de modo que a abertura seja de aproximadamente 20-40 μm.
      NOTA: Agulhas cortadas para grandes feridas epiteliais podem ser armazenadas e reutilizadas para aumentar a consistência entre os experimentos.
   2. Ajuste a pressão de retenção no microinjetor para zero e ajuste a pressão de ejeção para aproximadamente 20 PSI. Ajuste o microinjetor para fornecer um pulso de ar de 2 s.
      NOTA: A pressão de ejeção pode precisar ser ajustada com base no diâmetro da abertura da agulha (ou seja, pontas menores usarão pressão mais alta, enquanto pontas maiores usarão pressão mais baixa).
   3. Coloque a medusa com o ex-guarda-chuva virado para cima em uma lâmina de depressão no palco de um escopo dissecante, com apenas ASW suficiente para cobrir o animal. Usando o micromanipulador, ajuste a ponta da agulha de microinjeção para que fique logo acima da água. Para fazer isso, mergulhe cuidadosamente a ponta na água (a água pode entrar na ponta da pipeta), depois a retraia para que fique perto da superfície epitelial da medusa.
      OBS: A ponta deve ser posicionada sobre um quadrante da medusa. Os canais radiais da medusa dividem o sino da medusa em quatro quadrantes distintos. Direcionar um quadrante resultará em imagens mais limpas, pois as gônadas e os canais radiais são excluídos da área da ferida.
   4. Pulse o ar pressionando start no injetor. Repita o pulso no mesmo local de duas a quatro vezes, dependendo da largura da ponta. Ponteiras maiores exigem menos pulsos.
      NOTA: Um recuo na água/medusa causado pelo pulso de ar deve ser visível.
   5. Cobrir o animal ferido com uma lamínula para obtenção de imagens de grandes feridas (Figura 1D,D').
   6. Siga os passos abaixo (secção 3) para obter imagens da cicatrização de feridas epiteliais.

Figura 1: Camada epitelial ex-guarda-chuva íntegra e ferida em Clytia medusa. (A) Desenho animado do corpo de Clytia medusa. (A') Epitélio ex-guarda-chuva de medusa intacto visto de cima. (B) Desenho animado de microferidas unicelulares (formas irregulares vermelhas) com células epiteliais em azul. (B') Microferidas unicelulares. (C) Desenho animado de uma pequena ferida epitelial (forma irregular vermelha). (C') Ferida epitelial pequena. (D) Desenho animado de uma grande ferida epitelial (forma irregular vermelha). (D') Grande ferida epitelial. Todas as imagens foram obtidas por microscopia CIVD. Barras de escala em (A'-C'): 50 μm. Barra de escala em (D'): 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Feridas de múltiplos tamanhos e membrana basal danificada. Uma pequena ferida epitelial ex-guarda-chuva típica é mostrada, com rótulos indicando lamelípodes que se formam a partir de células marginais. Além disso, microferidas dentro e entre as células epiteliais são observadas. Observe a pequena ruptura da membrana basal na porção superior da ferida. O filme 4 mostra a cura dessa ferida. Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Imagem da cicatrização de feridas epiteliais

