Combinando um Olfatômetro Sincronizado com a Respiração com Simulação Cerebral para Estudar o Impacto dos Odores na Excitabilidade Corticoespinhal e Conectividade Eficaz

Resumo

Este trabalho descreve o uso de um olfatômetro sincronizado com a respiração para desencadear a estimulação magnética transcraniana (EMT) de bobina única e dupla durante a apresentação do odor sincronizada à respiração nasal humana. Essa combinação nos permite investigar objetivamente como odores agradáveis e desagradáveis afetam a excitabilidade corticoespinhal e a conectividade cerebral efetiva em um determinado indivíduo.

Resumo

É amplamente aceito que a estimulação olfatória provoca comportamentos motores, como aproximar-se de odorantes agradáveis e evitar os desagradáveis, em animais e humanos. Recentemente, estudos utilizando eletroencefalografia e estimulação magnética transcraniana (EMT) têm demonstrado uma forte ligação entre o processamento no sistema olfatório e a atividade no córtex motor em humanos. Para melhor compreender as interações entre os sistemas olfatório e motor e superar algumas das limitações metodológicas anteriores, desenvolvemos um novo método combinando um olfatômetro que sincroniza a apresentação em ordem aleatória de odorantes com diferentes valores hedônicos e o disparo da EMT (bobina única e dupla) com as fases da respiração nasal. Este método permite sondar as modulações da excitabilidade corticoespinhal e conectividade ipsilateral efetiva entre o córtex pré-frontal dorsolateral e o córtex motor primário que poderiam ocorrer durante a percepção de odor agradável e desagradável. A aplicação deste método permitirá discriminar objetivamente o valor de agradabilidade de um odorante em um determinado participante, indicando o impacto biológico do odorante na conectividade e excitabilidade efetiva do cérebro. Além disso, isso poderia abrir caminho para investigações clínicas em pacientes com distúrbios neurológicos ou neuropsiquiátricos que podem apresentar alterações hedônicas de odor e comportamentos desadaptativos de evitação de abordagem.

Introdução

É amplamente aceito que a estimulação olfatória provoca reações automáticas e comportamentos motores. Por exemplo, em humanos, a existência de uma resposta motora de evitação (inclinando-se para longe da fonte de odor) ocorrendo 500 ms após o início do odor negativo foi recentemente demonstrada¹. Ao registrar participantes humanos em movimento livre explorando odores emanados de frascos, Chalençon e colaboradores (2022) mostraram que comportamentos motores (ou seja, velocidade de aproximação ao nariz e retirada do frasco contendo o odorante) estão intimamente ligados aos odors hedônicos². Além disso, uma estreita ligação entre o processamento no sistema olfatório e a atividade no córtex motor foi recentemente demonstrada em humanos usando eletroencefalografia¹. Especificamente, aproximadamente 350 ms após o início dos odores negativos, uma dessincronização específica do ritmo mu, conhecida por refletir processos de preparação da ação, foi observada sobre e dentro do córtex motor primário (M1), logo seguida por um movimento comportamental para trás¹. Fortalecendo a ideia de uma relação entre os sistemas olfatório e motor, outro estudo recente mostrou que a exposição a um odorante agradável aumentou a excitabilidade corticoespinhal em comparação com uma condição sem odor³. Neste estudo, a estimulação magnética transcraniana de pulso único (EMTsp) foi aplicada a M1 para evocar um potencial evocado motor (PEmáx) em um músculo alvo da mão, registrado perifericamente com eletromiografia (EMG) durante a percepção do odor. A exposição ao odorante agradável foi proporcionada passivamente por tiras de papel sodden com óleo essencial de bergamota puro e colocadas em um suporte metálico sob o nariz³. Nesse contexto, ainda não está claro se a facilitação da excitabilidade corticoespinhal se deve à estimulação odorante agradável ou a efeitos comportamentais inespecíficos, como cheirar e apertar os dentes ^4,5. Além disso, ainda não se sabe como um odorante desagradável modula a excitabilidade M1 sondada pela EMT.

