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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente studio descrive metodologie basate sulla decellularizzazione per la visualizzazione e la quantificazione della deposizione di tessuto adiposo intramuscolare (IMAT) attraverso il volume muscolare intatto, nonché la quantificazione delle metriche dei singoli adipociti che compongono l'IMAT.

Abstract

L'infiltrazione grassa è l'accumulo di adipociti tra le miofibre nel muscolo scheletrico ed è una caratteristica importante di molte miopatie, disturbi metabolici e distrofie. Dal punto di vista clinico nelle popolazioni umane, l'infiltrazione di grasso viene valutata utilizzando metodi non invasivi, tra cui la tomografia computerizzata (TC), la risonanza magnetica per immagini (MRI) e l'ecografia (US). Sebbene alcuni studi abbiano utilizzato la TC o la risonanza magnetica per quantificare l'infiltrazione di grasso nel muscolo del topo, i costi e l'insufficiente risoluzione spaziale rimangono impegnativi. Altri metodi per piccoli animali utilizzano l'istologia per visualizzare i singoli adipociti; Tuttavia, questa metodologia soffre di bias di campionamento in patologie eterogenee. Questo protocollo descrive la metodologia per visualizzare qualitativamente e misurare quantitativamente l'infiltrazione grassa in modo completo in tutto il muscolo intatto del topo e a livello dei singoli adipociti utilizzando la decellularizzazione. Il protocollo non è limitato a specifici muscoli o specie specifiche e può essere esteso alla biopsia umana. Inoltre, le valutazioni qualitative e quantitative lorde possono essere effettuate con attrezzature di laboratorio standard a basso costo, rendendo questa procedura più accessibile a tutti i laboratori di ricerca.

Introduzione

L'accumulo di adipociti tra le miofibre all'interno del muscolo scheletrico è una caratteristica prominente di condizioni disparate, dal diabete di tipo 2 alla sarcopenia alle lesioni muscoloscheletriche 1,2,3,4,5,6,7. La valutazione completa di questo tessuto adiposo intramuscolare (IMAT) è fondamentale per comprendere la patogenesi di queste condizioni, poiché la deposizione di IMAT è fortemente correlata con l'insulino-resistenza 3,8,9,10 e la scarsa funzione del muscolo scheletrico 11,12,13,14,15 . Sebbene queste associazioni siano state notate per decenni, i meccanismi associati e l'origine dell'IMAT rimangono ancora un'area di intensa indagine. Ciò è in parte dovuto al fatto che la maggior parte degli studi che valutano l'infiltrazione di grasso nel muscolo scheletrico sono stati eseguiti nell'uomo, dove le indagini meccanicistiche sono limitate16,17. Tuttavia, più recentemente, sono stati utilizzati modelli animali di piccole dimensioni, compresi i topi, per aiutare a individuare la regolazione cellulare dello sviluppo e della segnalazione IMAT18,19,20. Questo lavoro mira a fornire un nuovo strumento per l'uso con modelli animali di piccole dimensioni per visualizzare e quantificare qualitativamente l'infiltrazione di grasso del muscolo scheletrico.

Dal punto di vista clinico, nelle popolazioni umane, l'infiltrazione di grasso viene valutata utilizzando metodi non invasivi, tra cui la tomografia computerizzata (TC)6,21, la risonanza magnetica per immagini (MRI)16,17,22,23 e l'ecografia (US)17,24. Queste tecniche di imaging in genere identificano una regione di interesse definita (ROI) in un muscolo e acquisiscono sezioni di immagine all'interno di quella regione, sebbene siano stati impiegati anche approcci completi25,26,27. Queste sezioni di immagine sono sottoposte a gradazione qualitativa6 e quantificate tramite la soglia dei pixel28. Approcci simili sono stati utilizzati in precedenza negli animali 29,30; Tuttavia, sono costosi e richiedono l'accesso a sistemi di imaging per piccoli animali. Anche la risoluzione spaziale tramite l'uso di TC e RM presenta un problema importante, in quanto non sono in grado di delineare gli adipociti IMAT dalle fibre muscolari scheletriche all'interno di un voxel e si basano invece sulla separazione soggettiva delle regioni principalmente muscolari e principalmente delle regioni IMAT31,32. In quanto tale, l'incapacità di identificare con precisione il tessuto adiposo o muscolare presenta anche una quantificazione imprecisa delle quantità rappresentative di questi tessuti.

A causa di queste limitazioni, le attuali tecniche per valutare l'infiltrazione di grasso del muscolo scheletrico in modelli di piccoli animali si basano più comunemente sull'istologia come alternativa economica e accessibile33,34. Le procedure di colorazione standard, tra cui l'ematossilina e l'eosina (H&E), l'olio rosso O (ORO) e l'immunocolorazione per i marcatori degli adipociti come la perilipina, consentono un semplice rilevamento e visualizzazione degli adipociti che comprendono l'infiltrazione grassa all'interno del muscolo. Tuttavia, gli approcci istologici sono raramente completi e, in genere, la valutazione qualitativa o quantitativa IMAT è limitata a una singola sezione34. L'estrazione lipidica è stata utilizzata anche per quantificare i lipidi muscolari totali35; tuttavia, questa tecnica non riesce a distinguere tra depositi di lipidi intramiocellulari (IMCL) e di tessuto adiposo intramuscolare (IMAT)36. In sintesi, le attuali metodologie per visualizzare e quantificare il grasso nel muscolo rimangono limitate dai costi finanziari o dal rilevamento specifico dell'IMAT.

