Neste Artigo

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Resumo

O presente estudo descreve metodologias baseadas na decelularização para visualizar e quantificar a deposição de tecido adiposo intramuscular (IMAT) através do volume muscular intacto, bem como quantificar métricas de adipócitos individuais que compõem o IMAT.

Resumo

A infiltração gordurosa é o acúmulo de adipócitos entre as miofibras no músculo esquelético e é uma característica proeminente de muitas miopatias, distúrbios metabólicos e distrofias . Clinicamente em populações humanas, a infiltração gordurosa é avaliada por métodos não invasivos, incluindo tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e ultrassonografia (US). Embora alguns estudos tenham utilizado TC ou RM para quantificar a infiltração gordurosa no músculo de camundongos, os custos e a resolução espacial insuficiente permanecem desafiadores. Outros métodos de pequenos animais utilizam a histologia para visualizar adipócitos individuais; no entanto, essa metodologia sofre de viés de amostragem em patologias heterogêneas. Este protocolo descreve a metodologia para visualizar qualitativamente e medir quantitativamente a infiltração gordurosa de forma abrangente em todo o músculo intacto de camundongos e ao nível de adipócitos individuais usando decelularização. O protocolo não se limita a músculos específicos ou espécies específicas e pode ser estendido à biópsia humana. Além disso, avaliações qualitativas e quantitativas brutas podem ser feitas com equipamentos laboratoriais padrão por baixo custo, tornando esse procedimento mais acessível entre os laboratórios de pesquisa.

Introdução

O acúmulo de adipócitos entre as miofibras dentro do músculo esquelético é uma característica proeminente de condições díspares, desde diabetes tipo 2 até sarcopenia e lesão musculoesquelética 1,2,3,4,5,6,7. A avaliação abrangente desse tecido adiposo intramuscular (IMAT) é fundamental para o entendimento da patogênese dessas condições, uma vez que a deposição de IMAT está fortemente correlacionada com a resistência à insulina 3,8,9,10 e a má função muscular esquelética 11,12,13,14,15 . Embora essas associações tenham sido observadas há décadas, os mecanismos associados e a origem do IMAT ainda permanecem uma área de intensa investigação. Isso ocorre, em parte, porque a maioria dos estudos que avaliam a infiltração gordurosa no músculo esquelético foi realizada em humanos, onde as investigações mecanicistas são limitadas16,17. No entanto, mais recentemente, modelos de pequenos animais, incluindo camundongos, têm sido utilizados para ajudar a identificar a regulação celular do desenvolvimento e sinalização do IMAT18,19,20. Este trabalho tem como objetivo fornecer uma nova ferramenta para uso com modelos animais de pequeno porte para visualizar e quantificar qualitativamente a infiltração gordurosa do músculo esquelético.

Clinicamente em populações humanas, a infiltração gordurosa é avaliada por métodos não invasivos, incluindo tomografia computadorizada (TC)6,21, ressonância magnética (RM)16,17,22,23 e ultrassonografia (US)17,24. Essas técnicas de imagem tipicamente identificam uma região de interesse (ROI) definida em um músculo e adquirem cortes de imagem dentro dessa região, embora abordagens abrangentes também tenham sido empregadas25,26,27. Esses cortes de imagem são submetidos à graduação qualitativa6 e quantificados via limiar de pixel28. Abordagens semelhantes já foram utilizadas em animais anteriormente29,30; no entanto, são dispendiosos e requerem acesso a sistemas de imagem de pequenos animais. A resolução espacial por TC e RM também apresenta um grande problema, pois eles são incapazes de delinear adipócitos IMAT de fibras musculares esqueléticas dentro de um voxel, e dependem da separação subjetiva de regiões primariamente musculares e principalmente regiões IMAT31,32. Dessa forma, a incapacidade de identificar com precisão o tecido adiposo ou muscular também apresenta quantificação imprecisa de quantidades representativas desses tecidos.

Devido a essas limitações, as técnicas atuais para avaliar a infiltração gordurosa do músculo esquelético em modelos de pequenos animais mais comumente utilizam a histologia como uma alternativa barata e acessível33,34. Os procedimentos de coloração padrão, incluindo hematoxilina e eosina (H&E), óleo vermelho O (ORO) e imunomarcação para marcadores de adipócitos como perilipina, permitem a simples detecção e visualização de adipócitos que compreendem infiltração gordurosa dentro do músculo. No entanto, as abordagens histológicas raramente são abrangentes e, tipicamente, a avaliação qualitativa ou quantitativa do IMAT é limitada a uma única seção34. A extração lipídica também tem sido utilizada para quantificar os lipídios musculares totais35; entretanto, essa técnica não consegue distinguir entre os estoques de lipídios intramiocelulares (IMCL) e de tecido adiposo intramuscular (IMAT)36. Em resumo, as metodologias atuais para visualizar e quantificar a gordura no músculo permanecem limitadas pelos custos financeiros ou pela detecção específica de IMAT.