Em síntese, ressalta-se a necessidade de se desenvolver um método que ofereça as seguintes vantagens em relação às técnicas existentes em estudos^{anteriores3,6}: (1) randomizar a apresentação de diferentes condições de odor (agradável/desagradável/sem odor) dentro de uma mesma fase experimental, (2) sincronizar com precisão a apresentação odorante e o tempo da EMT de acordo com as fases da respiração nasal humana (inspiração e expiração) ao estudar o sistema motor.

A EMT também pode ser utilizada como ferramenta para investigar interações córtico-corticais, também chamadas de conectividade efetiva, entre múltiplas áreas corticais e M1 com alta resolução temporal7,8,9,10,11,12. Aqui, usamos um paradigma de EMT de sítio duplo (EMTd), no qual uma estimulação de primeiro condicionamento (EC) ativa uma área cortical alvo, e uma estimulação de segundo teste (TS) é aplicada sobre M1 usando outra bobina para evocar uma PEmáx. O efeito do EC é avaliado normalizando a amplitude da PEmáx condicionada (condição EMTd) para a amplitude da PEmáx não condicionada (condição ^EMTsp)13. Assim, valores de razão negativa indicam interações corticocorticais supressoras, enquanto valores de razão positiva indicam interações corticocorticais facilitatórias entre as duas áreas estimuladas. O paradigma dsTMS fornece, portanto, uma oportunidade única para identificar a natureza (isto é, facilitatória ou supressiva), a força e as modulações da conectividade efetiva entre a área pré-ativada e M1. É importante ressaltar que as interações corticocorticais refletem um complexo equilíbrio de facilitação e supressão que pode ser modulado em diferentes tempos e estados mentais ou tarefas ^7,14.

Até onde sabemos, o paradigma relativamente novo da dsTMS nunca foi usado para investigar interações córtico-corticais durante a percepção de odor com diferentes valores hedônicos. No entanto, estudos de neuroimagem têm mostrado que a exposição a odorantes agradáveis e desagradáveis induz alterações de conectividade em áreas envolvidas na emoção, tomada de decisão e controle da ação, incluindo a área motora suplementar, o córtex cingulado anterior e o córtex pré-frontal dorsolateral (CPFDL)^15,16. De fato, o CPFDL é um nó chave mediador do controle emocional, do processamento sensorial e de aspectos de alto nível do controle motor, como processos preparatórios 17,18,19. Além disso, estudos em humanos e animais têm fornecido evidências de que o CPFDL possui diversas projeções neuronais para M1 17,18,20,21,22. Dependendo do contexto, essas projeções de CPFD podem facilitar ou inibir a atividade de M1 ^7,19,20. Assim, parece possível que a conectividade efetiva entre o CPFDL e M1 seja modulada durante a apresentação do odor e que odorantes agradáveis e desagradáveis recrutem redes corticais separadas, levando a um efeito diferencial na conectividade DLPFC-M1.

Aqui, propomos um novo método adequado para o estudo metodologicamente rigoroso das modulações da excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva que podem ocorrer durante a percepção de odores agradáveis e desagradáveis, todos entregues em sincronia com a respiração nasal humana.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos nas seções a seguir foram aprovados por um Comitê de Ética (CPP Ile de France VII, Paris, França, número de protocolo 2022-A01967-36) de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da inclusão no estudo.

1. Recrutamento de participantes

1. Critérios de inclusão/exclusão.
   1. Incluir participantes adultos (> 18 anos). Rastrear todos os participantes quanto a qualquer contraindicação à EMT de acordo com as diretrizes internacionais de especialistas²³.
   2. Exclua participantes com dispositivos médicos implantados (por exemplo, implante coclear, marcapasso cardíaco, etc.), história pessoal ou familiar de convulsão, dor de cabeça, trauma cerebral e medicação neuroativa. Excluir participantes considerados "anômicos" de acordo com o Teste Europeu de Capacidades Olfativas²⁴.
2. Lateralidade: Verificar a lateralidade destra avaliada pelo questionário Edinburgh Handedness Inventory²⁵.
   NOTA. É altamente recomendável recrutar apenas participantes destros em estudos que avaliem a excitabilidade corticoespinhal e a conectividade efetiva no sistema motor^26,27.
3. Informação e consentimento informado: Fornecer a todos os participantes informações básicas sobre os objetivos, procedimentos e riscos do estudo aprovados pelo Comitê de Ética e solicitar que assinem o termo de consentimento livre e esclarecido.