1. Certifique-se de que o microscópio foi alinhado para a iluminação Köhler⁵³ e de que foi configurado corretamente para microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC)⁵⁴. As células epiteliais são quase invisíveis com óptica padrão (Figura 3D,E).
2. Ajuste o foco para o exumbrella. Embora esta seja uma camada fina, as células hexagonais devem ser claras.
   NOTA: O ex-guarda-chuva e o subguarda-chuva são separados por uma mesoglea espessa que é suportada por fibras verticais. As células sub-guarda-chuva estão no mesmo plano focal que os canais radiais. Se inicialmente focado na camada subumbrellar, então ajuste o foco lentamente através da mesoglea e fibras verticais até encontrar o exumbrella.
3. Identifique manualmente uma ferida na imagem. Para feridas grandes, use uma objetiva de 10x. Para feridas menores e unicelulares, utilizar objetiva de 20x.
4. Inicie um programa que colete imagens como um filme em tempo real ou que colete uma série de imagens em intervalos regulares. Monitore o progresso para garantir que a área da ferida não saia do campo de visão e que as células de interesse permaneçam em foco.
   1. Feridas unicelulares fecham dentro de um minuto; portanto, imagine seu encerramento com um filme.
   2. Para capturar detalhes da dinâmica celular de pequenas feridas, colete imagens aproximadamente a cada 10 s. O fechamento de pequenas feridas leva 20-50 min, dependendo do tamanho.
   3. Não fotografe as lâminas não seladas por mais de 45 min, pois a evaporação da água da lâmina ao longo do tempo leva à morte do animal e à ruptura das células.
   4. Para uma observação mais longa, sele ao redor da lamínula com vaselina para reduzir a evaporação.
      NOTA: Algumas medusas podem pulsar na lâmina, o que interfere com a imagem. Neste caso, a montagem dos animais em uma diluição de 1:10 de metanossulfonato de etila 3-aminobenzoato de 1% (Tricaína), ajustada para pH 7,5, em ASW serve como um anestésico eficaz e não tem efeito aparente na cicatrização em um período de tempo de 1 h. No entanto, os animais morrerão se deixados por várias horas em Tricaine.

Figura 3: Criação de uma pequena ferida no epitélio ex-guarda-volume. (A) Coçar suavemente o ex-guarda-chuva com uma ponta de pipeta de 200 μL para criar uma pequena ferida epitelial. (B) A colocação da lamínula às vezes é suficiente para criar pequenas feridas epiteliais. (C) Medusa montada sobre uma lâmina de depressão. (D ) Imagem de ferida epitelial pequena sem óptica DIC e (E) com óptica DIC. Barras de escala: 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise

1. Preparando arquivos de imagem
   NOTA: Para processar os arquivos de imagem, use FIJI/ImageJ com plug-ins BioFormat atualizados.
   1. Defina a escala para a proporção correta de pixels por mícron antes de registrar a pilha de imagens; Analise > Definir Escala. Isso é necessário para extrair medições de tamanho real em análises a jusante.
   2. Muitas vezes, o animal flutua ligeiramente na lâmina do microscópio; portanto, para eliminar a deriva em filmes, registre as imagens usando o alinhamento de pilha linear do plugin FIJI com SIFT. Plugins > Registro > Alinhamento de Pilha Linear com SIFT.
   3. Salve a pilha registrada como um arquivo .avi. Arquivo > Salvar como > AVI... No pop-up, defina a taxa de quadros (as figuras animadas aqui são definidas como 10 fps) e clique em OK. Use essa saída para realizar a análise da cicatrização de feridas.
2. Análise da área da ferida
   1. Usando a ferramenta de laço em FIJI/ImageJ, contorne a ferida traçando as bordas celulares. Meça a área da ferida que acabou de ser delineada com Command+M ou CTRL+M.
   2. Repita a medição da área da ferida a cada 10 quadros. As medidas do FIJI/ImageJ podem então ser plotadas usando o Prism 9 (Figura 4).

Figura 4: Análise da área da ferida em feridas epiteliais pequenas. (A ) Exemplo de cicatrização de feridas epiteliais pequenas acima de 10 min. (B) Exemplo de cicatrização de feridas epiteliais diferentes ao longo de 21 min. Os contornos roxos em A,B são comparáveis às medidas de áreas de feridas usando a ferramenta de laço em FIJI/ImageJ. (C) Redução normalizada da área da ferida ao longo do tempo em A. (D) Redução normalizada da área da ferida ao longo do tempo em B. (E) Redução média da área da ferida ao longo do tempo para 14 feridas pequenas. n = 14. Barras de erro centradas em torno da média ± MEV. Barras de escala: 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Injeções mesogleais