In questo articolo, descriviamo un metodo dettagliato per valutare l'infiltrazione di grasso del muscolo scheletrico sia mediante visualizzazione qualitativa che quantificazione multiscala. Questa metodologia impiega una semplice tecnica di decellularizzazione che rimuove le strutture miocellulari, incluso l'IMCL, ma mantiene intatte le goccioline lipidiche derivate dagli adipociti IMAT più grandi. La convalida della specificità di questa tecnica è stata pubblicata37, incluso l'utilizzo dell'estrazione lipidica per mostrare la deplezione di IMCL con la decellularizzazione, μCT per mostrare la ritenzione del pattern IMAT con la decellularizzazione e l'istologia per mostrare la distribuzione dimensionale simile delle goccioline lipidiche IMAT rispetto a quelle identificate con la decellularizzazione. Una volta decellularizzati, i muscoli possono essere colorati con coloranti liposolubili per la visualizzazione qualitativa del pattern e dell'entità dell'infiltrazione grassa e/o l'imaging quantitativo delle singole goccioline lipidiche IMAT. I coloranti possono essere successivamente estratti con isopropanolo e la densità ottica (OD) della soluzione risultante può essere utilizzata per stimare il volume lipidico IMAT. La convalida rigorosa di questa tecnica è stata pubblicata altrove37. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per utilizzare questa metodologia con i muscoli del topo e fornisce suggerimenti per la risoluzione dei problemi per supportare l'adozione di questo metodo in altre applicazioni, come i muscoli di altre specie o altri tessuti.

Protocollo

La cura e il sacrificio dei topi sono stati eseguiti in conformità con la Guida del National Institutes of Health per l'uso e la cura degli animali da laboratorio. Tutto il lavoro è stato approvato dall'Animal Studies Committee della Washington University nella St. Louis School of Medicine. Per generare le immagini di esempio incluse in questo protocollo sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 2 e 3 mesi (vedi Tabella dei materiali). Tutti i passaggi descritti di seguito vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Decellularizzazione muscolare

  1. Preparare una soluzione all'1% p/v di sodio dodecilsolfato (SDS; vedere Tabella dei materiali) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Mescolare la soluzione fino a completa miscelazione.
    NOTA: La SDS all'1% può essere preparata alla rinfusa e conservata a temperatura ambiente per 1 mese.
  2. Sezionare il/i muscolo/i di interesse come descritto in precedenza38,39.
    1. Esporre i muscoli di interesse bagnando i capelli e la pelle con una soluzione di etanolo al 70%, quindi praticando un'incisione transcutanea di circa 2 cm seguita dalla rimozione della pelle di copertura con pinze e forbici a molla.
      NOTA: I muscoli di interesse qui includono il tibiale anteriore (TA), l'estensore lungo delle dita (EDL) e il diaframma. Alcuni muscoli possono trovarsi in profondità in un'altra muscolatura, richiedendo la dissezione di altri muscoli (ad esempio, la dissezione dell'EDL richiede la rimozione dell'AT).
    2. Sezionare il muscolo o i muscoli di interesse usando forbici o lame affilate (vedi Tabella dei materiali) per assicurarsi che l'intera estensione del muscolo sia ottenuta e che i bordi siano lisci.
      NOTA: Questa operazione viene idealmente eseguita al microscopio da dissezione per migliorare la visualizzazione.
    3. Ispeziona i muscoli per assicurarti che non siano inclusi scheggiature ossee o bordi frastagliati, quindi tagliali via con forbici affilate secondo necessità.
    4. Pesare il muscolo utilizzando una bilancia analitica e registrare il peso.
  3. Posizionare il muscolo sezionato in almeno 0,1 mL di SDS all'1% per milligrammo di peso; Le piastre a 6, 12 o 24 pozzetti funzionano bene rispettivamente per i muscoli del diaframma, dell'AT e dell'EDL del topo. I volumi tipici sono di 6 mL, 3 mL e 1,5 mL per piastre a 6, 12 e 24 pozzetti, rispettivamente.
    NOTA: La soluzione SDS a volte provoca la deformazione dei muscoli, quindi assicurarsi che il muscolo sia piatto/esteso all'immersione iniziale.
  4. Posizionare la piastra del pozzetto (o altri recipienti) su uno scuotitore oscillante impostato a 50-80 Hz.
  5. Ispezionare visivamente periodicamente la soluzione SDS. Quando la soluzione diventa torbida, rimuovere la soluzione con una pipetta (facendo attenzione a non aspirare il muscolo) e sostituirla con un volume uguale di SDS fresca all'1%. Quando la soluzione rimane limpida per 24 ore, la decellularizzazione è completa.
    NOTA: La frequenza richiesta per i cambi di soluzione varia in base alle dimensioni del muscolo e al volume iniziale della soluzione. I muscoli più grandi come l'AT hanno bisogno di una nuova SDS entro poche ore e i muscoli più piccoli come l'EDL possono andare durante la notte nella soluzione originale.
  6. Rimuovere la soluzione SDS finale dai muscoli decellularizzati con una pipetta (facendo attenzione a non aspirare il muscolo) e sostituirla con un volume uguale di PBS.
  7. Ispeziona visivamente i muscoli decellularizzati con un microscopio da dissezione e usa pinze e forbici per rimuovere eventuali peli o detriti attaccati al muscolo.
    NOTA: Inoltre, notare la chiarezza del muscolo decellularizzato in questo passaggio. Se il muscolo decellularizzato non è completamente trasparente e la soluzione SDS non aumenta di nuvolosità nell'arco di 24 ore, allora la decellularizzazione non è stata efficiente. Questo crea un artefatto nelle valutazioni qualitative e quantitative, e quindi la decellularizzazione dovrebbe sempre essere ottimizzata sui campioni di pratica prima di procedere con i muscoli sperimentali.
  8. Rimuovere con cautela il PBS, sostituirlo con un volume uguale di soluzione di formaldeide al 3,7% o di paraformaldeide al 4% e rimettere la piastra nello scuotitore oscillante per 24 ore.
    NOTA: Assicurarsi che la soluzione di formaldeide copra completamente il muscolo decellularizzato, altrimenti la colorazione sarà irregolare.