2. Procedimento experimental

1. Instalação do paciente: Solicitar ao participante que se sente em uma cadeira confortável (tipo cadeira odontológica) com as duas mãos relaxadas e pronadas. Posicione a cabeça do paricipant sobre um apoio para o queixo para minimizar o movimento da cabeça durante a estimulação.
2. Registros eletromiográficos
   1. Preparar a pele do participante antes da aplicação do eletrodo usando um esfoliante para abrasar levemente as áreas e limpar as áreas com almofadas de álcool onde os eletrodos serão aplicados.
   2. Aplicar dois eletrodos de gravação descartáveis de prata/cloreto de prata com uma montagem ventre-tendão do primeiro músculo interósseo dorsal (IDF). Acrescentar o eletrodo terra ao processo estiloide da ulna (Figura 1).
   3. Conecte os eletrodos ao amplificador com cabos e ao sistema de aquisição de dados.
   4. Grave o sinal EMG usando um sistema de conversão analógico-digital (AD). Amplificar e filtrar sinais EMG (ganho = 1000) usando uma frequência de largura de banda entre 10 Hz e 1 kHz. Digitalize a uma taxa de amostragem de 2.000 Hz e armazene cada arquivo EMG para análise off-line.
   5. Verifique a qualidade do sinal exibido na tela do computador conectado ao sistema de aquisição de dados.
3. Bobina_{TMS posição M1} .
   1. Conecte essa bobina ao estimulador A (Figura 1).
   2. Coloque uma touca apertada sobre a cabeça do participante. Use uma fita métrica para realizar medidas de nasion-ínion, tragus-tragus e perímetro cefálico com base em pontos de referência cranianos padrão. Identificar e marcar com caneta o vértice do couro cabeludo na intersecção das linhas sagital média (nasion-ínion) e interaural (tragus-tragus)²⁸.
   3. Colocar tangencialmente ao couro cabeludo a primeira bobina pequena de oito (diâmetro interno: 40 mm) sobre a área presumida da mão do M1 esquerdo (bobina_M1), que fica 5 cm lateral do vértice, com o cabo apontando para trás e lateralmente em um ângulo de 45° em relação à linha sagital média, resultando em um fluxo de corrente póstero-anterior (forma de onda de corrente monofásica). Esta orientação corresponde a uma corrente induzida máxima fluindo dentro de M1 dentro de M1²⁹.
   4. Garantir que o posicionamento da bobina_M1 seja ideal, de acordo com as mais recentes recomendações internacionais³⁰. Comece aplicando alguns pulsos únicos a 30% da saída máxima do estimulador (%MSO) e verifique se a estimulação produz uma PEmáx registrada pelo sistema EMG e exibida na tela do computador conectado ao sistema de aquisição de dados.
      1. Se não houver respostas visíveis, aumente gradualmente a intensidade da estimulação (incrementos de 5% da MSO) até que os PEmáx sejam observados. Em seguida, teste quatro pontos ao redor do primeiro local, entregando vários pulsos. Determinar a amplitude média pico-a-pico da PEmáx para cada local.
      2. Selecione o local onde a amplitude média pico-a-pico da PEmáx é a mais alta. Esta é a chamada localização do hotspot para o participante³⁰. Marque a localização da bobina_M1 na tampa para garantir a colocação adequada da bobina durante todo o experimento.
4. Limiar motor de repouso (rMT) e intensidades de EMT
   1. Determinar o limiar motor de repouso (rMT) definido como a intensidade da EMT que produz 50% de probabilidade de eliciar uma^{PEmáx 23,30}.
      1. Utilizar o freeware online disponível (TMS Motor Threshold Assessment Tool, MTAT 2.1), que se baseia na estimação de parâmetros de máxima verossimilhança utilizando uma estratégia de teste sequencial²⁹. A sequência de estimulação inicia-se sempre com a intensidade fixada em 37 %MSO.
      2. Deixe um experimentador segurar a bobina_M1 enquanto outro indica se a amplitude da PEmáx está > 0,05 mV. O algoritmo preditivo determina, então, a próxima intensidade de estimulação a ser aplicada e é interrompido após 20 estimulações, o que fornece acurácia suficiente para a estimativa da rMT de acordo com estudos prévios^31-34.
   2. Defina o %MSO para o condicionamento e a estimulação do pulso de teste. Use o valor de rMT previamente determinado do participante.
      OBS: Aqui, a intensidade para a primeira estimulação do condicionamento (_DLPFC da bobina) foi ajustada para 110% da rMT^19,20. A intensidade da estimulação do teste (bobina_M1) foi fixada em 120% da rMT, intensidade ligeiramente diferente de estudos anteriores que utilizaram uma intensidade de ST que evocou uma PEmáx de ~1 mV em todos os participantes^19,20 . Essa intensidade fixa pico-a-pico ocorre em pontos muito diferentes nas curvas de recrutamento de insumo-produto devido à alta variabilidade intersujeitos na saída motora³⁵. Portanto, a intensidade da estimulação poderia ser otimizada usando 120% da intensidade do TMR entre os indivíduos.
5. Posicionamento_DLPFC da bobina TMS
   1. Conecte esta bobina ao estimulador B (Figura 1).
   2. Utilizar a heurística do couro cabeludo recentemente atualizada para localizar a região do couro cabeludo correspondente ao CPFDL esquerdo^36,37 para estimar a posição da segunda bobina de oito pequenos números (diâmetro interno: 40 mm) sobre o CPFDL (_DLPFC da bobina). Baixe a Ferramenta de Cálculo de Planilha Excel³⁶ online e insira as distâncias nasion-inion e tragus-tragus e o perímetro cefálico em centímetros como entradas. Relate as distâncias X_LA e Y_LA diretamente na cabeça do participante.
   3. Colocar tangencialmente ao couro cabeludo o_CPFDL da bobina sobre a suposta localização do CPFDL esquerdo, com a alça apontada para baixo e lateralmente em um ângulo de -45° em relação à linha sagital média. Marque a colocação do_DLPFC da bobina na tampa para garantir a colocação adequada da bobina durante todo o experimento.