Descrevemos um método detalhado para avaliar a infiltração gordurosa muscular esquelética tanto pela visualização qualitativa quanto pela quantificação em multiescala. Essa metodologia emprega uma técnica simples de descelularização que remove estruturas miocelulares, incluindo IMCL, mas mantém intactas as gotículas lipídicas maiores derivadas do adipócito IMAT. A validação da especificidade dessa técnica foi publicada37, incluindo o uso de extração lipídica para mostrar a depleção de IMCL com decelularização, μCT para mostrar a retenção do padrão IMAT com decelularização e histologia para mostrar a distribuição de tamanho semelhante de gotículas lipídicas IMAT em comparação com aquelas identificadas com decelularização. Uma vez descelularizados, os músculos podem ser corados com corantes lipossolúveis para visualização qualitativa do padrão e da extensão da infiltração gordurosa e/ou imagem quantitativa de gotículas lipídicas IMAT individuais. Os corantes podem ser posteriormente extraídos com isopropanol, e a densidade óptica (DO) da solução resultante pode ser usada para estimar o volume lipídico do IMAT. A rigorosa validação dessa técnica foi publicada em outros periódicos37. Este artigo fornece um protocolo detalhado para usar essa metodologia com músculos de camundongos e fornece dicas de solução de problemas para apoiar a adoção desse método em outras aplicações, como músculos de outras espécies ou outros tecidos.

Protocolo

Os cuidados e sacrifícios dos camundongos foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Todos os trabalhos foram aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington na St. Louis School of Medicine. Camundongos C57BL/6J machos com idade entre 2-3 meses (ver Tabela de Materiais) foram usados para gerar as imagens de exemplo incluídas neste protocolo. Todas as etapas descritas abaixo são realizadas à temperatura ambiente.

1. Descelularização muscular

  1. Preparar uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1% (m/v; ver Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mexa a solução até ficar completamente misturada.
    NOTA: 1% SDS pode ser preparado a granel e armazenado à temperatura ambiente por 1 mês.
  2. Dissecar o(s) músculo(s) de interesse conforme descrito anteriormente38,39.
    1. Expor os músculos de interesse molhando os cabelos e a pele com solução de etanol a 70%, fazendo então uma incisão transcutânea de aproximadamente 2 cm seguida da remoção da pele de cobertura com pinça e tesoura de mola.
      NOTA: O(s) músculo(s) de interesse aqui incluem o tibial anterior (TA), extensor longo dos dedos (EDL) e diafragma. Alguns músculos podem estar profundamente em outra musculatura, exigindo a dissecção de outros músculos (por exemplo, dissecar o EDL requer a remoção do TA).
    2. Disseque o(s) músculo(s) de interesse usando tesouras ou lâminas afiadas (ver Tabela de Materiais) para garantir que toda a extensão do músculo seja obtida e as bordas sejam lisas.
      NOTA: Isso é idealmente feito sob um microscópio dissecante para melhorar a visualização.
    3. Inspecione os músculos para garantir que nenhuma lasca óssea ou bordas esfarrapadas sejam incluídas e, em seguida, corte-os com uma tesoura afiada, conforme necessário.
    4. Pese o músculo usando uma balança analítica e registre o peso.
  3. Colocar o músculo dissecado em pelo menos 0,1 mL de SDS a 1% por miligrama de peso; As placas de 6, 12 ou 24 poços funcionam bem para os músculos diafragma, AT e EDL de camundongos, respectivamente. Os volumes típicos são de 6 mL, 3 mL e 1,5 mL para placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente.
    NOTA: A solução SDS às vezes fará com que os músculos se deformem, portanto, certifique-se de que o músculo esteja plano/estendido na imersão inicial.
  4. Coloque a placa do poço (ou outros recipientes) em um agitador de balanço regulado para 50-80 Hz.
  5. Inspecione visualmente a solução SDS periodicamente. Quando a solução ficar turva, remova a solução com uma pipeta (tomando cuidado para não aspirar o músculo) e substitua-a por um volume igual de SDS fresco a 1%. Quando a solução permanece límpida por 24 h, a descelularização é completa.
    NOTA: A frequência necessária para as alterações da solução varia de acordo com o tamanho do músculo e o volume inicial da solução. Músculos maiores como o TA precisam de novos SDS dentro de algumas horas, e músculos menores como o EDL podem ir durante a noite na solução original.
  6. Remova a solução final de SDS dos músculos decelularizados com uma pipeta (tomando cuidado para não aspirar o músculo) e substitua-a por um volume igual de PBS.
  7. Inspecione visualmente os músculos decelularizados sob um microscópio dissecante e use pinças e tesouras para remover qualquer pelo ou detrito que esteja preso ao músculo.
    NOTA: Observe também a clareza do músculo decelularizado nesta etapa. Se o músculo decelularizado não for totalmente transparente e a solução de SDS não aumentar a nebulosidade ao longo de 24 h, então a decelularização não foi eficiente. Isso cria um artefato em avaliações qualitativas e quantitativas e, portanto, a decelularização deve sempre ser otimizada em amostras de prática antes de prosseguir com os músculos experimentais.
  8. Retire cuidadosamente o PBS, substitua-o por um volume igual de formaldeído a 3,7% ou solução de paraformaldeído a 4% e devolva a placa ao agitador por 24 horas.
    NOTA: Certifique-se de que a solução de formaldeído cobre totalmente o músculo decelularizado, caso contrário, a coloração será irregular.