2. Visualizzazione dell'IMAT con olio rosso O

  1. Preparare una soluzione di ORO.
    1. Sciogliere 0,5 g di polvere di ORO (vedi Tabella dei Materiali) in 100 mL di isopropanolo per generare una soluzione madre.
      NOTA: Aggiungere calore delicato alla soluzione per scioglierla completamente. Questo stock può essere conservato a temperatura ambiente per 1 mese.
    2. Combinare la soluzione madre ORO e l'acqua deionizzata in un rapporto 60:40 per ottenere la soluzione di lavoro necessaria per tutti i muscoli utilizzando un volume di almeno 0,1 ml/mg di peso muscolare. I volumi tipici sono di 6 mL, 3 mL e 1,5 mL per piastre a 6, 12 e 24 pozzetti, rispettivamente.
      NOTA: Ispezionare la soluzione madre prima della miscelazione. Se la soluzione madre contiene una notevole quantità di particolato, preparare brodo fresco.
    3. Coprire la soluzione di lavoro per 10 minuti per consentire al particolato di depositarsi.
    4. Filtrare la soluzione di lavoro attraverso una rete da 40 μm, seguita da un filtro a siringa da 0,22 μm.
      NOTA: Il filtro della siringa da 0,22 μm si intasa rapidamente e deve essere sostituito se la soluzione di lavoro non penetra facilmente.
  2. Rimuovere la soluzione di formaldeide o paraformaldeide e lavare i muscoli decellularizzati con tre cambi di soluzione di uguale volume di PBS.
  3. Sostituire il PBS con un volume uguale di soluzione di isopropanolo al 60% e incubare su un agitatore a dondolo per 5 minuti.
  4. Sostituire la soluzione di isopropanolo al 60% con la soluzione di lavoro ORO e incubare sull'agitatore a dondolo per 10 minuti.
    NOTA: Assicurarsi che la soluzione di lavoro ORO copra completamente il muscolo decellularizzato, altrimenti la colorazione sarà irregolare.
  5. Sostituire la soluzione di lavoro ORO con un volume uguale di SDS all'1%. Ispezionare visivamente periodicamente la soluzione SDS. Quando la soluzione diventa visibilmente rosa, rimuovere la soluzione con una pipetta (facendo attenzione a non aspirare il muscolo) e sostituirla con SDS fresca all'1%.
  6. Quando la soluzione rimane limpida per 24 ore, sostituire la SDS all'1% con PBS e ispezionare il muscolo colorato con un microscopio da dissezione/stereoscopio con ingrandimento 4x. Rimuovere eventuali detriti o particolato evidenti attaccati all'esterno del muscolo. Se questo è esteso, il muscolo decellularizzato può essere fatto rotolare delicatamente su un fazzoletto di pulizia per rimuovere i detriti/particolato.
  7. Se la colorazione è soddisfacente (sfere rosso vivo che fluttuano in una matrice trasparente), acquisire le immagini della colorazione come desiderato utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Se il microscopio da dissezione non dispone di una fotocamera collegata, è possibile utilizzare una fotocamera del telefono per scattare foto attraverso l'oculare.

3. Visualizzazione delle goccioline lipidiche IMAT con BODIPY

NOTA: L'imaging confocale è più efficace con muscoli sottili come l'EDL o il diaframma (~2 mm di spessore). In alternativa, è possibile utilizzare strisce muscolari di spessore comparabile come l'AT.