      NOTA: Este método de segmentação baseado em couro cabeludo para os locais_{de DLPFC} da bobina_M1 e da bobina não é o ideal. De fato, sabe-se que é menos preciso do que o método de neuronavegação usado para atingir as áreas de interesse cerebrais com base na ressonância magnética (RM) anatômica T1 ^individual38.
6. Atraso entre os pulsos de condicionamento e teste: Ajuste esse atraso para 10 ms no dispositivo gerador de pulsos.
   OBS: Aqui, o atraso é fixado em 10 ms com base em estudos prévios que mostram uma influência inibitória do CPFDL esquerdo para o M1 esquerdo nesse intervalo^19,20. Esse efeito inibitório observado em 10 ms provavelmente se deve à ativação dos gânglios da base via projeções do CPFDL para a pré-AME, exercendo assim uma influência indireta sobre M1³⁹. O atraso pode ser ajustado no código de acordo com as necessidades do usuário. Por exemplo, um intervalo de interestimulação mais longo (isto é, 25 ms) poderia ser usado para investigar circuitos córtico-subcorticais-corticais indiretos polissinápticos conectando o CPFDL a M1¹⁹. Além disso, influências diferenciais facilitatórias/inibitórias têm sido demonstradas usando ppTMS de duplo sítio entre múltiplas áreas corticais, com intervalos variando de 1 ms a 150 ms^40,41. Assim, o fato de o intervalo poder ser ajustado abre caminho para um amplo leque de possibilidades para futuras pesquisas.
7. Configurações do olfatômetro
   1. Selecione odorantes com valores hedônicos agradáveis e desagradáveis. Diluir antecipadamente os odorantes individualmente em óleo mineral para criar percepção iso-intensa.
      NOTA: Aqui, a seleção e a concentração de odorantes (isto é, acetato de isoamila e ácido butírico diluídos em concentrações de 0,6% e 0,11% vol/vol, respectivamente) foram baseadas em estudos anteriores de nosso grupo utilizando o mesmo arranjo olfométrico e odorantes ^42,43. Um estudo piloto confirma que os odores positivos e negativos não diferiram em termos de intensidade, mas foram opostos em valor hedônico. Na condição de controle (ou seja, sem odorante), apenas o fluxo de ar é entregue ao participante.
   2. Escreva o código para entregar os odorantes. Para cada ensaio, indicar a duração total do ensaio, o odorante a ser administrado, a taxa de fluxo do controlador odorante (em mililitros por minuto), a taxa de fluxo do regulador de ar transportador (em mililitros por minuto) e a taxa de fluxo do regulador de sucção.
      OBS: A ordem do odorante entregue pode ser aleatória entre positivo, negativo e sem odor. Aqui, cada ensaio tem uma duração de 12 s. A ordem de entrega dos odores foi pseudo-randomizada. Além disso, com base em um experimento piloto, a taxa de fluxo do controlador de odor foi ajustada para 200 mL/min, a taxa de fluxo do regulador de ar transportador em 500 mL/min e a taxa de fluxo do regulador de sucção em 100 mL/min.
   3. Posicionar a cânula nasal próximo às narinas do participante para mensuração da respiração nasal. Instruir o participante a respirar normalmente pelo nariz.
   4. Ligue o compressor de ar portátil, a caixa do olfatômetro e o PC que contém o software. Verifique todas as conexões do cabo (Figura 1).
      NOTA: O olfatômetro usado no presente estudo foi descrito em detalhes em uma publicação anterior⁴⁴ , mas foi modificado aqui para permitir o disparo da EMT com atrasos variáveis após a detecção do início da inspiração. Resumidamente, o dispositivo é composto por vários módulos, incluindo 1) uma fonte de ar e um sistema de tratamento de ar provenientes de um compressor de ar portátil, 2) um sistema de estimulação incluindo dispositivos eletrônicos e pneumáticos, 3) uma cabeça de mistura caseira acoplada a um sistema de liberação que permite a difusão de odorantes no nariz do participante, 4) um sistema sensorial respiratório que aciona o olfatômetro de acordo com a medida da respiração nasal com uma cânula nasal e 5) um software sistema de controle⁴⁴.
   5. Calibração: Proceder à fase de calibração (cerca de 20 s.), que permite calibrar o sinal respiratório do participante e ajustar os limiares de detecção das fases expiratória e inspiratória. Nesse software, a fase expiratória é positiva e a fase inspiratória é negativa.
   6. Classificações de odor hedônico e intensidade: Entregue os dois odorantes em uma ordem aleatória e peça aos participantes que classifiquem o valor hedônico e a intensidade de cada odorante em escalas analógicas visuais que variam de 1 "nada agradável" a 9 "extremamente agradável" e de 1 "nada intenso" a "extremamente intenso".
8. Combinando olfatômetro e EMT: Defina o atraso entre a detecção da fase de inspiração e o gatilho para o envio da EMT em 600 ms.
   NOTA: O ajuste do atraso é importante e deve ser determinado de acordo com a literatura e as necessidades do usuário. Nesse protocolo, o atraso foi fixado em 600 ms, que tem se mostrado a máxima representação perceptiva consciente dos odores⁴⁵. Para a condição de EMT de pulso único, esse gatilho ativa imediatamente o estimulador A, e um pulso é liberado pela bobina posicionada no M1 esquerdo para evocar uma PEmáx não condicionada. Para a condição de EMT de bobina dupla, este gatilho é enviado para dois dispositivos diferentes (através de dois cabos coaxiais conectados por uma conexão T): o primeiro ativa imediatamente o estimulador B e um pulso de condicionamento é liberado pela bobina posicionada no DLPFC esquerdo; o segundo é recebido por um gerador de pulsos que permite induzir um atraso fixo antes de acionar o estimulador A, liberando assim um teste-estimulação através da bobina posicionada em M1 esquerda para evocar uma PEmáx condicionada (Figura 1).