1. Criando placa de injeção
   1. Preparar polidimetilsiloxano (PDMS) combinando uma base PDMS e um agente de cura, em uma proporção de 10 partes de base para 1 parte de agente de cura por peso. Mexa vigorosamente para misturar totalmente a base e o agente de cura.
   2. Para remover as bolhas, coloque a mistura em uma câmara de vácuo por 15 min. Despeje a mistura em uma placa de Petri de 60 mm com tampas de tubo de microcentrífuga para manter o molde no lugar. Coloque imediatamente o molde sobre tampas de tubo em uma inclinação de 45° e fita no lugar. O molde é de três lâminas de vidro offset empilhadas coladas para criar sulcos na placa de injeção final.
   3. Coloque todo o prato, a forma e a mistura em um forno a 60 °C por 2 h para curar o elastômero. Retire o molde para uma placa de injeção completa.
2. Tração de micropipetas
   1. Usando um puxador de microeletrodos, projete um programa de tração. Use um programa de uma etapa com alta velocidade. O calor é aproximadamente o resultado do teste de RAMP^{de vidro 55,56}. Verifique se há micropipetas longas e consistentes nas micropipetas.
      NOTA: Use capilares de borossilicato de vidro de parede fina com diâmetro externo de 1,0 mm, diâmetro interno de 0,75 mm e comprimento de 10 cm.
3. Injeção de corantes e drogas
   1. Faça uma agulha de microinjeção (como acima).
   2. Encha novamente a agulha de microinjeção usando uma ponta de pipeta longa com um volume excessivo de corante ou droga para injeção na medusa.
      NOTA: Para Clytia, dimetil sulfóxido (DMSO) deve ser mantido em uma diluição de <1:100 com ASW, pois concentrações mais altas de DMSO impedem a cicatrização de feridas. Se injetar uma solução límpida, a solução Fast Green FCF (diluição 1:100 de 0,1% Fast Green FCF em ASW) pode ser adicionada para visualizar o líquido injetado.
   3. Usando uma pipeta de transferência modificada como acima, coloque uma medusa com o subguarda-chuva voltado para cima em uma placa de injeção de PDMS com ASW suficiente para cobrir o animal (Figura 5C). Coloque o prato no palco de um escopo dissecante.
      NOTA: Limitar o excesso de ASW impede que a medusa nade no prato e permite injeções mais bem-sucedidas.
   4. Concentre-se na ponta da agulha de microinjeção e avance-a para a água perto da medusa. Com o micromanipulador, pressione a agulha no prato até que ela dobre e quebre. Esta abertura da ponta é de aproximadamente 10-20 μm.
      NOTA: Esta agulha pode ser usada repetidamente para as mesmas injeções de corante/droga naquele dia. Recomenda-se usar uma ponta fresca a cada dia e para corantes/medicamentos separados.
   5. Usando o micromanipulador, insira a ponta da agulha através do subguarda-chuva na mesoglea sem perfurar o ex-guarda-chuva.
      NOTA: Um vinco/dobramento do epitélio será perceptível. Uma vez que a agulha é inserida na medusa, o vinco/dobramento cessa.
   6. No microinjetor, ajuste a pressão de retenção para zero e a pressão de ejeção para ≤20 PSI. Injetar em um ou dois quadrantes, preenchendo cada um com um ponto de corante ou droga aproximadamente 1/4 da área desse quadrante.
      NOTA: Dependendo do tamanho da medusa, volumes maiores ou menores são apropriados em pontos de injeção únicos. O enchimento excessivo da medusa resulta em danos extremos ao epitélio e até na morte do animal.
   7. Dependendo do corante ou droga que está sendo injetada, os animais são colocados em um copo de ASW fresco para permitir a difusão e incubação de corantes ou drogas.
   8. Para a obtenção de imagens, montar a medusa em uma lâmina de depressão usando uma pipeta de transferência modificada, posicionando o animal de forma que o ex-guarda-chuva fique voltado para cima (Figura 5). Os animais podem ser feridos nesta fase para testar o efeito de um reagente injetado.