  1. Preparare una soluzione 1:200 di BODIPY 493/503 fluorescente (vedere Tabella dei materiali) in PBS per ottenere un volume di soluzione di lavoro di almeno 0,1 mL/mg di peso muscolare. I volumi tipici sono di 6 mL, 3 mL e 1,5 mL per piastre a 6, 12 e 24 pozzetti, rispettivamente.
  2. Rimuovere la formaldeide, la paraformaldeide o l'1% di SDS e lavare i muscoli decellularizzati con tre cambi di soluzione di un volume uguale di PBS.
  3. Sostituire il PBS con la soluzione di lavoro BODIPY e incubare sull'agitatore oscillante per 20 minuti.
  4. Lavare i muscoli decellularizzati con tre cambi di soluzione di un uguale volume di PBS.
  5. Posizionare il muscolo in un recipiente a fondo chiaro compatibile con un microscopio confocale disponibile. Idealmente, la parabola avrà un fondo incassato per posizionare un vetrino coprioggetti sul muscolo senza deformarlo (vedi Tabella dei materiali).
  6. Ottenere pile di immagini con un microscopio confocale standard (vedere la tabella dei materiali) utilizzando il laser 488. Le dimensioni tipiche della pila per una EDL sono 0,5-1 mm con uno spessore della fetta di 10 μm, producendo 50-100 immagini per pila.
    NOTA: Per quantificare il volume lipidico totale, il numero totale di goccioline lipidiche IMAT e l'indice di clustering del vicino più vicino, visualizzare l'intero volume muscolare, facendo attenzione a lasciare una certa sovrapposizione per la registrazione dell'immagine. Per quantificare il volume medio delle goccioline lipidiche, può essere sufficiente una pila.
  7. Se lo si desidera, colorare i muscoli con ORO, come da sezione 2, per un'immagine complementare dell'intero muscolo della distribuzione IMAT.
    NOTA: Poiché BODIPY è fluorescente, non sarà visibile al microscopio ottico quando vengono acquisite le immagini di ORO.

4. Stima del volume lipidico totale mediante estrazione lipidica

  1. Dopo l'acquisizione dell'immagine, trasferire i muscoli a 200 μL di isopropanolo in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, oppure adattare il pozzetto/volume se il muscolo è troppo grande per adattarsi.
  2. Agitare la soluzione picchiettando la piastra, pipettando la soluzione su e giù e/o schiacciando meccanicamente il muscolo con la punta di una pipetta fino a quando non si vedono sfere rosse/fluorescenti nel muscolo decellularizzato al microscopio.
    NOTA: Trattare tutti i muscoli con la stessa combinazione di picchiettamento, pipettaggio e schiacciamento per la massima affidabilità. Inoltre, fai attenzione a limitare il tempo impiegato per picchiettare, pipettare e frantumare, poiché l'isopropanolo evaporerà rapidamente.
  3. Miscelare la soluzione in ciascun pozzetto pipettando su e giù, quindi trasferire 75 μL in due pozzetti puliti della piastra.
  4. Coprire la piastra e leggere l'assorbanza dei pozzetti duplicati da 75 μL utilizzando uno spettrofotometro o un lettore di piastre. Se il costrutto è stato colorato con ORO, leggere la soluzione a 500 nm; se è stato colorato con BODIPY 493/503, leggere la piastra a 493 nm.
    NOTA: Se il costrutto è stato colorato sia con BODIPY che con ORO, si consiglia di leggere la piastra a 500 nm, poiché le letture a 500 nm danno risultati simili tra i costrutti colorati solo con ORO e ORO più BODIPY.
  5. Se lo si desidera, dividere la lettura dell'assorbanza per il peso registrato del muscolo per correggere le differenze di dimensioni tra i campioni.

5. Quantificazione delle metriche delle goccioline lipidiche IMAT da immagini confocali

NOTA: questa sezione richiede l'accesso a ImageJ versione 1.47 (vedere Tabella dei materiali) o successiva e le competenze di base di ImageJ40.