2. Visualização do IMAT com óleo vermelho O

  1. Prepare uma solução de ORO.
    1. Dissolver 0,5 g de pó de ORO (ver Tabela de Materiais) em 100 ml de isopropanol para gerar uma solução-mãe.
      NOTA: Adicione fogo suave à solução para dissolvê-la completamente. Este estoque pode ser armazenado em temperatura ambiente por 1 mês.
    2. Combinar a solução-mãe ORO e a água deionizada numa proporção de 60:40 para obter a solução de trabalho necessária para todos os músculos utilizando um volume de pelo menos 0,1 ml / mg de peso muscular. Os volumes típicos são de 6 mL, 3 mL e 1,5 mL para placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente.
      NOTA: Inspecione a solução-mãe antes de misturar. Se a solução-mãe contiver partículas substanciais, constituir um novo stock.
    3. Cubra a solução de trabalho durante 10 minutos para permitir que as partículas se fixem.
    4. Filtrar a solução de trabalho através de uma malha de 40 μm, seguida de um filtro de seringa de 0,22 μm.
      NOTA: O filtro de seringa de 0,22 μm entope rapidamente e deve ser trocado se a solução de trabalho não passar facilmente.
  2. Retirar a solução de formaldeído ou paraformaldeído e lavar os músculos decelularizados com três trocas de solução de igual volume de PBS.
  3. Substitua o PBS por um volume igual de solução de isopropanol a 60% e incube em um agitador de balanço por 5 min.
  4. Substitua a solução de isopropanol a 60% por solução de trabalho ORO e incube no agitador de balanço durante 10 minutos.
    NOTA: Certifique-se de que a solução de trabalho ORO cobre totalmente o músculo descelularizado, caso contrário, a coloração será irregular.
  5. Substitua a solução de trabalho ORO por um volume igual de 1% de SDS. Inspecione visualmente a solução SDS periodicamente. Quando a solução ficar visivelmente rosa, remova a solução com uma pipeta (tomando cuidado para não aspirar o músculo) e substitua-a por SDS fresco a 1%.
  6. Quando a solução permanecer límpida por 24 h, substituir o SDS a 1% por PBS e inspecionar o músculo corado em microscópio dissecante/estéreo em aumento de 4x. Remova quaisquer detritos óbvios ou partículas presas na parte externa do músculo. Se isso for extenso, o músculo decelularizado pode ser enrolado suavemente em um tecido de limpeza para retirar os detritos/partículas.
  7. Se a coloração for satisfatória (esferas vermelhas brilhantes flutuando em uma matriz transparente), adquira imagens da coloração conforme desejado usando uma câmera acoplada ao microscópio estéreo (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Se o microscópio dissecante não tiver uma câmera acoplada, uma câmera de telefone pode ser usada para tirar fotos através da ocular.

3. Visualização de gotículas lipídicas IMAT com BODIPY

NOTA: A imagem confocal é mais eficaz com músculos finos como o EDL ou o diafragma (~2 mm de espessura). Alternativamente, tiras de espessura comparáveis de músculos como o TA poderiam ser usadas.

  1. Preparar uma solução 1:200 de BODIPY 493/503 fluorescente (ver Tabela de Materiais) em PBS para obter um volume de solução de trabalho de pelo menos 0,1 mL / mg de peso muscular. Os volumes típicos são de 6 mL, 3 mL e 1,5 mL para placas de 6, 12 e 24 poços, respectivamente.
  2. Remova o formaldeído, paraformaldeído ou SDS a 1% e lave os músculos decelularizados com três trocas de solução de igual volume de PBS.
  3. Substitua o PBS pela solução de trabalho BODIPY e incube no agitador de balanço por 20 min.
  4. Lavar os músculos decelularizados com três trocas de solução de igual volume de PBS.
  5. Coloque o músculo em um vaso de fundo claro que seja compatível com um microscópio confocal disponível. O ideal é que o prato tenha um fundo embutido para colocar uma tampa sobre o músculo sem deformá-lo (veja Tabela de Materiais).
  6. Obtenha pilhas de imagens com um microscópio confocal padrão (ver Tabela de Materiais) usando o laser 488. Os tamanhos típicos de pilha para um EDL são de 0,5-1 mm com uma espessura de corte de 10 μm, produzindo 50-100 imagens por pilha.
    NOTA: Para quantificar o volume lipídico total, o número total de gotículas lipídicas IMAT e o índice vizinho mais próximo de agrupamento, imagem através de todo o volume muscular, tomando o cuidado de deixar alguma sobreposição para o registro da imagem. Para quantificar o volume médio de gotículas lipídicas, uma pilha pode ser suficiente.
  7. Se desejar, corar os músculos com ORO, conforme seção 2, para uma imagem muscular complementar da distribuição do IMAT.
    NOTA: Como o BODIPY é fluorescente, ele não será visível sob o microscópio de luz quando as imagens do ORO forem adquiridas.