Figura 5: Configuração da injeção para introdução de corantes ou fármacos na MEC. (A) Configuração da injeção. (B) Close-up do dispositivo de injeção mostrando a orientação da agulha de microinjeção (ângulo de aproximadamente 45° em relação ao animal no prato). (C) Close-up da placa de injeção de silicone com a medusa em pequena quantidade de ASW para injeção. (D) Uma agulha de microinjeção carregada com Fast Green FCF entrando na mesoglea da medusa através do subguarda-chuva. (E) Pós-injeção de Fast Green FCF em medusa montada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Seguindo os protocolos acima, microferidas unicelulares, feridas pequenas e feridas grandes foram fotografadas. Pilhas registradas de arquivos de imagem foram salvas como arquivos .avi.

No Filme 1, observa-se o fechamento das microferidas entre e dentro das células (Figura 1 e Figura 2). Pequenos lamelípodes são observados durante o fechamento, seguidos de contração e cicatrização. Os detritos são excluídos e liberados na água. A cura é concluída em um minuto ou menos.

Nos filmes 2 e 3, pequenas feridas de diferentes formas cicatrizam através da formação de lamellipodia, extensão dos contatos lamellipodiais e disseminação de células na margem da ferida, como descrito anteriormente⁴⁰ (Figura 1 e Figura 2). Células em camadas atrás das células marginais não participam da cicatrização de feridas desse tamanho nem há migração celular coletiva. O fechamento rápido e progressivo das lacunas epiteliais é seguido pela contração tecidual ao longo da costura da ferida^{recém-formada40}. A taxa normalizada de cicatrização dessas duas feridas, expressa em porcentagem da área original ao longo do tempo, é mostrada (Figura 4C,D). Embora haja alguma variabilidade na dinâmica de fechamento de feridas, a média da porcentagem de fechamento da área ao longo do tempo para 14 feridas de várias formas, variando de 0,02 a 0,125^mm2, permite estabelecer uma curva média para a cicatrização de feridas em animais não tratados (Figura 4E).

Danos à membrana basal podem ser claramente vistos quando ocorrem (Figura 2). No Filme 4, as células na margem de uma pequena ferida na qual há danos na membrana basal se espalham ao redor da área danificada, e o fechamento da lacuna é completado com uma contração da corda da bolsa.

Se o tecido estiver desidratado ou muito danificado para reparar, os movimentos celulares podem parar, ou toda a folha de células pode estourar (Filme 5 e Filme 6). Isso geralmente acontece após longos períodos de imagem (45 minutos ou mais). Se a explosão celular ocorrer no início da imagem, a amostra será descartada.

Como mostrado no filme 7, grandes feridas cicatrizam em vários estágios. Primeiro, a borda da ferida torna-se lisa e regular devido às contrações na margem, como relatado anteriormente⁵⁷. Em seguida, observa-se a formação de lamelípodes a partir das células na margem da ferida, com os lamelípodes avançando para maximizar o contato com a lamellipodia adjacente. O rastreamento dos núcleos nas células na margem da ferida e em várias camadas atrás das células marginais mostra que grandes lacunas se fecham pela migração celular coletiva⁴⁰. As células nunca se separam, mas se movem juntas como uma folha.

A introdução de corantes e agentes farmacológicos pode ser uma poderosa ferramenta para dissecar mecanismos biológicos. Muitas substâncias são excluídas do Clytia (não mostrado), provavelmente por causa da camada de muco que reveste a superfície do animal. No entanto, a microinjeção pode ser usada para introduzir moléculas diretamente na MEC, interrompendo a estrutura da MEC ou perturbando as atividades regulatórias na MEC. Além disso, corantes e outras moléculas são capazes de entrar nas células epiteliais pelo lado basal. Por exemplo, a Figura 6 mostra a coloração nuclear com Hoechst, a coloração de membrana com FM1-43 e a inibição da formação de lamelipodos pela citocalasina B após a microinjeção desses reagentes na MEC. A introdução dessas moléculas na MEC e nas células epiteliais antes da lesão permite experimentos que testam o efeito de ferramentas farmacológicas no processo de cicatrização.