  1. Aprire gli stack confocali in ImageJ.
    NOTA: Diversi microscopi confocali possono salvare le immagini confocali in formati diversi. ImageJ potrebbe richiedere un plug-in o una variante aggiuntiva, come Fiji, per aprire gli stack41. Gli algoritmi utilizzati fanno parte del pacchetto software ImageJ.
  2. Eseguire un algoritmo di soglia in ImageJ per identificare i pixel positivi BODIPY. In questo modo l'immagine corrente viene convertita in un'immagine binaria.
    1. Aprire l'interfaccia utente della soglia selezionando Immagine > Regola > soglia. Nell'interfaccia utente, selezionare Intermode come tipo di soglia e verificare che sia selezionata l'opzione Sfondo scuro . Non è necessario selezionare altre opzioni. Quindi fare clic su Applica.
    2. Viene visualizzata una finestra di dialogo per convertire lo stack in binario. Assicurarsi che siano selezionate le seguenti opzioni: Metodo: Intermodalità; Sfondo: scuro. Calcola la soglia per ogni immagine e sfondo nero (delle maschere binarie). Questo genera uno stack binario, dove il bianco indica i pixel positivi BODIPY e il nero indica i pixel negativi BODIPY.
      NOTA: l'algoritmo di soglia Intermodes potrebbe non essere la scelta migliore per tutti gli utenti. L'ispezione soggettiva delle opzioni di soglia integrate di ImageJ aiuta a selezionare l'algoritmo ottimale per separare i pixel positivi e negativi di BODIPY.
  3. Eseguire l'algoritmo Watershed in ImageJ per separare le goccioline lipidiche che si toccano. Selezionare Elabora > Bacino idrografico > binario. Viene visualizzata una finestra di dialogo in cui viene chiesto se devono essere elaborate tutte le immagini della pila. Selezionare Sì. In questo modo si aggiungono sottili linee nere che dividono aree più ampie di bianco pieno.
  4. Identifica le ROI con l'algoritmo Analyze Particles in ImageJ.
    1. Selezionare Analizza > Analizza particelle. Viene visualizzata una finestra di dialogo per impostare le impostazioni di selezione.
      NOTA: La selezione dell'intervallo di dimensioni è fondamentale per ottenere la migliore stima del ROI delle goccioline lipidiche. Il limite inferiore elimina le regioni che sono probabilmente troppo piccole per essere goccioline lipidiche derivate da IMAT (artefatto di fondo) e il limite superiore elimina le regioni che sono probabilmente troppo grandi per essere singole goccioline lipidiche derivate da IMAT (toccando goccioline lipidiche che non sono state separate dall'algoritmo Watershed).
    2. Per impostare questi valori, aprite l'immagine originale e delineate la gocciolina lipidica più piccola e più grande in vista utilizzando lo strumento Ovale. Quindi, aggiungi queste forme al gestore ROI digitando "t". Selezionare Analizza, quindi Imposta misurazioni. Viene visualizzata una finestra di dialogo per la selezione delle impostazioni.
      1. Selezionare Solo area e fare clic su OK. Quindi, seleziona Misura da Gestione ROI. Utilizzare le due misure di area di questa finestra Risultati come intervallo di dimensioni in Analizza particelle.
    3. Assicurati che l'opzione Aggiungi a Manager sia selezionata. Non sono necessarie altre opzioni.
  5. Sovrapponi le ROI allo stack confocale selezionando Mostra tutto in Gestione ROI. Utilizzare la barra di scorrimento per ispezionare singolarmente ogni sezione dello stack e aggiungere manualmente le aree mancanti utilizzando lo strumento Ovale (disponibile nella barra degli strumenti ImageJ).
  6. Genera le misurazioni del ROI. Selezionare Analizza > Imposta misure e selezionare Area, Centroide, Adatta ellisse e Posizione pila. Fare clic su OK. Quindi, seleziona Misura da Gestione ROI. I dati nella tabella Risultati possono essere selezionati e copiati in Matlab o Excel per ulteriori analisi.
  7. Perfeziona le ROI in ogni stack in un singolo ROI utilizzando il codiceMatlab Refine.m 37 o un algoritmo simile.
    NOTA: Questo passaggio è necessario in quanto i passaggi 5.2-5.4 identificano la stessa gocciolina lipidica in fette adiacenti come ROI distinte. Tuttavia, in alternativa, i ROI possono essere identificati solo a mano, oppure i ROI duplicati possono essere eliminati manualmente in ImageJ per evitare la necessità di Matlab.
  8. Ottieni le statistiche di riepilogo nel ROI utilizzando Matlab o Excel.
    1. Stimare il numero totale di goccioline lipidiche come numero totale di ROI.
    2. Stimare il volume delle goccioline lipidiche come il volume dell'ellisse adattata a ciascun ROI 2D, assumendo che la profondità della forma sia la media degli assi maggiore e minore dell'ellisse.
    3. Stimare il volume lipidico totale, che è la somma dei singoli volumi stimati delle goccioline lipidiche.

Risultati Rappresentativi

Visualizzazione qualitativa dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico
I muscoli propriamente decellularizzati sono bianchi e semitrasparenti (sezione 1; Figura 1). Quando i muscoli decellularizzati vengono colorati con ORO per visualizzare l'IMAT (sezione 2), le goccioline lipidiche IMAT sono evidenti all'interno delle strutture muscolari chiare come sfere rosse (Figura 1). I muscoli sani degli arti posteriori del topo hanno poco IMAT naturale, evidenziato da pochi o nessun lipide rosso positivo per ORO (Figura 1A). In confronto, i muscoli degli arti posteriori iniettati con cardiotossina (CTX; Figura 1B) o glicerolo (GLY; Figura 1C) 14 giorni prima della decellularizzazione hanno un aumento dell'accumulo di IMAT, con una maggiore concentrazione di IMAT dopo CTX rispetto a GLY come precedentemente notato37.

La decellularizzazione incompleta può essere identificata immediatamente dopo il trattamento SDS iniziale o dopo il dilavamento della colorazione ORO come fibre semi-opache, rosa chiaro (Figura 2B rispetto alla Figura 2A). La clearance incompleta di ORO può essere identificata dopo il washout di ORO come uno sfondo uniforme rosa o rosso, piuttosto che linee di fibre distinte (Figura 2C). La Figura 2A,B contiene anche il tessuto adiposo epimuscolare (asterischi), un grumo di goccioline lipidiche al di fuori del muscolo decellularizzato. La Figura 2C mostra anche il ripiegamento muscolare che può verificarsi se i muscoli non sono sparsi durante la decellularizzazione. La decellularizzazione incompleta, la clearance incompleta di ORO e il tessuto adiposo epimuscolare residuo aumentano di fatto l'OD del lipide estratto, ma non impediscono necessariamente la valutazione qualitativa dell'infiltrazione grassa se sono riconosciuti come artefatti.