4. Estimativa do volume lipídico total por extração lipídica

  1. Após a aquisição da imagem, transfira os músculos para 200 μL de isopropanol em poços individuais de uma placa de 96 poços, ou adapte o poço/volume se o músculo for muito grande para se encaixar.
  2. Agitar a solução batendo a placa, pipetando a solução para cima e para baixo e/ou esmagando mecanicamente o músculo com uma ponta de pipeta até que nenhuma esfera vermelha/fluorescente possa ser vista no músculo decelularizado sob um microscópio.
    NOTA: Trate todos os músculos com a mesma combinação de toque, pipetagem e esmagamento para a melhor confiabilidade. Além disso, tome cuidado para limitar o tempo gasto batendo, pipetando e esmagando, pois o isopropanol evaporará rapidamente.
  3. Misture a solução em cada poço pipetando para cima e para baixo e, em seguida, transfira 75 μL para dois poços limpos da placa.
  4. Cubra a placa e leia a absorbância dos poços duplicados de 75 μL usando um espectrofotômetro ou leitor de placas. Se o construto foi corado com ORO, ler a solução a 500 nm; se foi corado com BODIPY 493/503, ler a placa a 493 nm.
    NOTA: Se o construto foi corado com BODIPY e ORO, recomenda-se a leitura da placa a 500 nm, pois leituras de 500 nm fornecem resultados semelhantes entre construtos corados apenas com ORO e ORO mais BODIPY.
  5. Divida a leitura da absorbância pelo peso registrado do músculo, se desejado, para corrigir as diferenças de tamanho entre as amostras.

5. Quantificação da métrica de gotículas lipídicas IMAT a partir de imagens confocais

NOTA: Esta seção requer acesso ao ImageJ versão 1.47 (consulte Tabela de Materiais) ou posterior e habilidades básicas do ImageJ40.

  1. Abra pilhas confocais no ImageJ.
    NOTA: Microscópios confocais diferentes podem salvar imagens confocais em diferentes formatos. O ImageJ pode exigir um plugin ou variante adicional, como Fiji, para abrir as pilhas41. Os algoritmos utilizados fazem parte do pacote de software ImageJ.
  2. Execute um algoritmo de limite no ImageJ para identificar pixels positivos BODIPY. Isso converte a imagem atual em uma imagem binária.
    1. Abra a interface do usuário de limite selecionando Imagem > Ajustar > Limite. Na interface do usuário, selecione Intermodos como o tipo de limite e verifique se Plano de fundo escuro está selecionado. Nenhuma outra opção precisa ser selecionada. Em seguida, clique em Aplicar.
    2. Uma caixa de diálogo é aberta para converter a pilha em binário. Certifique-se de que ele tenha as seguintes opções selecionadas: Método: Intermodos; Fundo: Escuro. Calcule o limite para cada imagem e fundo preto (de máscaras binárias). Isso gera uma pilha binária, onde branco indica pixels positivos BODIPY e preto indica pixels negativos BODIPY.
      Observação : O algoritmo de limite Intermodes pode não ser a melhor escolha para todos os usuários. A inspeção subjetiva das opções de limite internas do ImageJ ajuda a selecionar o algoritmo ideal para separar pixels positivos e negativos do BODIPY.
  3. Execute o algoritmo Watershed no ImageJ para separar gotículas lipídicas de toque. Selecione Processo > Bacia Hidrográfica > Binária. Uma caixa de diálogo é aberta perguntando se todas as imagens na pilha devem ser processadas. Selecione Sim. Isso adiciona linhas pretas finas dividindo áreas maiores de branco sólido.
  4. Identifique ROIs com o algoritmo Analyze Particles no ImageJ.
    1. Selecione Analisar > Analisar partículas. Uma caixa de diálogo é aberta para definir as configurações de seleção.
      NOTA: Selecionar a faixa de tamanho é fundamental para obter a melhor estimativa de ROIs de gotículas lipídicas. O limite inferior elimina regiões que provavelmente são muito pequenas para serem gotículas lipídicas derivadas do IMAT (artefato de fundo), e o limite superior elimina regiões que provavelmente são grandes demais para serem gotículas lipídicas derivadas do IMAT (tocando gotículas lipídicas que não foram separadas pelo algoritmo Watershed).
    2. Para definir esses valores, abra a imagem original e contorne a menor e a maior gota lipídica em exibição usando a ferramenta Oval. Em seguida, adicione essas formas ao gerenciador de ROI digitando "t". Selecione Analisar e, em seguida, Definir medidas. Uma caixa de diálogo é aberta para seleção das configurações.
      1. Marque Área somente e clique em OK. Em seguida, selecione Medir no Gerenciador de ROI. Use as duas medidas de área desta janela Resultados como o intervalo de tamanho em Analisar partículas.
    3. Verifique se a opção Adicionar ao Gerenciador está marcada. Não são necessárias outras opções.
  5. Sobreponha as ROIs na pilha confocal marcando Mostrar tudo no ROI Manager. Use a barra deslizante para inspecionar cada fatia de pilha individualmente e adicionar regiões ausentes manualmente usando a ferramenta Oval (localizada na barra de ferramentas do ImageJ).
  6. Produza as medições de ROI. Selecione Analisar > Definir medidas e selecione Área, Centroide, Ajustar elipse e Posição da pilha. Clique em OK. Em seguida, selecione Medir no Gerenciador de ROI. Os dados na tabela Resultados podem ser selecionados e copiados para o Matlab ou Excel para análise posterior.
  7. Refine os ROIs em cada pilha para um único ROI usando o código Refine.m Matlab37 ou um algoritmo semelhante.
    NOTA: Esta etapa é necessária, pois as etapas 5.2-5.4 identificam a mesma gota lipídica em fatias adjacentes como ROIs distintas. No entanto, as ROIs podem alternativamente ser identificadas apenas manualmente, ou as ROIs duplicadas podem ser eliminadas manualmente no ImageJ para evitar a necessidade do Matlab.
  8. Obtenha as estatísticas de resumo no ROI usando Matlab ou Excel.
    1. Estimar o número total de gotículas lipídicas como o número total de ROIs.
    2. Estimar o volume da gota lipídica como o volume da elipse ajustada a cada ROI 2D, assumindo que a profundidade da forma é a média dos eixos maior e menor da elipse.
    3. Estimar o volume lipídico total, que é a soma dos volumes individuais estimados de gotículas lipídicas.

