1. Chorume de Gel de Sílica

1. Despeje o gel de sílica em um frasco de Erlenmeyer. O peso do material de embalagem deve ser aproximadamente 50x o da amostra que está sendo separada. Se os compostos separados tiverem valores R_f muito semelhantes, então pode exigir o uso de uma quantidade maior de sílica por amostra, o que é o caso neste exemplo.
   1. Coloque 10 g de sílica no frasco de Erlenmeyer, uma vez que 50 mg de amostra (45 mg de fluorenona e 5 mg de tetrafenilaporfirina) estão sendo isolados.
2. Adicione o sistema solvente (hexano/diclorometano, 70%: 30%) ao frasco de Erlenmeyer contendo o gel de sílica. Adicione solvente suficiente para garantir que todo o gel de sílica esteja bem solvado. A sílica não se dissolverá, mas a mistura será visualmente perceptível quando solvated. Uma vez que o solvente tenha sido adicionado redemoinho o frasco de Erlenmeyer para garantir que toda a sílica esteja bem solvada.

2. Preparação da Coluna

1. Selecione a coluna de tamanho apropriado. Normalmente, a coluna deve ser preenchida a meio caminho com chorume de gel de sílica. Quanto maior a amostra ser purificada, maior a coluna necessária.
2. Conecte a parte inferior da coluna com um pedaço de lã de vidro. Usando uma haste longa, certifique-se de que a lã está firmemente alojada na parte inferior da coluna logo acima da torneira.
3. Uma vez que a lã esteja firmemente no lugar, aplique uma fina camada de areia sobre a lã de vidro.
   Nota: Se a coluna estiver equipada com um frit de vidro acima da torneira, este passo deve ser omitido.
4. Fixar a coluna na posição vertical em um suporte de anel.
5. Usando um funil, despeje delicadamente o chorume preparado de gel de sílica na coluna. Você pode precisar adicionar solvente adicional para transferir o chorume do frasco de Erlenmeyer para a coluna. Usando uma pipeta, lave qualquer gel de sílica que grude nas laterais da coluna.
   1. Como o gel de sílica está se estabelecendo na coluna, toque suavemente nas laterais da coluna para garantir que o gel de sílica embale firmemente e exclua quaisquer bolhas de ar.
6. Abra a torneira e deixe o solvente drenar em um frasco erlenmeyer limpo até pouco antes do gel de sílica e do solvente dianteiro se encontrarem. O gel de sílica nunca deve secar até que o procedimento esteja concluído.
7. Coloque uma fina camada de areia em cima do gel de sílica(Figura 1). Usando uma pipeta, lave qualquer areia que possa ter grudado nas laterais da coluna.
8. Escorra qualquer solvente adicional até que a areia esteja seca, mas não até a camada de gel de sílica.

Figura 1. A configuração adequada para um experimento de cromatografia de coluna antes da adição da amostra.

3. Adicionar a amostra à coluna

1. Dissolva a amostra na menor quantidade de solvente possível (usando o mesmo solvente que foi usado para fazer o chorume de gel de sílica).
2. Com uma pipeta, adicione suavemente a amostra na parte superior da coluna.
3. Uma vez que a amostra tenha sido aplicada na parte superior da coluna, abra a torneira e deixe o solvente drenar através da camada de areia, mas não a camada de gel de sílica. Use uma quantidade muito pequena de solvente para lavar qualquer amostra que possa ter se agarrado aos lados da coluna. Escorra este solvente adicional através da camada de areia também.

4. Eluting the Sample through the Column

1. Usando uma pipeta, adicione suavemente 4-5 mL de solvente de tal forma que não perturbe a camada de areia.
2. Coloque um funil na parte superior da coluna e encha delicadamente o restante da coluna com solvente.
3. Abra a torneira e deixe o solvente drenar pela coluna.
4. Comece a coletar a fase móvel à medida que ela escorre da coluna para tubos de ensaio.
   1. Os tubos de ensaio devem ser colocados em um rack de tubo de ensaio de forma sequencial.
5. Adicione solvente adicional à parte superior da coluna, conforme necessário, até que todos os compostos desejados tenham eluvado da coluna.

5. Recuperando os Constituintes

1. Se os compostos são coloridos, então eles podem ser identificados visualmente. No entanto, se os compostos estiverem incolores, eles terão que ser identificados usando luz ulta-visível (UV) (se os compostos contêm conjugação) ou com a mancha apropriada. A pureza dos compostos pode ser verificada usando cromatografia de camada fina.
2. Identifique os tubos de ensaio que contêm os compostos desejados.
3. Mescle todas as frações que contêm os compostos isolados desejados em um frasco de fundo redondo (RB) pré-pesado. Faça isso por cada composto que está isolado.
4. Evaporar o solvente colocando o frasco DE RB no evaporador rotativo.
5. Uma vez que todo o solvente tenha sido removido, pese o RB com o produto seco e subtraia o peso inicial do RB para obter um rendimento.