Figura 6: Células epiteliais da medusa após microinjeção de corantes ou agentes farmacológicos. (A) Células epiteliais mostradas no painel superior 5 min após a injeção com 20 μM Hoechst (núcleos) e 50 μM FM1-43 (membranas). (B,C) Cicatrização de feridas após injeção com controle 1:1.000 DMSO (B) ou 100 μM de citocalasina B (C). As feridas foram feitas 15 minutos após a injeção. As imagens foram feitas 5 min após o ferimento. A formação de lamelipodos é inibida pela citocalasina B. Acredita-se que as "fibras" aparentes frequentemente vistas entre as células na área da ferida sejam o resultado da tensão que estica a membrana basal - elas não mancham com faloidina (não mostrada). Barras de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme 1: Filme Time-lapse de cicatrização de microferidas de célula única. Tempo decorrido: 20 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 2: Filme Time-lapse de uma pequena cicatrização de feridas epiteliais. Tempo decorrido: 9 min 54 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 3: Filme Time-lapse de uma pequena cicatrização de feridas epiteliais. Esta ferida é maior e mais irregular do que a ferida no filme 2. Tempo decorrido: 20 min 54 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 4: Filme Time-lapse de uma pequena ferida e uma cicatrização de microferidas com uma ruptura da membrana basal. Os lamelipodas se espalham ao redor da ruptura da membrana basal, embora possam avançar sobre o restante da MEC. Uma vez que a região da ferida com o dano da membrana basal é cercada, uma contração de corda de bolsa puxa as células sobre a região. Tempo decorrido: 19 min 4 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 5: Células morrendo em uma pequena ferida epitelial. A morte celular é provavelmente devido à desidratação do animal. Tempo decorrido: 4 min 24 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 6: Uma pequena ferida epitelial não consegue completar a cicatrização. Tempo decorrido: 42 min 32 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 50 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Filme 7: Cicatrização de feridas epiteliais grandes. Tempo decorrido: 25 min 29 s. Taxa de quadros: 10 fps. Barra de escala: 100 μm. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

Figura suplementar 1: Esquemas da dimensão do tanque Clytia. Visualização 3D dos tanques Clytia feitos sob medida. (A) Vista frontal e traseira. (B) Vista lateral. O recorte na peça mostrada em verde é coberto com malha de nylon. A água entra no tanque diretamente sobre a malha, varre a malha e cria uma corrente circular. A água sai do sistema através do orifício na peça final mostrada em azul. Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 1: Matriz extracelular acelular em Clytia. Pilha Z de Clytia tomada usando microscopia confocal. A pilha inicialmente se concentra no ex-guarda-chuva e, em seguida, varre a cada 10 μm através da MEC até a placa endodérmica e sub-guarda-chuva. Imagens usando DIC (esquerda) e coloração nuclear de Hoechst (direita) demonstram a falta de células na MEC. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, a metodologia é apresentada para obtenção de imagens de feridas in vivo em Clytia, um organismo modelo de invertebrado relativamente novo40,43,58. Vários são os fatores que fazem desse sistema uma ferramenta de pesquisa única e poderosa, distinta de outros modelos utilizados para o estudo da cicatrização e reepitelização de feridas. Primeiro, o epitélio monocamada está aderido a uma MEC transparente, assemelhando-se, portanto, a ensaios de cultura de tecidos in vitro (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4). Como nos ensaios in vitro, as células podem ser fotografadas em alta resolução. No entanto, ao contrário da cultura de tecidos, existe um ambiente celular autêntico e MEC, de modo que a cicatrização de feridas pode ser vista no contexto dos complexos eventos de sinalização que ocorrem em um animal vivo ferido. Em segundo lugar, Clytia não tem respostas inflamatórias, fibroblastos migratórios, vasculatura e sangue. Isso permite que o processo de reepitelização seja estudado in vivo na ausência de eventos sobrepostos que ocorrem em animais adultos mais complexos durante a cicatrização^{de feridas 59}. Terceiro, a MEC é acelular (Supplemental Movie 1) e de grande porte, permitindo fácil acesso com agulha de microinjeção (Figura 5 e Figura 6). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem testar o efeito de reagentes farmacológicos que perturbam a estrutura ou sinalização da MEC na cicatrização de feridas in vivo. Reagentes também podem ser introduzidos nas células epiteliais, e seus efeitos na cicatrização de feridas in vivo podem ser avaliados. Quarto, existem protocolos para a criação de animais mutantes e transgênicos no sistema Clytia42,43,44,45. A cicatrização in vivo pode, portanto, ser observada em animais com expressão aumentada/diminuída de genes de interesse.