Figura 1: Montagem experimental. As linhas em negrito representam conexões pneumáticas. Um compressor de ar é conectado ao olfatômetro para gerar diferentes fluxos de ar. Um regulador controla a pressão, e o fluxo de ar de entrada é direcionado para 3 canais (através de 3 reguladores de massa): um para o transportador de ar (linha azul), um para o sistema de aspiração (linha marrom) para limpar e ajudar a controlar o tempo de estimulação e o último para os odorantes⁴⁴. Dois tubos em forma de U contêm os odorantes (verde: agradável; vermelho: desagradável) nos quais são condicionados sob pressão no estado de vapor saturado, garantindo um fluxo de ar odorizado com intensidade estável ao longo do tempo. A cabeça de mistura é usada para misturar as correntes de ar limpas e odorizadas. O fluxo de ar (odorizado ou puro) é entregue às narinas através de dois tubos (linhas cinzas) ligados a uma cânula nasal, que também é usada para registrar a respiração nasal (linha roxa). Com base no sinal respiratório, assim que a fase de inspiração é detectada, para a condição de EMTp um gatilho é enviado para um dispositivo gerador de pulsos usado para definir um atraso (aqui: 10 ms), em seguida, para um estimulador de EMT A conectado à bobina_M1 aplicado sobre a representação muscular da mão M1 esquerda, enquanto o estimulador B da EMT é desligado. Para a condição dsTMS, um gatilho é imediatamente enviado para o estimulador B da EMT conectado ao_DLPFC da bobina aplicado sobre a DLPFC esquerda, e o dispositivo gerador de pulsos é usado para definir um atraso (aqui: 10 ms) antes de acionar o estimulador de EMT A conectado à bobina_M1. O sinal respiratório e a amplitude da PEmáx adquiridos pelo sistema EMG são registrados por um software instalado em um computador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Medições