Imaging quantitativo dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico
Le goccioline lipidiche marcate con fluorescenza BODIPY possono essere visualizzate tramite microscopia confocale per una valutazione più dettagliata delle metriche e della distribuzione delle singole goccioline lipidiche (Figura 3). Questo processo è semi-automatizzato, come descritto in precedenza, incluso il codice Matlab37. Una buona colorazione BODIPY si traduce in forme ellittiche luminose delineate da forme vicine quando vengono visualizzate in piano (Figura 3A). La definizione delle soglie e la segmentazione della forma forniscono un buon primo passaggio per generare ROI per ogni gocciolina lipidica (Figura 3B), ma sono necessarie modifiche manuali per correggere gli errori. L'errore più pervasivo sono le goccioline lipidiche che si trovano in profondità nel tessuto e quindi non sono luminose su nessuna fetta (Figura 3B; doppie frecce rosa). È possibile risolvere questo problema aggiungendo manualmente le ROI utilizzando lo strumento Ovale in ImageJ (Figura 3C). Il secondo consiste nell'identificare un gruppo di goccioline lipidiche come un singolo ROI (Figura 3B; asterisco rosso). Questo problema può essere corretto eliminando e sostituendo la ROI originale con più nuove ROI (Figura 3D). Infine, una singola gocciolina lipidica viene identificata come una ROI unica in più sezioni, quindi le ROI duplicate devono essere consolidate in un'unica ROI (Figura 3E; freccia blu). Questo viene fatto più facilmente utilizzando uno strumento di elaborazione dati come Matlab, ma potrebbe anche essere fatto a mano identificando il ROI maggiore ed eliminando il resto. I valori medi per ogni metrica nel topo C57BL6/J e 129Sv possono essere trovati in Biltz et al.37.

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Figura 1: Esempio di colorazione con olio rosso O (ORO) di muscoli decellularizzati. Muscoli colorati con ORO 14 giorni dopo l'iniezione con soluzione fisiologica (SAL), cardiotossina (CTX) o glicerolo (GLY). I muscoli estensori lunghi delle dita (EDL) e tibiali anteriori (TA) del topo hanno poco IMAT (sfere rosse) con il trattamento SAL (A), ma accumulano IMAT in risposta al trattamento CTX (B) e GLY (C). C'è una completa decellularizzazione e washout di ORO, evidenziato da distinte goccioline lipidiche positive di ORO in uno sfondo muscolare bianco trasparente. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esempi di scarsi risultati di colorazione ORO. La decellularizzazione incompleta o la clearance incompleta di ORO portano a uno sfondo rosa/rosso semi-opaco. Rispetto allo sfondo bianco trasparente del muscolo diaframma di topo completamente decellularizzato (A), la decellularizzazione incompleta è caratterizzata da tracce di fibre rosa/rosse chiare (B) e la clearance incompleta di ORO è caratterizzata da uno sfondo rosa/rosso diffuso (C). Barre della scala: pannelli superiori = 1 mm; pannelli inferiori = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Esempi di identificazione di singole goccioline lipidiche con colorazione fluorescente BODIPY e microscopia confocale Le singole goccioline lipidiche colorate con BODIPY possono essere identificate e quantificate nei muscoli decellularizzati utilizzando la microscopia confocale. Le singole fette attraverso una pila confocale mostrano le goccioline lipidiche nel piano come ellissi verde brillante e le goccioline lipidiche fuori dal piano come forme più deboli (A; frecce blu). La soglia combinata con la segmentazione degli oggetti spartiacque e l'identificazione del ROI può mappare le ROI colorate con BODIPY (B). La soglia può mancare alcune goccioline lipidiche più deboli (B; doppia freccia rosa), che richiedono l'identificazione manuale (C). La segmentazione dei bacini idrografici può raggruppare diverse goccioline lipidiche insieme (B; asterisco rosso), richiedendo la cancellazione del ROI e la ristima manuale (D). La stessa gocciolina lipidica viene identificata in più sezioni che richiedono la registrazione dell'immagine (E) per eliminare le ROI duplicate. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo manoscritto descrive metodi per visualizzare e quantificare qualitativamente l'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico in modelli animali di piccole dimensioni che possono essere applicati per comprendere ulteriormente la patogenesi dello sviluppo e dell'espansione patologica del tessuto adiposo intramuscolare (IMAT). L'uso della decellularizzazione dell'intero muscolo e della colorazione liposolubile consente una metodologia economica, riproducibile e semplice per valutare in modo completo la presenza di IMAT nei muscoli interi.

La base di questo protocollo è che la decellularizzazione del muscolo con SDS rimuove i componenti cellulari delle miofibre, comprese le piccole goccioline lipidiche dell'IMCL, ma risparmia le grandi goccioline lipidiche negli adipociti intramiocellulari. La SDS è stata ampiamente utilizzata42 nell'ingegneria tissutale per decellularizzare le matrici. I tessuti come il muscolo adiposo e scheletrico richiedono in genere un'ulteriore dissociazione meccanica e/o l'estrazione di alcol per rimuovere il lipide adipocitario residuo42,43. Abbiamo precedentemente dimostrato che ciò è dovuto al fatto che, mentre la decellularizzazione con SDS elimina l'IMCL, risparmia la grande gocciolina lipidica negli adipociti37. L'imaging del muscolo intatto colorato con tetrossido di osmio prima e dopo la decellularizzazione con μCT ha verificato che il modello spaziale di IMAT non è stato interrotto dalla decellularizzazione. Inoltre, la quantificazione intramuscolare dei trigliceridi in un muscolo decellularizzato con IMAT trascurabile era ~5% dei valori muscolari intatti, verificando la rimozione di IMCL. Pertanto, questa metodologia mantiene le goccioline lipidiche IMAT nella loro distribuzione anatomica originale attraverso una matrice muscolare semitrasparente.