Resultados Representativos

Visualização qualitativa da infiltração gordurosa no músculo esquelético
Os músculos devidamente decelularizados são brancos e semitransparentes (secção 1; Gráfico 1). Quando os músculos decelularizados são corados com ORO para visualização do IMAT (seção 2), as gotículas lipídicas do IMAT são aparentes dentro das estruturas musculares claras como esferas vermelhas (Figura 1). Os músculos saudáveis dos membros posteriores de camundongos têm pouca IMAT natural, evidenciada por pouco ou nenhum lipídio vermelho ORO positivo (Figura 1A). Em comparação, os músculos dos membros posteriores injetados com cardiotoxina (CTX; Figura 1B) ou glicerol (GLY; Figura 1C) 14 dias antes da decelularização têm um acúmulo aumentado de IMAT, com uma maior concentração de IMAT após CTX em comparação com GLY como observado anteriormente37.

A descelularização incompleta pode ser identificada imediatamente após o tratamento inicial com SDS ou após a eliminação da coloração ORO como fibras semiopacas e rosa claro (Figura 2B em comparação com a Figura 2A). A depuração incompleta da ORO pode ser identificada após o washout da ORO como um fundo uniforme rosa ou vermelho, em vez de linhas de fibras distintas (Figura 2C). A Figura 2A,B também contém adiposo epimuscular (asteriscos), um aglomerado de gotículas lipídicas fora do músculo decelularizado. A Figura 2C também demonstra as dobras musculares que podem ocorrer se os músculos não estiverem espalhados durante a decelularização. A decelularização incompleta, a depuração incompleta da ORO e o adiposo epimuscular residual aumentam artifactualmente a (DO) do lipídio extraído, mas não necessariamente impedem a avaliação qualitativa da infiltração gordurosa se forem reconhecidos como um artefato.

Imagem quantitativa da infiltração gordurosa do músculo esquelético
As gotículas lipídicas fluorescentemente marcadas com BODIPY podem ser obtidas por microscopia confocal para uma avaliação mais detalhada das métricas e distribuição das gotículas lipídicas individuais (Figura 3). Esse processo é semi-automatizado, como descrito anteriormente, incluindo o código Matlab37. Uma boa coloração BODIPY resulta em formas elípticas brilhantes delineadas a partir de formas vizinhas quando fotografadas no plano (Figura 3A). O limiar e a segmentação da forma fornecem uma boa primeira passagem para gerar ROIs para cada gota lipídica (Figura 3B), mas edições manuais são necessárias para corrigir erros. O erro mais difundido são as gotículas lipídicas que estão profundamente no tecido e, portanto, não são brilhantes em nenhum corte (Figura 3B; setas duplas rosas). Isso pode ser corrigido adicionando ROIs manualmente usando a ferramenta Oval no ImageJ (Figura 3C). A segunda é a identificação de um grupo de gotículas lipídicas como uma única ROI (Figura 3B; asterisco vermelho). Isso pode ser corrigido excluindo e substituindo o ROI original por várias ROIs novas (Figura 3D). Finalmente, uma única gota lipídica é identificada como uma única ROI em múltiplos cortes, de modo que as ROIs duplicadas devem ser consolidadas em uma única ROI (Figura 3E; seta azul). Isso é feito mais facilmente usando uma ferramenta de processamento de dados como o Matlab, mas também pode ser feito manualmente, identificando o maior ROI e excluindo o resto. Os valores médios de cada métrica no camundongo C57BL6/J e 129Sv podem ser encontrados em Biltz et al.37.