Existem várias etapas críticas nesta técnica. Primeiro, como mostrado na Figura 3, é necessário usar um microscópio que esteja corretamente configurado para a microscopia de CIVD, pois as células epiteliais planas e transparentes são quase invisíveis com a microscopia de luz padrão. Também é importante desenvolver a habilidade de ferir os animais suavemente para que o epitélio seja danificado sem arrancar a MEC. Um toque igualmente suave é necessário para a microinjeção de materiais na MEC, pois danos extensos ao animal durante a injeção podem comprometer uma análise subsequente da cicatrização da ferida. Embora haja uma curva de aprendizado para essas técnicas, até mesmo os alunos iniciantes as dominaram rapidamente no laboratório Malamy. De fato, esses protocolos têm sido usados para demonstrar a migração celular em cursos de graduação em laboratório da Universidade de Chicago.

Para uma imagem ideal, é importante que o animal não se mova e a área da ferida escolhida não se afaste do campo de visão. Se os animais estiverem pulsando, o tratamento com Tricaína como descrito é muito eficaz. Para deriva, muitas vezes é necessário reposicionar manualmente a amostra. Esses movimentos podem ser eliminados do filme final usando a função de registro no FIJI/ImageJ.

Uma limitação desse sistema é que não é possível criar feridas idênticas, pois as feridas variam em forma e tamanho usando os métodos descritos aqui. Portanto, pode ser difícil quantificar a taxa exata de fechamento da ferida ou migração celular. Marcadores posicionais, como grãos de carbono, aderem à MEC exposta em um animal ferido e podem ser usados para medir a taxa de migração celular coletiva em feridas grandes (não mostradas). Para a análise de fechamento de feridas pequenas, mesmo com tamanho e forma variáveis, há uma variação limitada de taxas de fechamento entre feridas desse tamanho (Figura 4). Assim, é possível detectar quantitativamente os efeitos de reagentes farmacológicos promotores ou repressivos.

Enquanto este trabalho descreve a caracterização da cicatrização de feridas usando apenas microscopia de CIV, as mesmas abordagens podem ser usadas para a cicatrização por imagem usando fluorescência ou microscopia confocal. Para ajudar nisso, existem protocolos para gerar animais transgênicos nos quais várias proteínas celulares e extracelulares são marcadas fluorescentemente. Imagens concomitantes com CIVD e fluorescência, combinadas com perturbação da cicatrização de feridas usando agentes farmacológicos ou linhas mutantes, serão uma abordagem poderosa para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao processo de cicatrização de feridas no epitélio.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source	Kramer Scientific Corporation
AxioCam 506 mono	ZEISS	426557-0000-000-MA285
Capillary tubes	World Precision Instruments	TW1004
Cytochalasin B	Abcam	ab143482
Depression slides	Amscope	BS-C12
DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp	Leica
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521-10G
Fast Green FCF	Thermo Scientific	A16520-06
FM1-43	Biotium	70022	Excitation/Emission: 480/598 nm
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249	Excitation/Emission: 361/497 nm
imageJ	NIH
Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL)	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	World Precision Instruments	3301R / M3301L
Microscope Cover Glass (22X40-1.5)	Fisherbrand	12-544-BP
Petri Dish (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB085713A
PicoNozzle v2	World Precision Instruments	5430-ALL
Pipette puller	Sutter Instrument Co	P-97
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Polycarbonate vacuum, desiccator	Bel-art	F42025-0000
Prism 9	GraphPad
STEMI Sv11 Dissection scope	ZEISS	STEMI SV11
SYLGARD 184	Dow Silicones	1024001
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Z-Hab mini system	Pentair
ZEN Microscopy software	Zeiss