La corretta decellularizzazione è la fase più critica di questo protocollo. Se la decellularizzazione è incompleta, le goccioline lipidiche IMAT saranno difficili da visualizzare e l'IMCL residuo causerà un'elevata colorazione di fondo con ORO o BODIPY (Figura 2). Gli errori più comuni da parte di utenti inesperti sono l'inadeguata copertura SDS per muscolo (all'interno di ciascun pozzetto), in modo tale che ogni muscolo non sia completamente coperto dalla soluzione SDS, il mancato utilizzo di un bilanciere per agitare la soluzione durante la decellularizzazione e la mancata esecuzione di cambi di soluzione abbastanza frequentemente. In questo manoscritto, abbiamo raccomandato la quantità di SDS necessaria per unità di massa muscolare, ma l'utente dovrà comunque assicurarsi che i muscoli siano completamente coperti dalle soluzioni, poiché ogni muscolo ha una geometria unica. Si consiglia inoltre agli utenti di modificare liberamente le soluzioni (fino a due volte al giorno) per garantire che la decellularizzazione sia completa. La colorazione di buona qualità delle goccioline lipidiche IMAT è stata ottenuta dopo ben 4 giorni di trattamento SDS. Per ottenere risultati di colorazione ORO di alta qualità, sono importanti anche un'adeguata fissazione e preparazione della soluzione ORO. Analogamente al trattamento SDS sopra descritto, è necessaria un'adeguata copertura della soluzione di formaldeide al 3,7% per ogni campione muscolare. Se il muscolo viene rimosso dal fissativo troppo presto, le goccioline lipidiche si coloreranno solo debolmente con ORO. Un totale di 1-2 ore dovrebbe essere sufficiente, ma si consiglia una fissazione notturna per garantire che il fissativo penetri al centro del muscolo e fissi completamente tutte le goccioline lipidiche. Un'ulteriore sfida con la colorazione ORO è che quando la concentrazione di alcol viene ridotta al 60%, inizia a formarsi un particolato. Questo particolato può depositarsi sulla superficie e rimanere bloccato sul bordo del muscolo. Il modo migliore per evitarlo è creare una nuova soluzione di lavoro per ogni colorazione e utilizzare sia filtri da 40 μm che filtri da 0,22 μm. Quindi, mantenere l'agitazione con il bilanciere e limitare il tempo di colorazione a 10 minuti aiuterà a evitare che il particolato che si forma si depositi. Se il problema persiste, può essere utile preparare una nuova soluzione stock di ORO. Se qualche artefatto rimane attaccato alla superficie muscolare decellularizzata, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio, una pinza e forbici chirurgiche per rimuovere questo artefatto. La mancata eliminazione degli artefatti avrà un impatto sulla qualità dell'immagine dei muscoli e sovrastimerà il contenuto di IMAT durante la porzione di estrazione dei lipidi in preparazione alla lettura dell'OD.

Nel complesso, questa tecnica è semplice e offre diversi vantaggi rispetto ai metodi gold standard per la visualizzazione e la quantificazione dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico. Le tecniche non invasive, come la TC, la risonanza magnetica e l'ecografia, ampiamente utilizzate nell'uomo e talvolta nei modelli animali, hanno una risoluzione spaziale limitata e non sono in grado di distinguere le goccioline lipidiche dalle fibre muscolari. Pertanto, un pixel o voxel di intensità di segnale intermedia viene assegnato come "muscolo" o "grasso", mentre in realtà è probabile che sia un mix di miofibre e adipociti. Più comunemente, l'infiltrazione grassa nel muscolo animale è valutata dall'istologia, più frequentemente dall'ORO nelle criosezioni muscolari. Tuttavia, questo viene in genere eseguito solo in una singola sezione rappresentativa ed è difficile da quantificare a causa della dispersione lipidica sulla sezione. Al contrario, la colorazione ORO di un intero muscolo decellularizzato fornisce una valutazione completa dell'IMAT con costi e sforzi simili a quelli della morfologia intatta. Inoltre, oltre a migliorare la visualizzazione, la colorazione ORO della decellularizzazione consente di quantificare l'infiltrazione di grasso mediante estrazione lipidica. Per un'immersione più approfondita nelle caratteristiche dell'infiltrazione grassa, è possibile utilizzare un colorante fluorescente, BODIPY, in combinazione con la microscopia confocale. Ciò consente la ricostruzione delle singole goccioline lipidiche IMAT per mappare il paesaggio 3D, cosa che non è possibile con l'istologia a meno che le sezioni non vengano analizzate su tutta la lunghezza del muscolo. Sebbene un microscopio confocale non sia un'attrezzatura di laboratorio standard, è più probabile che sia accessibile in un ambiente universitario o industriale rispetto alla risonanza magnetica o alla TC di piccoli animali. Inoltre, gran parte di questo processo può essere automatizzato, riducendo il costo in termini di tempo rispetto all'istologia sequenziale. L'ottimizzazione delle impostazioni del microscopio confocale è un'ulteriore considerazione per la colorazione BODIPY. Questi sono unici per ogni microscopio. Il valore critico è l'intensità del laser, che deve essere sufficientemente alta da rilevare le goccioline lipidiche sulla superficie distante del muscolo senza saturare il segnale delle goccioline lipidiche sul lato vicino. Per questo motivo, si suggerisce che l'uso della colorazione BODIPY con microscopia confocale sia più adatto sui muscoli più sottili, tra cui l'EDL o il diaframma.