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Figura 1: Exemplo de coloração com óleo vermelho O (ORO) de músculos decelularizados. Músculos corados com OOR 14 dias após a injeção com solução salina (SAL), cardiotoxina (CTX) ou glicerol (GLY). Os músculos extensor longo dos dedos (EDL) e tibial anterior (TA) de camundongos têm pouca IMAT (esferas vermelhas) com o tratamento com SAL (A), mas acumulam IMAT em resposta ao tratamento com CTX (B) e GLY (C). Há uma completa decelularização e washout de ORO, evidenciado por gotículas lipídicas distintas positivas para ORO em um fundo muscular branco transparente. Barras de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Exemplos de maus resultados de coloração ORO. A decelularização incompleta ou a depuração incompleta da ORO levam a um fundo rosa/vermelho semiopaco. Em comparação com o fundo branco transparente do músculo diafragma de camundongo totalmente decelularizado (A), a decelularização incompleta é caracterizada por rastros de fibra rosa/vermelha clara (B), e a depuração incompleta da ORO é caracterizada por um fundo rosado/vermelho difuso (C). Barras de escala: painéis superiores = 1 mm; painéis inferiores = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Exemplos de identificação de gotículas lipídicas individuais com coloração fluorescente de BODIPY e microscopia confocal As gotículas lipídicas individuais coradas com BODIPY podem ser identificadas e quantificadas em músculos decelularizados usando microscopia confocal. Cortes individuais através de uma pilha confocal mostram gotículas lipídicas no plano como elipses verdes brilhantes, e gotículas lipídicas fora do plano como formas mais fracas (A; setas azuis). O limiar combinado com a segmentação de objetos de bacias hidrográficas e a identificação de ROI podem mapear ROIs coradas por BODIPY (B). O limiar pode perder algumas gotículas lipídicas mais fracas (B; seta dupla rosa), exigindo identificação manual (C). A segmentação da bacia hidrográfica pode agrupar várias gotículas lipídicas (B; asterisco vermelho), exigindo deleção da ROI e reestimação manual (D). A mesma gota lipídica é identificada em múltiplos cortes que requerem registro de imagem (E) para excluir as ROIs duplicadas. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este manuscrito descreve métodos para visualizar e quantificar qualitativamente a infiltração gordurosa do músculo esquelético em modelos animais de pequeno porte que podem ser aplicados para melhor compreensão da patogênese do desenvolvimento do tecido adiposo intramuscular (IMAT) e expansão patológica. O uso de descelularização de músculo total e coloração lipossolúvel permite uma metodologia econômica, reprodutível e simples para avaliar de forma abrangente a presença de IMAT em músculos inteiros.

A base para este protocolo é que a decelularização do músculo com SDS remove os componentes celulares das miofibras, incluindo as pequenas gotículas lipídicas da IMCL, mas poupa as grandes gotículas lipídicas nos adipócitos intramiocelulares. O SDS tem sido usado extensivamente42 em engenharia de tecidos para decelularizar matrizes. Tecidos como o tecido adiposo e o músculo esquelético tipicamente requerem dissociação mecânica adicional e/ou extração alcoólica para remover o lipídio residual do adipócito42,43. Demonstramos anteriormente que isso ocorre porque, enquanto a decelularização com SDS elimina a IMCL, ela poupa a grande gotícula lipídica nos adipócitos37. Imagens do músculo íntegro corado com tetróxido de ósmio pré e pós-decelularização com μCT verificaram que o padrão espacial do IMAT não foi interrompido pela decelularização. Além disso, a quantificação intramuscular de triglicérides em um músculo decelularizado com IMAT desprezível foi de ~5% dos valores de músculo intacto, verificando a remoção de IMCL. Portanto, esta metodologia retém as gotículas lipídicas do IMAT em sua distribuição anatômica original através de uma matriz muscular semitransparente.