1. Execute o script de codificação personalizado no software olfatômetro (consulte a etapa 2.7.2) para fornecer todas as combinações de spTMS e dsTMS com odores agradáveis e desagradáveis e sem odores ocorrendo em uma ordem aleatória.
   NOTA: Aqui, 20 ensaios foram registrados para cada condição (120 ensaios no total). O experimento foi dividido em 6 blocos de 20 ensaios cada. O número de testes para cada condição pode ser alterado de acordo com as necessidades do usuário.

4. Análise dos dados

1. Para cada participante, condição e ensaio, extraia a amplitude pico a pico da PEmáx. Isso pode ser feito usando uma das caixas de ferramentas de código aberto disponíveis on-line^46,47.
2. Normalizar os dados calculando uma razão PEmáx expressando PEmáx eliciada pela estimulação do teste em ensaios de EMTd em relação às PEmáx eliciadas pela estimulação do teste em ensaios de^{EMTp 12}. Faça isso separadamente para cada participante e para cada condição de odor (ou seja, sem odor, odor positivo e odor negativo). Após esse procedimento, interprete os resultados da seguinte forma: razões de PEmáx acima de 1 indicam uma influência facilitatória do CPFDL sobre M1, enquanto razões de PEmáx abaixo de 1 indicam uma influência inibitória do CPFDL sobre M1.

Resultados

Os dados representativos aqui apresentados refletem gravações dos participantes após o preenchimento do protocolo passo-a-passo acima para fornecer uma visão preliminar sobre o que poderíamos esperar.

A Figura 2 mostra um exemplo de sinais respiratórios representativos de um participante registrados com o software olfatômetro. As fases expiratória e inspiratória são bem detectadas quando os limiares são ultrapassados. O odorante é acionado imediatament...

Discussão

O protocolo acima descreve um novo método combinando o uso de um olfatômetro sincronizado com respiração sincronizada com EMT de bobina única e dupla para investigar mudanças na excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva dependendo do valor hedônico dos odorantes. Esta configuração permitirá discriminar objetivamente o valor de agradabilidade de um odorante em um determinado participante, indicando o impacto biológico do odorante na conectividade e reatividade efetiva do cérebro. As etapas crític...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition board (8 channels)	National Instrument	NI USB-6009
Air compressor	Jun-Air	Model6-15
Alcohol prep pads	Any
Butyric acid	Sigma-Aldrich	B103500	Negative odorant
Desktop computer	Dell	Latitude 3520
EMG system	Biopac System	MP150
Isoamyl acetate	Sigma-Aldrich	W205508	Positive odorant
Nasal cannula	SEBAC France	O1320
Programmable pulse generator	A.M.P.I	Master-8
Surface electrodes	Kendall Medi-trace	FS327
TMS coil (X2)	MagStim	D40 Alpha B.I. coil
TMS machine	MagStim	Bistim2
Tube 6 mm x 20 m	Radiospare	686-2671	Pneumatic connection
USB-RS232	Radiospare	687-7806
U-shaped tubes	VS technologies	VS110115