Diversi limiti di questo approccio meritano di essere discussi. In primo luogo, mentre si prevede che questa tecnica abbia un'ampia applicabilità al di là dei modelli di lesione (cardiotossina e glicerolo) nei topi qui presentati, nuove applicazioni (ad esempio, il modello MDX) potrebbero richiedere un'ottimizzazione, poiché le dimensioni e la composizione del muscolo (ad esempio, la fibrosi) potrebbero influenzare la decellularizzazione, richiedendo un aumento della concentrazione di SDS o dei tempi di incubazione. Altri modelli di malattia con massa muscolare alterata richiederebbero anche l'analisi delle metriche assolute e normalizzate (alla massa muscolare) dell'infiltrazione grassa per determinare la quantità assoluta di lipidi o la percentuale di lipidi rispetto al volume muscolare per fornire una misura di esito più significativa. Inoltre, si prevede che questa tecnica sarà ampiamente applicabile a modelli animali più grandi e biopsie umane, ma ciò potrebbe richiedere un'ottimizzazione per ogni nuova applicazione. In secondo luogo, in questa strategia, l'intero muscolo deve essere dedicato a questo test e non può essere utilizzato per valutare un'altra caratteristica patologica. Gli studi che mirano a valutare i cambiamenti longitudinali nell'IMAT sono meglio serviti con tecniche di imaging non invasive e gli studi il cui scopo primario richiede il muscolo per altri scopi (istologia, reazione a catena della polimerasi quantitativa, western blotting) sono meglio serviti dalla valutazione istologica, poiché il resto del muscolo congelato può essere assegnato ad altri test. Tuttavia, questo test è adatto per l'abbinamento con test in vivo, come la corsa su tapis roulant, o test contrattili ex vivo , poiché queste misure possono essere effettuate prima della decellularizzazione44. In terzo luogo, sebbene l'uso della colorazione BODIPY con microscopia confocale fornisca una visualizzazione e una quantificazione ad alta risoluzione delle goccioline lipidiche, non può identificare in modo definitivo le goccioline lipidiche come singoli adipociti, poiché la membrana cellulare viene rimossa e le proteine degli adipociti endogeni vengono perse. Gli adipociti multiloculari, che rappresentano adipociti immaturi o un fenotipo "marrone/beige", possono essere identificati come goccioline lipidiche multiple. Infine, il protocollo non funziona bene sul muscolo precedentemente congelato. Queste limitazioni sono probabilmente più profonde per le biopsie umane, poiché mentre l'intera biopsia può essere decellularizzata, la distribuzione spaziale dell'IMAT nella biopsia non è probabilmente più rappresentativa dell'intero muscolo rispetto a una fetta istologica. Tuttavia, poiché questa tecnica è relativamente insensibile alle condizioni di manipolazione della biopsia non congelata (ad esempio, ore di ghiaccio in PBS), la biopsia potrebbe essere suddivisa in seguito per vari saggi, inclusa una porzione per la decellularizzazione, che fornirebbe una migliore risoluzione delle singole goccioline lipidiche.

In conclusione, è stato sviluppato un nuovo metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa dell'infiltrazione grassa del muscolo scheletrico mediante colorazione e imaging dei lipidi trattenuti di costrutti decellularizzati. Questa metodologia offre miglioramenti rispetto agli approcci gold standard, in quanto consente l'imaging completo dell'infiltrazione di grasso tridimensionale all'interno del muscolo e la quantificazione rapida ed economica con la colorazione ORO. Per misure più dettagliate, un secondo colorante BODIPY liposolubile fornisce una quantificazione più dettagliata del numero, del volume e del modello di distribuzione delle goccioline lipidiche, come ripreso dalla microscopia confocale. Insieme, queste misure forniscono ai ricercatori un modo per misurare con precisione l'infiltrazione di grasso del muscolo scheletrico a livello delle singole goccioline lipidiche senza campionamento o costose immagini non invasive.

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da R01AR075773 alla GAM.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe FilterFisher ScientificSLGP033RS
1 mL LuerLock SyringesFisher Scientific14823434
12 mm CoverslipsFisher Scientific12545F
12 well platesFisher Scientific08-772-29
24 well platesFisher Scientific08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol)Sigma AldrichI95160.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde SolutionSigma Aldrich8187081000
40 µm Mesh FilterFisher Scientific87711
6 well platesFisher Scientific08-772-1B
96 well platesFisher Scientific08-772-2C
BODIPY 493/503Fisher ScientificD-3922
C57BL/6J MiceJackson Laboratory000664
Confocal Imaging DishVWR734-2905
Confocal MicroscopeLeicaTCS SPEII
Dissecting/stereo MicroscopeZeiss4107009123001000
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11254-20
EthanolFisher Scientific033361.K2
ImageJNIH
MatlabMathworks
Oil Red O PowderSigma AldrichO0625
Plate readerBio-tekSynergy II 
Rocker/ShakerReliable Scientific55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma AldrichL37711% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettesFisher Scientific137119D
Vannas spring scissorsFine Science Tools15000-00

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