A decelularização adequada é a etapa mais crítica desse protocolo. Se a decelularização for incompleta, as gotículas lipídicas IMAT serão difíceis de visualizar e o IMCL residual causará alta coloração de fundo com ORO ou BODIPY (Figura 2). Erros comuns por usuários inexperientes são cobertura inadequada de SDS por músculo (dentro de cada poço), de modo que cada músculo não é completamente coberto com solução de SDS, não usar um balancim para agitar a solução durante a decelularização e não realizar trocas de solução com frequência suficiente. Neste manuscrito, recomendamos a quantidade de SDS necessária por unidade de massa muscular, mas o usuário ainda precisará garantir que os músculos sejam completamente cobertos por soluções, pois cada músculo tem uma geometria única. Os usuários também são recomendados a mudar as soluções livremente (até duas vezes por dia) para garantir que a descelularização seja completa. A coloração de boa qualidade das gotículas lipídicas IMAT foi alcançada após até 4 dias de tratamento com SDS. Para resultados de coloração ORO de alta qualidade, a fixação adequada e a preparação da solução de ORO também são importantes. Semelhante ao tratamento com SDS descrito acima, é necessária uma cobertura adequada de solução de formaldeído a 3,7% para cada amostra muscular. Se o músculo for removido do fixador muito cedo, as gotículas lipídicas só mancharão fracamente com ORO. Um total de 1-2 h deve ser suficiente, mas a fixação noturna é recomendada para garantir que o fixador penetre no centro do músculo e corrija totalmente todas as gotículas lipídicas. Um desafio adicional com a coloração ORO é que, quando a concentração de álcool é reduzida para 60%, uma partícula começa a se formar. Esta partícula pode se instalar na superfície e ficar presa na borda do músculo. A melhor maneira de evitar isso é fazer uma nova solução de trabalho para cada coloração e usar filtros de 40 μm e 0,22 μm. Então, manter a agitação com o balancim e limitar o tempo de coloração a 10 min ajudará a evitar que qualquer partícula que se forme se instale. Se o problema persistir, fazer uma nova solução de estoque ORO pode ajudar. Se algum artefato permanecer preso à superfície muscular decelularizada, um microscópio estéreo, pinça e tesoura cirúrgica podem ser usados para remover esse artefato. A falha na eliminação de artefatos afetará a qualidade da imagem dos músculos e superestimará o conteúdo de IMAT durante a porção de extração lipídica em preparação para a leitura de DO.

Em geral, essa técnica é simples e oferece várias vantagens em relação aos métodos padrão-ouro para visualizar e quantificar a infiltração gordurosa do músculo esquelético. Técnicas não invasivas, como TC, RM e US, que são amplamente utilizadas em humanos e, às vezes, em modelos animais, têm resolução espacial limitada e são incapazes de distinguir gotículas lipídicas de fibras musculares. Assim, um pixel ou voxel de intensidade de sinal intermediário é atribuído como "músculo" ou "gordura", enquanto na verdade é provavelmente uma mistura de miofibras e adipócitos. Mais comumente, a infiltração gordurosa no músculo animal é avaliada por histologia, mais frequentemente por ORO em criossecções musculares. No entanto, isso normalmente é realizado apenas em uma única seção representativa e é difícil de quantificar devido à dispersão lipídica sobre a seção. Por outro lado, a coloração ORO de todo um músculo decelularizado fornece uma avaliação abrangente do IMAT com custos e esforços semelhantes aos da morfologia intacta. Além disso, além de melhorar a visualização, a coloração ORO de descelularização permite a quantificação da infiltração gordurosa por extração lipídica. Para um mergulho mais profundo nas características da infiltração gordurosa, uma coloração fluorescente, BODIPY, pode ser usada em conjunto com a microscopia confocal. Isso permite a reconstrução de gotículas lipídicas IMAT individuais para mapear a paisagem 3D, o que não é possível com a histologia, a menos que seções sejam analisadas ao longo do comprimento do músculo. Embora um microscópio confocal não seja um equipamento de laboratório padrão, é mais provável que seja acessível em um ambiente universitário ou industrial do que a ressonância magnética ou a tomografia computadorizada de pequenos animais. Além disso, grande parte desse processo pode ser automatizado, reduzindo o custo de tempo em comparação com a histologia sequencial. A otimização das configurações no microscópio confocal é uma consideração adicional para a coloração de BODIPY. Estes são exclusivos para cada microscópio. O valor crítico é a intensidade do laser, que deve ser alta o suficiente para detectar as gotículas lipídicas na superfície distante do músculo, ao mesmo tempo em que não satura o sinal das gotículas lipídicas no lado próximo. Devido a isso, sugere-se que o uso da coloração BODIPY com microscopia confocal seja mais adequado em músculos mais finos, incluindo o EDL ou diafragma.

Várias limitações dessa abordagem merecem discussão. Em primeiro lugar, embora se antecipe que essa técnica tenha ampla aplicabilidade além dos modelos de lesão (cardiotoxina e glicerol) em camundongos aqui apresentados, novas aplicações (por exemplo, o modelo mdx) podem exigir otimização, uma vez que o tamanho e a composição do músculo (por exemplo, fibrose) podem afetar a decelularização, exigindo maior concentração de SDS ou tempos de incubação. Outros modelos de doença com massa muscular alterada também exigiriam a análise de métricas absolutas e normalizadas (para massa muscular) de infiltração gordurosa para determinar a quantidade absoluta de lipídio ou porcentagem de lipídio em relação ao volume muscular para fornecer uma medida de desfecho mais significativa. Além disso, espera-se que esta técnica seja amplamente aplicável a modelos animais maiores e biópsias humanas, mas isso pode exigir otimização para cada nova aplicação. Em segundo lugar, nessa estratégia, todo o músculo deve ser dedicado a esse ensaio e não pode ser usado para avaliar outra característica patológica. Estudos que visam avaliar alterações longitudinais no IMAT são mais bem servidos com técnicas de imagem não invasivas e estudos cujo objetivo primário requer o músculo para outros fins (histologia, reação em cadeia da polimerase quantitativa, western blotting) são mais bem servidos pela avaliação histológica, pois o restante do músculo congelado pode ser alocado para outros ensaios. No entanto, esse ensaio é adequado para parear com testes in vivo, como corrida em esteira ou teste contrátil ex vivo , uma vez que essas medidas podem ser feitas antes da decelularização44. Em terceiro lugar, embora o uso da coloração de BODIPY com microscopia confocal proporcione visualização e quantificação de alta resolução de gotículas lipídicas, não é possível identificar conclusivamente gotículas lipídicas como adipócitos individuais, pois a membrana celular é removida e proteínas endógenas de adipócitos são perdidas. Os adipócitos multiloculares, representando adipócitos imaturos ou fenótipo "marrom/bege", podem ser identificados como múltiplas gotículas lipídicas. Finalmente, o protocolo não funciona bem no músculo previamente congelado. Essas limitações são provavelmente mais profundas para biópsias humanas, pois embora toda a biópsia possa ser decelularizada, a distribuição espacial do IMAT na biópsia provavelmente não é mais representativa de todo o músculo do que um corte histológico. No entanto, como essa técnica é relativamente insensível a condições de manuseio de biópsia não congelada (por exemplo, horas em gelo em PBS), a biópsia poderia ser dividida posteriormente para vários ensaios, incluindo uma porção para decelularização, o que proporcionaria uma melhor resolução de gotículas lipídicas individuais.

Em conclusão, um novo método para análise qualitativa e quantitativa da infiltração gordurosa no músculo esquelético foi desenvolvido por meio da coloração e obtenção de imagens do lipídio retido de construtos decelularizados. Essa metodologia oferece melhorias em relação às abordagens padrão-ouro, na medida em que permite imagens abrangentes da infiltração gordurosa tridimensional no músculo e quantificação rápida e barata com coloração ORO. Para medidas mais detalhadas, uma segunda coloração BODIPY lipossolúvel fornece uma quantificação mais detalhada do número, volume e padrão de distribuição de gotículas lipídicas, conforme imageado por microscopia confocal. Juntas, essas medidas fornecem aos pesquisadores uma maneira de medir precisamente a infiltração gordurosa do músculo esquelético no nível das gotículas lipídicas individuais sem amostragem ou imagens não invasivas caras.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por R01AR075773 ao GAM.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe FilterFisher ScientificSLGP033RS
1 mL LuerLock SyringesFisher Scientific14823434
12 mm CoverslipsFisher Scientific12545F
12 well platesFisher Scientific08-772-29
24 well platesFisher Scientific08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol)Sigma AldrichI95160.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde SolutionSigma Aldrich8187081000
40 µm Mesh FilterFisher Scientific87711
6 well platesFisher Scientific08-772-1B
96 well platesFisher Scientific08-772-2C
BODIPY 493/503Fisher ScientificD-3922
C57BL/6J MiceJackson Laboratory000664
Confocal Imaging DishVWR734-2905
Confocal MicroscopeLeicaTCS SPEII
Dissecting/stereo MicroscopeZeiss4107009123001000
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11254-20
EthanolFisher Scientific033361.K2
ImageJNIH
MatlabMathworks
Oil Red O PowderSigma AldrichO0625
Plate readerBio-tekSynergy II 
Rocker/ShakerReliable Scientific55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma AldrichL37711% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettesFisher Scientific137119D
Vannas spring scissorsFine Science Tools15000-00

Referências

  1. Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
  2. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
  4. Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
  5. Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
  6. Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
  7. Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  8. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  9. Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
  10. Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
  11. Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
  12. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
  13. Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
  14. Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
  15. Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
  16. Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
  17. Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
  18. Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
  19. Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
  20. Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
  22. Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
  23. Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
  24. Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
  25. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
  26. Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
  27. Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
  28. Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
  29. Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
  30. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  31. Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
  32. Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
  33. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  34. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
  35. Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
  36. Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  37. Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
  38. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
  39. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  40. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  41. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  42. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  43. Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
  44. Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).

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